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1 質量分析セミナー autoflex III LRF 韮澤崇 Bruker Daltonics K.K.

2 MALDI Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization マトリックス支援レーザー脱離イオン化 2

3 MALDI の基本原理 Matrix と Sample の混合結晶 LASER による Matrix の励起 脱離およびイオン化 ( プロトン化 ) LASER H + ソフトなイオン化多価イオンを生成しづらい 3

4 TOF-MS の基本原理 Laser P1 G M + m + 20kV ion source drift region detector 1 E= mv 2 =Uz 2 t~ m/z m M t( s) イオンの飛行速度 : おおよそ数 10km/ 秒 ( マッハ 100 以上 ) 4

5 Principle of Time-of-Flight Mass Spectrometry (TOF-MS) 5

6 高感度測定用サンプルターゲットプレート AnchorChip technology 6

7 Principle of AnchorChip TM Sample Preparation Dried Droplet AnchorChip Hydrophobic coating 7

8 Size Comparison: Dried Droplet vs. AnchorChip TM Matrix: 2,5-DHB 200μm アンカー使用時 2 mm 8

9 Peptide Mix on AnchorChip TM vs. Dried Droplet Matrix: -HCCA Anchor Diameter: 400 m 10 fmol 100 amol m/z m/z 1 fmol 10 amol m/z 5 amol m/z m/z 9

10 In-Gel Digest: Anchorchip Preparation 同一条件による比較 c/o Christine Gauss, GPC 10

11 アプリケーション 分子量の測定 タンパク質 DNA 低分子 合成高分子 タンパク質の同定 ( 電気泳動で分離精製 ) PMF/PFF 未知タンパク質の配列解析 ( トップダウン解析 ISD) 11

12 分子量の測定 Matrix: SA Positive Linear mode もし鎌形赤血球貧血症だと -30 -globin -globin -globin: 6 Glu Val コード :GAG GUG 12

13 IgG 150kDa in SA matrix; Positive Linear mode Intens. [a.u.] 8000 [M+H] + [M+2H] m/z 13

14 DNA 測定例 Intens. [a.u.] x DNA 30mer DNA 20mer m/z 14

15 DNA 測定例 x Intens. [a.u.] * 50mer_GP2\0_G6\1\1SLin 50mer x Intens. [a.u.] * 70mer_GP2\0_H6\1\1SLin 70mer 0.0 x104 Intens. [a.u.] 3 * 99mer_GP2\0_G8\1\1SLin mer m/z 15

16 分子量の測定 Intens. [a.u.] x m/z 16

17 分子量の測定 MS/MS スペクトル possibly sugar moiety possibly fatty acid moiety 17

18 分子量の測定 Intens. [a.u.] x 元素組成解析 m/z 18

19 Polymer 解析 a.i 複雑な多成分系からなる混合物の同定 分子量 構成パターン Matrix:Dithranol m/z 19

20 Polymer 解析 Intens. x PPG PPG PPG PPG PPG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG PEG 0.8 PS PS PS PS PS PS m/z 20

21 タンパク質の同定 分離精製方法の違いにより同定までのプロトコルが異なる 2 次元電気泳動での分離精製後のサンプルは が用いられる 21

22 ゲル内消化プロトコル 22

23 ゲル内消化プロトコル 23

24 タンパク質の同定 (*Mascot は Matrix Science 社製 ) 切り出し 消化 2D-PAGE 抽出 データベース検索 (biotools/mascot) m1 m2 m3 m1 レーザーピークリスト m2 m3 MALDI 調製 m/z 24

25 Protein Identification PMF MALDI MS Peptide Fingerprint

26 酵素消化物スペクトルから MASCOT PMF Search へ ~Biotools & MASCOT~ (*Mascot は Matrix Science 社製 ) Biotools software MASCOT search 26

27 タンパク質の同定 27

28 タンパク質の同定 スポット 2 PMF 28

29 タンパク質の同定 Combined LIFT(MS/MS) Search 4 つの PSD MS/MS スペクトルをコンバインすると ウシのアルブミンがヒット しかも高スコア 29

30 タンパク質の修飾解析 アミノ酸配列 ( 候補 ) を算出 30

31 タンパク質の修飾解析 N 端が修飾されているとすると よって修飾は Kが修飾されているとすると 良く一致 N 端ではなく Kから先が一致せずに存在と判定 31

32 未知タンパク質の配列解析 Sample Target Precursor Ion Selector (PCIS) Source 2 (LIFT) CID LID/T³ ISD Gridless DE MALDI Source Ion Source Collision Cell 32

33 未知タンパク質の配列解析 ISD ( In Source Decay) フラグメントイオンの種類 N- 末端イオン ISD a 1 b 1 c 1 a 2 b 2 c 2 a 3 b 3 c 3 H 2 N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH Fohlmann et al. (1988) IJMSIP 86, 137 R 1 R 2 R 3 R 4 x 3 y 3 z 3 x 2 y 2 z 2 x 1 y 1 z 1 *ISD では c- および y-ion が特徴的に観測される C- 末端イオン N- H N R1 O ISD ca kD N H R2 O H N R3 O N H R4 O H N H N R1 O N H ISD ca kD R2 O H N R3 O N H R4 O H N -C c i c i+1 c i+2 c i+3 yi+3 yi+2 y i+1 y i C-ion series Y-ion series 33

34 未知タンパク質の配列解析 T 3 -sequencing(terminus analysis by TOF/TOF) Protein Sequence ISD fragmentation N 1 4kDa N c-ion Invisible due to matrix peaks C Invisible due to matrix peaks y-ion C 4 1kDa T 3 -sequencing (ISD+LIFT) N N N-terminal peptides C-terminal peptides C C ISD は intact のタンパクから直接シークエンスに関する情報を得ることができる 優れた手法であるが 末端部分 ( 低分子量領域 ) についてはマトリックス由来のピーク群に隠されてしまうために 情報が得られない T 3 -sequencing はそれを補うためのもので ISD と LIFT(TOF/TOF による MS/MS 測定 ) を組み合わせた MS/MS/MS 的な測定手法である ISD によって生成した c-ion もしくは y-ion を選択し その MS/MS を行うことで末端部分のシークエンス解析が可能になる 34

35 未知タンパク質の配列解析 Intens. [a.u.] 8000 BSA 66kDa m/z 35

36 未知タンパク質の配列解析 BSA 66kDa reisd D T H K S E I A H R F K D L G E E H F K G L V L I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T C V A D E S H A G C E K S L H Ion c D T H K S E I A H R F K D L G E E H F K G L V L I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T CV A D ES HA G C E K S L H y D T H K S E I A H R F K D L G E E H F K G L V L I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T C V A D E S H A G C E K S L H Abs. Int. * 1000 c A H R F K D L G E E H F K G L V L I A F S Q Y L Q Q C P F D E H V K L V N E L T E F A K T G C E K S c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c m/z 36

37 reisd による修飾部位解析 Intens. [a.u.] x Protein A Mb 0:C2 MS Raw Intens. [a.u.] Protein A+mod?? Mb-K45He 0:C1 MS Raw 4000 reisd!!! m/z 37

38 reisd による修飾部位解析 Abs. Int. * 1000 c N V W G K V E A D I A G H G Q E V L I R L F T G H P E T L E K F D K F K H L K T E A E M K A S E y I D N R F L E L A K T M A G Q A D A G F D G P H K S H L V H I I A D S I F E L Y K I P I K H K T A y 11 c 11 y 30 y 35 y 44 y 46 y 25 y 28 y 33 y 49 c 35 y 40 y 43 y 45 c 22 c 25 c 28 y 32 y 38 y 48 y 50 c 40 c 34 y 42 c 43 y 13 y 17 c 20 c 30 c 32 y 37 y 47 y 21 y 24 c 27 c 48 y 39 y 15 y 41 c 42 c 13 c 17 c 19 c 21 c 24 c 26 c 29 y 31 c 37 c 45 c 47 y 34 c 39 c 15 c 41 y 12 y 16 y 18 y 20 c 23 y 23 y 27 c 31 y 36 c 44 c 46 c 33 c 38 c 49 y 14 y 29 c 16 c 18 c 12 y 19 y 22 y 26 c 36 c 14 y 53 y 58 y 52 y 55 y 57 y 59 y 51 y 54 y 56 c 57 y 60 c 50 c 52 c 54 c 56 c 59 c 51 c 53 c 55 c m/z Abs. Int. * 1000 c N V W G K V E A D I A G H G Q E V L I R L F T G H P E T L E K F D K* F K H L K T E A E M K A S E y I D N R F L E L A K T M A G Q A D A G F D G P H K S H L V H I I A D S I F E L Y K I P I K H K T A H S Q A L P y 29 c 29 c 25 y 28 y 18 c 24 y 34 y 17 c 21 y 23 c 28 y 33 y 38 y 44 c 16 c 20 y 40 c 23 y 24 y 27 y 32 y 35 y 37 y 42 y 46 y 13 y 15 c 18 y 20 c 27 y 39 c 32 c 35 y 41 y 43 y 45 y 12 y 14 c 17 y 22 c 19 y 26 c 37 y 31 c 34 c 40 c 43 c 12 y 47 c 14 y 16 y 19 c 22 c 26 c 36 y 30 c 31 c 33 c 39 c 42 y 11 c 13 c 15 y 21 y 25 y 36 c 38 c 41 c 44 c 30 c 11 y 48 y 50 y 49 y 57 c 51 c 50 y 53 c 48 c 47 y 60 c 46 y 56 y 59 y 64 y 55 c 53 y 63 y 51 c 49 c 52 y 61 c 56 y 66 c 55 y 65 y 52 c 45 y 58 c 54 c 57 c 59 y 54 y 62 c m/z 38

39 reisd による修飾部位解析 Intens. [a.u.] x104 3 Mb-ISD 0:H2 MS Raw AA43 F AA44 D AA45 K AA46 F AA47 K AA48 H Intens. [a.u.] x104 5 F D AA43 AA44 AA45+Mod!!! Mb-K45He-ISD 0:F2 MS Raw m/z 39

40 9833 reisd による DNA 配列解析 m/z x T A T C G C G T A T A C G C G T A T A C G C G T A T A T A T C G C G T A T A C G C G T A T A C G C G T A T A Intens. [a.u.]

41 ブルカー ダルトニクス株式会社 本社営業部 横浜市神奈川区守屋町 3-9 TEL: FAX: 営業担当 : 志村信之 Nobuyuki.Shimura@bruker.com アプリケーション TEL: 担当 : 韮澤崇 Takashi.Nirasawa@bruker.com サービス TEL: Service.BDAL.JP@bruker.com 41

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