フィターセ 高生産植物を家畜用飼料に添加する場合の効果と数値目標 2. 序論 太陽エネルギー有効利用による物質生産フィターセ 高生産植物 ( 作物収穫後に廃棄される部分 ) リン鉱石 リン資源の節減環境富栄養化の抑制 * フィターゼ 1U : 37 p5.5 において 1 分間にフィチン酸から 1μ

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1 - 植物機能改変技術実用化開発 - 第 1 回 植物機能改変技術実用化開発 ( 中間評価 ) 分科会 資料 6-6 公開 タンパク質組織特異的高生産植物の研究開発 - 三井化学株式会社 - 平成 16 年 1 月 28 日 Mitsui Chemicals, Inc., 1 目的 1. 目的目的 意義 : 事業原簿 67 頁 目的 省エネルキ ー 低環境負荷型の物質生産形態である分子農業 ( 植物工場 ) に基づき これまで有効利用されずに廃棄される植物組織に工業用酵素 ( フィターセ ) を安定的に蓄積する技術を確立する フィチン酸分解酵素 : フィターゼ 単胃家畜用飼料添加剤飼料添加剤として利用 フィターセ : フィチン酸を加水分解し リン酸を遊離させる酵素 OPO 3 2 OPO 3 2 O O 2 PO 3 O OPO 3 2 OPO 3 2 O O O 6 3 PO 4 フィチン酸 OPO 3 2 イノシトール O 6 リン酸 Mitsui Chemicals, Inc., 2

2 フィターセ 高生産植物を家畜用飼料に添加する場合の効果と数値目標 2. 序論 太陽エネルギー有効利用による物質生産フィターセ 高生産植物 ( 作物収穫後に廃棄される部分 ) リン鉱石 リン資源の節減環境富栄養化の抑制 * フィターゼ 1U : 37 p5.5 において 1 分間にフィチン酸から 1μmol のリン酸を生成する力 フィターセ 添加の効果が期待される活性値は 5 U * / 飼料 ( 多量のフィチン酸含有 ) 1kg 現行飼料 9g あたり g の添加を想定して目標値を次のように設定 phytin-p フィターセ P P リン排出減少減少 5 U / フィターセ 生産植物 g フィチン酸の分解によるリンやミネラルの吸収促進 Mitsui Chemicals, Inc., 3 研究開発のアプローチ 2. 序論 フィターゼ遺伝子 遺伝子の選定酵母由来フィターセ ( 三井化学特開平 ) 植物由来酸性フォスファターセ ( 三井化学特開平 ), フィターセ ( 北大 院 農 ) < 植物材料 > 1シロイヌナス ナ 2イネ 3サツマイモ 組織特異的高発現技術 安定蓄積技術 サツマイモ形質転換系 組織特異的フ ロモーターの利用 (Cabフ ロモーター: 三井化学特 2845) 高発現ツールの利用 ( 奈良先大 ) 蓄積部位の選定 形質転換体の作成ヘ ニアス マ高系 14 号 ( 石川県農短大 ) 飼料添加剤 実証試験 飼料添加による効果確認 サイレーシ 化試験の実施 ( 山形大 農 ) フィターセ 高生産植物の開発 ( 目標 :5U/g-FW) Mitsui Chemicals, Inc., 4

3 遺伝子の種類 初期のヘ クター導入後の活性変化 ( 下図 ) と LASAP2 の組織特異的な発現 ( 右図 ) フィチン酸分解活性を有する 2 つの酵素に着目 ( 特許は当社出願 ) ルーヒ ン ( マメ科 ) 由来酸性フォスファターゼ (LASAP2) 酵母 (Schwanniomyces occidentalis) 由来フィターゼ フ ロモーター P-ubi (maize, ubiqutin) P-Cab (rice) cdna LASAP2 (1.5kb) 酵母フィターゼ (1.4kb) イネへ導入 LASAP2 導入時 活性上昇確認 T-nos ただし <.5U/g-FW( 生重量 ) で目標の 1/1 未満 酵母フィターセ は上記ヘ クターでは活性上昇なし Phytase activity (mu/mg of protein) kda 成果成果 : 事業原簿 69 頁 ~72 頁 < フィターセ 活性 > P-Ubi -LASAP2 P-Cab Cab-LASAP2 Leaves Roots Seeds 緑葉根玄米 < ウェスタン解析 > Cab フ ロモーターの利用により 緑葉部特異的に目的タンハ ク質を生産させることが可能 Mitsui Chemicals, Inc., 5 目標値 (5 U/g-FW FW) を達成するためには? 3-2. 成果 酸性フォスファターセ (LASAP2) 基質特異性が低い温度安定性 : 5 5 組換えイネで活性を検出 ( ただし 目標の 1/1 未満 ) 酵母フィターゼ基質特異性が高い温度安定性 : 7 7 活性を確認できず LASAP2 の細胞内蓄積部位の選定 各種移行シグナル配列の付加 酵母フィターゼの発現条件の検討 コドンの改変 細胞間隙への移行シグナルの付加 フィターゼ高生産植物の作出 Mitsui Chemicals, Inc., 6

4 酵母フィターゼ高発現用コンストラクト高発現用コンストラクトの構築 P-ubi P-35S P-cab P-cab +5 UTR T-nos Cht3- 酵母 ( 改変 )phy ) (full) MRALALAVVAMAVVAVRG + M + VSISKLINNGLLLAGQSVYQDLA DLA Cht3- 酵母 ( 改変 )phy ) (short) MRALALAVVAMAVVAVRG + M + QSVYQDLA 15 アミノ酸除去局在性予測プログラム PSORT を用いた予測データを考慮 コドン改変の主な目的 1 遺伝子発現効率 ( 特に翻訳効率 ) の上昇 2poly(A) 付加シク ナルとして誤認識される配列の除去 酵母フィターセのコドン使用頻度 (%) 酵母フィターセのコドン使用頻度 (%) 12 2 TTA ATG-Met TGG-Trp TTA イネの全 CDSによるコドン使用頻度 (%) ATG-Met TGG-Trp コドン改変前 コドン改変後 2 12 イネの全 CDSによるコドン使用頻度 (%) 3-2. 成果 Mitsui Chemicals, Inc., 7 フィターゼ高発現シロイヌナズナのスクリーニング 3-2. 成果シク ナル配列 *1 遺伝子 (cdna) *2 活性 (U/gFW) 活性 (U/gFW) WT 35S-cht 改変 f 35S-cht 改変 s pbi-1 35S 系 Cab-cht 改変 f CabUTR-cht 改変 f CabUTR -cht 改変 s Cab 系 Cab-UTR 系赤線 : WT ( ) & pbi-1 (vector 部分のみ導入イネ ) の平均 (.93 ( U/gFW gfw) イネキチナーセ の細胞外分泌シク ナルとコト ン改変型酵母フィターセ の組合せが高発現化に有効 1* cht: イネ キチナーセ 由来 rbc: イネ rbcs 由来 α: オオムキ, α-アミラーセ 由来 2* cht- 酵母 f 酵母 f cht- 酵母 s 酵母 s cht- 改変 f 改変 f cht- 改変 s 改変 s LASAP2 rbc-lasap LASAP2m α -LASAP2m cht-lasap LASAP2m LASAP2m LASAP3 Anphy 酵母 : 酵母フィターセ ( オリシ ナル ) 改変 : コト ン改変酵母フィターセ f: 全長 ORF, s: N 末 15aa 除去 m: N 末 34aa 残基除去 Anphy: A.niger 由来フィターセ Mitsui Chemicals, Inc., 8

5 酵母フィターゼ導入イネのフィターゼ活性 (LASAP2 導入イネとの比較 ) 12. LASAP2 導入イネ酵母フィターゼ導入イネ phytase activity (U/g-FW FW) 目標値 :5 U/g-FW.461 U/g-FW 1.6 U/g-FW. Ubi LASAP2 Cab LASAP2 改変前改変後 full 改変前 short 改変後 P-Cab (rice) T-nos <P-Cab :: cht3-ss :: 改変 Phy> のイネへの導入により 目標値を上回るフィターゼ活性を達成 Mitsui Chemicals, Inc., 9 イネで発現させた酵母フィターセ の生化学的特徴 脱糖鎖解析 < 脱糖鎖処理 > kda 7 5 酵母標品イネ発現型 N-Glycosidase F * TFMS * < ウェスタン解析 > ( 抗体 : 酵母フィターセ ) イネ発現型酵母フィターセ は酵母標品よりも糖鎖修飾レヘ ルが低い 52kDa *3 1*:N- 結合型糖鎖を酵素的に切断 2*:N- 結合型 O- 結合型の糖鎖を化学的に切断 3*: 酵母フィターセ のAA 配列から推定されるサイス 至適温度 相対活性 (%) 相対活性 (%) 12 2 至適 p 12 2 温度 ( ) 2 標品 イネ発現型 p イネ発現型酵母フィターセ の至適温度 至適 p は標品と同じ (7 p4.5) Mitsui Chemicals, Inc., 1

6 イネで発現させた酵母フィターセ の安定性評価 短期温度安定性 各温度にて 15min 処理 37 にて活性測定 相対活性 (%) 温度 ( ) 標品 イネ発現型 イネ発現型酵母フィターゼは標品に比べると 7 付近でわずかに安定性が高い 長期保存安定性 イネ粗抽出液中のフィターセ 活性 12 相対活性 (%) イネ粗抽出液中の可溶性タンハ ク質の安定性 12 4 静置 25 静置 37 静置 5 静置 相対量 (%) 静置時間 ( 週間 ) 2 M 静置時間 ( 週間 ) イネ粗抽出液中においても非常に安定 Mitsui Chemicals, Inc., 11 M 形質転換イネ緑葉を飼料に 1% 混合した時の飼料中フィチンの分解効果 形質転換イネ 実験手順 緑葉.2g 飼料.18g 組成 重量比 ( フィチンP/ 全 P) トウモロコシ種子 75% (66%) 大豆粕 24% (47%) 米糠 1% (74%) 反応液 1ml(p5.5) インキュヘ ーション (37 ) 遊離リン酸定量 標品添加 遊離リン量 (μmol) 形質転換イネ 512U * 相当 /kg 飼料 標品 U * /kg 飼料 標品 5U * /kg 飼料 時間 (min) * フィチン酸ナトリウムを基質とした場合のフィターセ 活性 全フィチン P の 41% 遊離 標品 U * /kg 飼料 イネ発現型酵母フィターセ は 飼料に含まれるフィチンを分解する能力あり Mitsui Chemicals, Inc., 12

7 形質転換イネのサイレージ化に伴うフィターゼの安定性 サイレージ化 ; 青刈りした作物を発酵させ飼料化 生成した乳酸などにより腐敗菌やタンパク質分解菌の活動が抑えられ 飼料の長期貯蔵が可能 発酵で生じた有機酸が 家畜の重要な栄養源になり またその香りから食欲を増進 サイレージ化の実験手順出穂前のイネの茎葉部 2mm 以下に切断埋蔵 ( 遮光した試験管に密封 ) 2 貯蔵開封し フィターセ 活性測定 フィターセ 相対活性 ( 処理前の活性 =) 埋蔵期間 ( 週間 ) イネ発現型酵母フィターゼはサイレージ処理においても非常に安定 Mitsui Chemicals, Inc., 13 成果のまとめ 3-4. まとめ イネ由来 Cab プロモーターの使用により 茎葉部特異的な発現に成功した 細胞外分泌シグナル配列とコドン改変型酵母フィターセ の組合せがフィターゼの高発現化に有効であることを確認した イネにおいてフィターセ の高生産化に成功 ( 最高 1.6U/ U/g-FW 対照比 273 倍 ) < 数値目標達成 > イネで生産させたフィターゼは世界トッフ レヘ ル 酵母標品に比べて糖鎖修飾レヘ ルは低いが至適温度 至適 pは同じ 7 付近の短時間の熱処理において標品以上の安定性有り フィターセ 発現イネを飼料に 1% 混合時 飼料中のフィチン酸分解において in vitro 活性値以上の効果有り 高い実用性 緑葉抽出液中 及びサイレージの過程でも極めて安定 茎葉切片を材料としたサツマイモの高効率の形質転換系を確立した 達成度 % Mitsui Chemicals, Inc., 14

8 事業化 実用化の見通し 4. 見通し事業化の見通し : 事業原簿 73 頁 植物によるフィターセ 生産法の長所 1 工場建設費などの初期投資が不要 ( コスト削減に寄与 ) 2 化石資源由来のエネルキ ーに依存しない物質生産 ( 省エネ 環境負荷低減に寄与 ) 3 食用にされない不用部位での生産であれば 食用部とフィターセ 生産部位を分けて収穫可能 ( 製造工程簡略化 コスト削減に寄与 ) 4フィターセ 生産植物をそのまま 又はサイレージ化して長期保存後 飼料へ添加可能であり 微生物法での生産 抽出 精製などの複雑な工程が不要 ( 製造工程簡略化 コスト削減に寄与 ) 植物によるフィターセ 生産法の実用化の可能性はあり Mitsui Chemicals, Inc., 15 今後の課題 展開 5. 課題 展開 Ⅰ. フィターセ 生産植物の単胃家畜への給餌試験によるフィターセ の効果確認 Ⅱ. サツマイモを含む適用可能植物の拡大 普遍化 ( フィターセ 遺伝子 宿主植物 ツールの最適化 ) Ⅲ. Ⅳ. 組換え植物としての安全性評価 ( 周囲の環境への影響 ) 組換え飼料としての安全性評価 Mitsui Chemicals, Inc., 16

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