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1 ビタミン カロチノイドの発酵 星野達雄 東大

2 ビタミンの種類 (13 種 ) 水溶性ビタミン ビタミン B1 ビタミン B2 ビタミン B6 ビタミン B12 ニコチン酸パントテン酸葉酸ビオチンビタミン C 脂溶性ビタミン ビタミン A ビタミン D ビタミン E ビタミン K

3 水溶性ビタミン ビタミンB1 補酵素 TPP ビタミンB2 補酵素 FMN,FAD ビタミンB6 補酵素 PDP ビタミンB12 補酵素 アデノシルCob ニコチン酸 補酵素 NAD,NADP パントテン酸 CoA 脂肪酸合成など 葉酸 補酵素 C1 基の転移 ビオチン 補酵素 CO2 転移 ビタミンC 水酸化に関与 (OH-Pro)

4 脂溶性ビタミン ビタミンA 抗酸化ビタミン ロドプシン ビタミンD Caの吸収 ビタミンE 抗酸化ビタミン ビタミンK 補酵素 ( 血液凝固因子 ) Caの吸収に関与

5 しみ ビタミンの薬理効果 A E B1 B2 B6 B12 C にきび 口内炎 疲れ目 目の乾燥 肩こり 手足のしびれ 腰痛 冷え性

6 ピロロキノリンキノン (PQQ) 新たなビタミン発見!!? サプリメントとして発売

7 PQQ の概要 Coenzyme concerning redox cycling identified in 1979 Water soluble compound (reddish brown powder) DistributionIn daily foods and beverages In human tissues, organs and human milk

8 BioPQQ and Three Pillars to Brain Health The Revolution has Begun! BioPQQ can help you see improvements in the short term and protect your brain in the long term. Here are the three ways BioPQQ has revolutionized brain health. Grow Nerve Growth Factor Energize Increasing Mitochondria Protect Antioxidant ( 三菱瓦斯化学 )

9 Vitamin B12

10 シアノコバラミン

11 コバラミンの種類 OHコバラミン CH3コバラミン Deoxyadenosylコバラミン 光に不安定光に不安定光に不安定 CN コバラミン 室温で光に安定 工業生産するときは 全て CN コバラミンとして回収している

12 ビタミン B12 発酵菌 始原菌 細菌 放線菌によって生合成される 酵母 糸状菌 植物 動物には生合成能はない Streptomyces olivaceus ( グルコース :8.5mg L) Propionibacterium freudenreichii ( グルコース :25mg L) P. shermanii ( グルコース : 39mg L) Pseudomonas denitrificans ( ビートモラセス : 59mg L) Corynebacterium ( パラフィン : 2.3mg L)

13 P. denitrificans を用いた例 ビートモラセス (100g) 酵母エキス(2g) 5, 6-ジメチルベンズイミダゾール (25mg)/Lのほか 無機塩を含む培地を用いる 生産性 :59 mg L ビートモラセスに含まれているベタインが重要な役割を果たしている ベタインの役割については十分理解されていない

14 生合成に関与する遺伝子 (30) は既にクローニングされている

15 ビタミン B2( リボフラビン )

16 ビタミン B2( リボフラビン )

17 ビタミン B2( リボフラビン ) 生産菌 Ashbya gossypii (BASF) 5-6 g/l Candida flaeri (Coors) 7.5 g/l Candida famata 20 g/l Bacillus subtilis 4.5 g/l (recombinant, Russia) Corynebacterium ammoniagenes 17.4 g/l (recombinant, Kyowa)

18 riba ribg ribh ribt ribb riba

19 DSM 社の B.subtilis 組換え体による B2 発酵 B. subtilis ではオペロンをなしている (E.coli は 4 カ所に分散 )

20 Bacillus subtilis の リボフラビンオペロン ribt ribh riba ribb ribg ribo 転写物 rib C (Repressor gene) によって発現はコントロールされている

21 リボフラビンオペロンの改変 元のプロモーターを 強力なプロモーターと2カ所交換 プラスミド上にオペロンを挿入 染色体上に組み込み 薬剤選択圧によるコピー数の増大

22 コピー数増大による薬剤耐性強化 B2 オペロン数の上昇 B2 生産の増大 B2 オペロン耐性遺伝子 B2 オペロン 組み換え B2 耐性 B2 耐性 B2

23 培養液 (48 時間後 ) 20 m

24 ビタミン C

25 現在使われているビタミン C の製造方法 合成 CH2OH HCOH HOCH HCOH HCOH CH2OH D-Sorbitol CH2OH C=O HOCH HCOH HOCH CH2OH L-Sorbose 合成 Diacetone-L-sorbose 合成 Diacetone-2KGA CHO HCOH HOCH HCOH HCOH CH2OH D-Glucose COOH C=O HOCH HCOH HOCH CH2OH 2KGA 標準ルート 中国ルート 合成 合成 O=C HOC O HOC HC HOCH CH2OH Vitamin C

26 ビタミン C の直接発酵方法

27 ビタミン C の合成能 ヒトは アスコルビン酸を生体内で合成できない その必要量をすべて食事などによって外部から摂取する必要がある 多くの動物は アスコルビン酸を生合成できる 体内で合成できないのは モルモットや霊長類の一部 ( 人間を含む ) など一部だけである

28 動物におけるビタミン C 生合成 Glucose D-グルクロン酸 L-グロノラクトン L- グロン酸 ビタミン C

29 植物のビタミン C 生合成 9 酵素反応

30 ビタミン C の微生物生産 微生物 :3 段階 動物 : 9 段階 植物 : 9 段階

31 ビオチン

32 1960 年代 ビオチン発酵の歴史 ピメリン酸などの前駆体の添加がビオチン生産に有効であることを発見 Bacillus sphaericus μg/ml 1970 年代 ビオチン拮抗物質耐性変異株が取得され利用されるようになった ビオチン拮抗物質 ( アシドマイシン 5- (2-チエニル)n- 吉草酸 ) 耐性株株分離

33 ビオチン発酵の歴史つづき 1980 年代 遺伝子操作による菌株育種が行われた E. coli K mg/l Serratia marcescens 1g/L Bacillus sphaericus 48mg/L

34

35 ビオチンオペロン Bacillus subtilis 168 B D F A W Escherichia coli K-12 B F C D A ビオチンによる強いフィードバックコントロール

36 ビオチン発酵の課題 デチオビオチンに硫黄原子を導入する最終反応はビオチン合成酵素によって触媒され 生合成上の律速反応となっている その反応機構は未だ不明の点が多い

37 DTB からビオチンへの反応系 NADPH フラボドキシン フラボドキシン還元酵素 鉄イオンが必要

38 ビタミン B6( ピリドキシン ) CHO CH2NH2 ピリドキサールピリドキサミン

39 ビタミン B6 発酵 用途 : 医薬用原料 飼料添加物用原料 食品添加物に利用される 生産 : 現在微生物発酵によるビタミンB6 生産は行われていない 化学的プロセスで年間約 3,500トンのピリドキシンが生産されている

40 リゾビウムにおけるビタミン B 6 生産とその生合成に関する研究

41 ビタミン B 6 生産菌の分離 分離 10 g/ml のシクロヘキシミド入り栄養寒天 28 で培養 ビタミン B6 生産 1,590 の細菌 28 で培養 ビタミン B6 定量 49 の土壌試料の懸濁液 - 28 で 17 時間間培養 生産培地の寒天ブロックに植菌 B6 検定培地に乗せる

42 スクリーニング結果 Number of bacteria (%) Diameter of halo (mm) 20 < 20 ~ ~ > 4.4% < 0.01 mg/l < 1 mg/l > 1 mg/l 液体培養

43 根粒菌におけるビタミン B 6 生産 Rhizobium strain R. meliloti IFO R. meliloti IAM R. huakii IFO R. huakii IFO R. leguminosarum strain R. leguminosarum IFO R. leguminosarum IFO R. leguminosarum IFO R. leguminosarum IFO R. leguminosarum IFO R. leguminosarum IFO R. leguminosarum IFO R. leguminosarum IFO R. tropici IFO R. galegae IFO R. loti IFO R. loti IFO Vitamin B 6 (mg/l)

44 ビタミン B6 の微生物生合成経路まとめ Glucose Glucose 6P 6PG Gram- 菌 GcolAD P.P. E4P ED Eda PYR Dxs DXP YaaD, YaaE Gram+ 菌 G3P PdxJ PNP PdxP Pyridoxine 4PE PdxR SerC 4PHT PdxA AHP

45 Vitamin B6 Biosynthesis

46 カロチノイド

47 カロチノイド 植物 藻類 光合成細菌の光合成 動物の視覚 ( プロビタミンA) 色彩 ( 花 果物 野菜 動物 魚 卵黄など ) 抗酸化作用 現在約 750 種類のカロチノイドが単離 構造決定されている 炭素 40 からなる分子が一番多く存在

48 卵黄色はコントロール可能

49 主なカロチノイド生産菌 生産菌株カビ 酵母 Blakeslea trispora Phaffia rhodozyma 微細藻類 Haematococcus pulvialis Dunaliella salina カロチノイド β-カロチンアスタキサンチンアスタキサンチン β-カロチン

50 E B I Z リコピン Y β- カロチン W Z W Z W ゼアキサンチン W Z カンタキサンチン W Z W Z アスタキサンチン

51 Dunaliella salina の培養 β カロチンの生産 塩濃度 :20-30% 強い光が必要宮古ファーム

52 アスタキサンチン 富士フィルム

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