定量的標的プロテオミクスによる血中タンパク質の病態変動解析に基づく膵臓癌早期診断法の開発 ( 要約 ) 東北大学大学院薬学研究科生命薬科学専攻米山敏広

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ひさともしもとり
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2 定量的標的プロテオミクスによる血中タンパク質の病態変動解析に基づく膵臓癌早期診断法の開発 ( 要約 ) 東北大学大学院薬学研究科生命薬科学専攻米山敏広

3 1. 目的膵臓癌は 5 年生存率が 6% と癌全体の 5 年生存率 68% に比べて極めて予後が悪い癌である (Siegel et al., 2014) この原因は膵臓癌は初期症状に乏しいことに加え既存の膵臓癌マーカーである carbohydrate antigen 19-9 (CA19-9) は膵臓癌を早期診断できないためである (Ballehaninna and Chamberlain, 2011) よって膵臓癌の予後を改善するためには i) 新規の早期膵臓癌マーカー同定および ii) 膵管内乳頭粘液性腫瘍 (intraductal papippary mucinous neoplasm, IPMN) や慢性膵炎などの膵臓癌を発症する前のリスク疾患に対するリスクマーカー同定は最重要課題である (Chang et al., 2014) 近年国立がん研究センターの山田博士らによって 24 種の血中タンパク質が早期膵臓癌マーカー候補として同定されたこれらの候補タンパク質は病態への変化に伴い量的変化だけではなく修飾断片化複合体形成など質的変化を起こす可能性があり量的質的観点からマーカーとしての有用性評価を評価することが重要であるサンドイッチ ELISA 法によるマーカー評価が最も一般的であるがタンパク質に対する特異的モノクローナル抗体 ( 特に質的変化を認識する抗体 ) の作成の成功確立は低く定量法開発に比較的時間がかかることがボトルネックであった本研究室で開発した liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC- MS/MS) を用いた定量的標的プロテオミクスはタンパク質の質的変化を含めた定量法を短期間で確立可能であるため上記課題を明らかとするためには有用であるその一方でサンプルの前処理や LC での分離に時間がかかるため throughput 性が低いことが臨床応用に向けての課題であったそこで本研究では定量的標的プロテオミクスに基づく high-throughput 定量法を開発し量的質的観点から早期膵臓癌で陽性を示すマーカーを明らかにすることを目的とした 1

4 2. 方法自動前処理ロボットを用いて血漿をトリプシン消化しタンパク質定量は LC- MS/MS もしくは MALDI-MS/MS を用いたサンプル濃縮には特異抗体を用いた免疫沈降を用いた MALDI-MS/MS 測定時には α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) をマトリックスとして解析を行った本研究の臨床検体を用いた実験は東北大学薬学研究科および国立がん研究センターの双方の倫理委員会の承認を受けて行った 3. 結果考察水酸化修飾 α-fibrinogen の膵臓癌マーカーとしての評価 2-Dimensional Image Converted Analysis of LCMS を用いて同定された膵臓癌マーカー候補である水酸化修飾 α-fibrinogen (Ono et al., 2009) について非修飾ペプチドおよび水酸化修飾ペプチドを用いて検量線を作成した結果 fmol の範囲で検量線に直線性 (r 2 >0.99) が得られたサンプル前処理を自動化するため自動前処理ロボットを用いて 1 日に 192 サンプルの血漿前処理を行う手法を構築した同一血漿を前処理し α-fibrinogen の定量を行った結果ばらつきとして 8.4% (%coefficient of variation (CV), n=40) の高精度な定量技術を実現した水酸化修飾 α- fibrinogen の膵臓癌マーカーとしての評価を行うため膵臓癌患者 70 例および健常者 27 例の血漿について定量解析を行ったその結果水酸化修飾 α-fibrinogen は Stage I/II の早期膵臓癌患者において有意に上昇していることが明らかとなった Receiver operating characteristic (ROC) 解析の結果から診断の基準値を算出し主要な膵臓癌マーカーとの比較を行った CA19-9 に陰性な Stage I/II の早期患者 8 例に 2

5 対しては carcinoembryonic antigen (CEA) が 1 例のみで陽性となり Duke pancreatic monoclonal antibody type-2 (DUPAN-2) は全ての検体で陰性であった一方で水酸化修飾 α-fibrinogen は 6 例で陽性を示したよって水酸化修飾 α-fibrinogen は CA19-9 に陰性な早期膵臓癌診断に有用なマーカーであることが示唆された 23 種の膵臓癌マーカー候補分子のマーカーとしての評価逆相タンパク質アレイを用いて同定された膵臓癌マーカー候補 23 分子 (Honda, Kazufumi, personal communication) および膵臓癌リスク関連 6 分子の内非濃縮血漿で検出可能な Adiponectin, Complement C2a (C2a), C2b, C-reactive protein (CRP), insulin-like growth factor-binding protein (IGFBP)2, IGFBP3 について micro LC-MS/MS を用いた highthroughput 定量法 (10 min/run) を確立したこれら 6 分子について Stage I/II 早期膵臓癌患者 38 例および健常者 65 例の定量解析を行ったその結果 IGFBP2 および IGFBP3 が健常者に比べ早期膵臓癌患者において有意に変動していたこれらのマーカーの膵臓癌患者に対する陽性率は CA19-9 に比べても高く有力な早期膵臓癌マーカーとして絞り込んだまた IGFBP2 は従来の膵臓癌マーカーでは診断できない IPMN や慢性膵炎などの膵臓癌発症リスクが極めて高い疾患においても健常者に比べて有意に上昇していたさらに IGFBP2 は胃癌胆道癌肝細胞癌大腸癌十二指腸癌においても上昇しておりこれらの癌に対する診断への有効性も示唆された IGFBP2, 3 と CA19-9 の組み合わせによる膵臓癌診断の有効性を検証するため多変量ロジスティック回帰に基づく診断式を構築し ROC 解析を行ったその結果診断式による AUC は有意に CA19-9 の Area Under the Curve (AUC) を押し上げた式の作成に関与しない健常者 38 例および膵臓癌患者 101 例の定量解析結果を用いて診断式の評価を行っても同様に有意に CA19-9 の AUC を押し上 3

6 げたよって IGFBP2 および IGFBP3 を CA19-9 と組み合わせることでリスク疾患を含めた早期膵臓癌患者の包括的診断が可能になると示唆された IGFBP2 および IGFBP3 の発症前検体の診断に対する有効性を検証するため多目的コホート研究の約 20 年間の追跡調査期間中に膵臓癌を発症した患者 170 例および対照 340 例の膵臓癌発症前検体の定量解析を行ったその結果採血から膵臓癌の診断までの期間が短期間 (7 年以内 ) の患者群は対照群に比べて IGFBP2 および IGFBP3 がそれぞれ高値低値を示したよって IGFBP2 および IGFBP3 は発症前の検体に対する診断にも有効である可能性が示された IGFBP2, 3 の膵臓癌への病態変化に伴う質的変化の解析量的な観点から有力な膵臓癌マーカーとして同定した IGFBP2 および IGFBP3 について IGFBP2 および IGFBP3 の安定同位元素標識タンパク質を合成し IGFBP2 および IGFBP3 の N 末から C 末の定量が可能なトリプシン消化ペプチドについて定量を行うことで修飾や断片化を含めた質的変化のマーカーとしての有用性を検討した IGFBP3 に関しては血中で他のタンパク質と複合体を形成すると報告されているため膵臓癌への病態変化に伴う IGFBP3 の複合体形成効果も解析した健常者 38 例および早期膵臓癌患者 23 例について定量を行った結果 IGFBP2 は定量した全ての配列において ROC 解析の AUC は同等であったことからマーカーとしての有用性に部位差は存在しないことが示唆された一方で IGFBP3 は複合体量を分別定量することが早期膵臓癌の診断に有効である可能性が示された MALDI-MS/MS を用いたタンパク質の high-throughput 定量法の開発質量分析によるバイオマーカーの臨床診断を実現する上では多検体定量に適応 4

7 できるスループット性が必要である Matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry (MALDI-MS/MS) は LC を介さないため非常にスループット性が高い一方定量性の低さが課題であったこの課題を解決するため標的ペプチドの配列を入れ替えたペプチド (Scrambled IS ペプチド ) を内標準とする独自の Scramble IS 法を考案した MALDI-MS/MS を用いて同一量のモデルペプチドを 10 回測定した結果 intensity のばらつき (%CV) は 55.1% であったが Scrambled IS ペプチドで補正することで 16.2% へ劇的に改善したそこで Scrambled IS 法を用いて検量線を作成した結果 fmol/μl において良好な直線性 (r 2 =0.99 以上 ) を示した Scrambled IS ペプチドのイオン抑制効果に対する補正効果を検証するため同一量の 15 モデルペプチドに対して 5 濃度の血清消化物 (0-0.5 μg/μl) を添加して MALDI-MS/MS 測定を行ったその結果 intensity のばらつき (%CV) はいずれのペプチドにおいても 50% 以上であったが Scrambled IS ペプチドで補正することによって平均 intensity が 300 cps 以上である 11 ペプチド中 10 ペプチドでばらつき (%CV) は 20% 以内となったペプチドのアミノ酸組成が定量感度に及ぼす影響を解析した結果芳香族アミノ酸を置換したペプチドが劇的に感度低下したこのことから芳香族アミノ酸を含むことが高感度化に重要であることが明らかとなった市販血漿をトリプシン消化し LC-MS/MS および MALDI-MS/MS を用いて fibrinogen を定量した結果 μl plasma の範囲で 2 つの手法の定量値の差が 20% 以内となった以上から Scrambled IS 法を用いることで MALDI-MS/MS による再現性の高いバイオマーカータンパク質の定量が実現することが明らかとなった結論本研究ではタンパク質の量的質的変化に着目し水酸化修飾 α-fibrinogen 5

8 IGFBP2 IGFBP3 を早期膵臓癌マーカー IGFBP2 を膵臓癌リスク疾患に反応するリスクマーカーとして同定したこれらのマーカーと自動前処理装置 (192 samples / day) micro LC-MS/MS (10 min/run) MALDI-MS/MS (1 min/run) を用いた high-throughput 定量法を組み合わせることで早期膵臓癌診断が実現すると考えられる 4. 参考論文 Ballehaninna UK and Chamberlain RS (2011) Serum CA 19-9 as a Biomarker for Pancreatic Cancer-A Comprehensive Review. Indian J Surg Oncol 2: Chang MC, Wong JM and Chang YT (2014) Screening and early detection of pancreatic cancer in high risk population. World J Gastroenterol 20: Ono M, Matsubara J, Honda K, Sakuma T, Hashiguchi T, Nose H, Nakamori S, Okusaka T, Kosuge T, Sata N, Nagai H, Ioka T, Tanaka S, Tsuchida A, Aoki T, Shimahara M, Yasunami Y, Itoi T, Moriyasu F, Negishi A, Kuwabara H, Shoji A, Hirohashi S and Yamada T (2009) Prolyl 4-hydroxylation of alpha-fibrinogen: a novel protein modification revealed by plasma proteomics. J Biol Chem 284: Siegel R, Ma J, Zou Z and Jemal A (2014) Cancer statistics, CA Cancer J Clin 64: 発表論文本学位論文の一部は以下の原著論文を基に作成されたものである Yoneyama T, Ohtsuki S, Ono M, Ohmine K, Uchida Y, Yamada T, Tachikawa M and Terasaki T (2013) Quantitative targeted absolute proteomics-based large-scale 6

9 quantification of proline-hydroxylated alpha-fibrinogen in plasma for pancreatic cancer diagnosis. J Proteome Res 12:

学位論文の内容の要旨論文提出者氏名佐藤雄哉論文審査担当者主査田中真二副査三宅智明石巧論文題目 Relationship between expression of IGFBP7 and clinicopathological variables in gastric cancer (

学位論文の内容の要旨論文提出者氏名佐藤雄哉論文審査担当者主査田中真二副査三宅智明石巧論文題目 Relationship between expression of IGFBP7 and clinicopathological variables in gastric cancer ( 学位論文の内容の要旨論文提出者氏名佐藤雄哉論文審査担当者主査田中真二副査三宅智明石巧論文題目 Relationship between expression of IGFBP7 and clinicopathological variables in gastric cancer ( 論文内容の要旨 ) < 要旨 > Insulin-like growth factor ( 以下 IGF)

定量的標的プロテオミクスによる血中タンパク質の病態変動 解析に基づく膵臓癌早期診断法の開発 ( 要約 ) 東北大学大学院薬学研究科 生命薬科学専攻 米山敏広

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