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あきみみやまる
5 years ago
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1 B-0902 黄砂現象の環境健康リスクに関する環境科学的研究研究代表者 : 那須正夫大阪大学大学院薬学研究科

2 黄砂現象の環境生態系健康へのリスクを評価するための基盤的普遍的知識ベースの構築微生物のキャリアーとしての黄砂微小粒子としての黄砂バイオイメージングによる直接的証明長距離移動した細菌の量と属種の解析微小粒子の生体内動態免疫撹乱作用の in vitro 解析黄砂を捕集する新たなサンプリング法の開発粒子の物理化学的分析

黄砂発生源土壌黄土高原 (2009 年 6 月 30 日 ) ゴビ沙漠 (2011 年 7 月 22 日 )

3 月 ~5 月 ) (2010 年 3 月 ~5 月 ) (2011 年 3 月 ~5 月 ) 日本海上空瀬戸内海上空

3 黄砂発生源土壌黄土高原 (2009 年 6 月 30 日 ) ゴビ沙漠 (2011 年 7 月 22 日 ) タクラマカン沙漠 (2008 年 3 月 3 日 ) 計 25 地点ゴビ沙漠タクラマカン沙漠黄土高原北京日本国内における黄砂日本海瀬戸内海上空 (2009 年 3 月 ~10 月 ) (2010 年 3 月 ~11 月 ) (2011 年 4 月 ~5 月 ) 計 32 回中国国内における黄砂 ( 北京 ) 中国農業大学屋上 (2009 年 3 月 ~5 月 ) (2010 年 3 月 ~5 月 ) (2011 年 3 月 ~5 月 ) 日本海上空瀬戸内海上空計 31 回ポンプやフィルターを使用しない独自の黄砂捕集装置を作製流量約 120 L/ min ( 約 2 時間のフライトで約 10m 3 を捕集可能 )

2010 年 11 月に観測された大規模な黄砂現象 11:20 12 Nov. 2010 (JST) http://rapidfire.

4 2010 年 11 月に観測された大規模な黄砂現象 11:20 12 Nov (JST) /SeaofJapan.A km.jpg

環境中に存在する細菌の大部分は培養が困難黄砂中に存在する細菌の多様性解析 PCR-DGGE * 法,

5 黄砂現象とともに飛来する細菌を培養することなく遺伝子を指標として解析する黄砂粒子表面に存在する細菌の可視化蛍光顕微分光法黄砂中に存在する細菌の現存量測定定量的 PCR 法環境中に存在する細菌の大部分は培養が困難黄砂中に存在する細菌の多様性解析 PCR-DGGE * 法, クローンライブラリー法 *: Denaturant Gradient Gel Electrophoresis ( 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法 )

6 レーザー顕微鏡による顕微分光法を用いた黄砂粒子表面に存在する細菌の可視化 5 mm 10 mm サンプリング : 日本海 ( 鳥取県沿岸 ) 上空高度 900 m(2010 年 11 月 12 日 ) 黄砂ともに細菌が移動していることを世界で初めて直接証明した 5 mm

7 増殖した黄砂粒子上の細菌 5 mm 10 mm サンプリング : 日本海 ( 鳥取県沿岸 ) 上空高度 900 m(2010 年 11 月 12 日 ) 黄砂とともに移動する細菌は増殖能を有することを世界で初めて直接証明した

8 黄砂とともに飛来する細菌の現存量ならびに多様性黄砂中の細菌を培養することなく DNA を抽出定量的 PCR 法による細菌の現存量測定黄砂中の細菌を培養し DNA を抽出 25 C で 7 日間培養 ( 標準培地 R2A 培地 ) 16S rrna 遺伝子量をもとに算出クローンライブラリー法による細菌の多様性解析 16S rrna 遺伝子全長をクローニング 480 クローンの配列を解析

9 黄砂中の細菌現存量サンプリング日高度 (m) 黄砂細菌現存量 (cells/m 3 ) 2010 年 11 月 12 日 x 年 11 月 13 日 x 年 11 月 16 日 < 5 x 年 5 月 2 日 x 10 4 定量的 PCR により細菌の現存量を測定標的遺伝子 :16S rrna 遺伝子 (4 copies/cell として算出 ) サンプリング : 日本海 ( 鳥取県沿岸 ) 上空黄砂中の細菌現存量を測定しその量は通常の生活環境における空気中の細菌量と同程度であることを明らかにした

10 黄砂中に存在する細菌の系統解析 Cyanobacteria Alphaproteobacteria Bacilli Actinobacteria Gammaproteobacteria Sphingobacteria PCR-DGGE で分離されたバンドから塩基配列を解析 (16S rrna 遺伝子 ) サンプリング : 日本海 ( 鳥取県沿岸 ) 上空高度 900 m

11 細菌の構成比率日本に飛来した黄砂中の細菌群集構造 100% 80% 60% 40% 20% 0% Deinococci Caldilineae Armatimonadia Acidobacteria Planctomycetacia Verrucomicrobiae Chloroplast Cyanobacteria Gemmatimonadetes Fusobacteria Actinobacteria Bacilli Clostridia Erysipelotrichia Bacteroidia Flavobacteria Sphingobacteria Alphaproteobacteria Betaproteobacteria Gammaproteobacteria Deltaproteobacteria other 2010 年 11 月 12 日 2011 年 5 月 2 日 16S rrna 遺伝子ライブラリを作成後各 480 クローンの塩基配列を解析サンプリング : 日本海 ( 鳥取県沿岸 ) 上空高度 900 m 黄砂とともに飛来する細菌種は従来報告されていた以上に多種多様であることを明らかにした

12 細菌の構成比率 100% 80% 60% 40% 20% 0% 培養にともなう細菌群集構造の変化培養せず R2A 培地標準培地 Deinococci Caldilineae Armatimonadia Acidobacteria Planctomycetacia Verrucomicrobiae Chloroplast Cyanobacteria Gemmatimonadetes Fusobacteria Actinobacteria Bacilli Clostridia Erysipelotrichia Bacteroidia Flavobacteria Sphingobacteria Alphaproteobacteria Betaproteobacteria Gammaproteobacteria Deltaproteobacteria other 特定の培地で培養後 16S rrna 遺伝子ライブラリを作成後各 480 クローンの塩基配列を解析サンプリング : 日本海 ( 鳥取県沿岸 ) 上空高度 900 m(2010 年 11 月 12 日 ) 培養法による黄砂中の細菌の群集構造解析には培地の選択が重要である

13 細菌の構成比率 100% 80% 60% 40% 20% 0% 黄砂発生源土壌中の細菌群集構造タクラマカン沙漠ゴビ沙漠黄土高原 Deinococci Caldilineae Armatimonadia Acidobacteria Planctomycetacia Verrucomicrobiae Chloroplast Cyanobacteria Gemmatimonadetes Fusobacteria Actinobacteria Bacilli Clostridia Erysipelotrichia Bacteroidia Flavobacteria Sphingobacteria Alphaproteobacteria Betaproteobacteria Gammaproteobacteria Deltaproteobacteria other 16S rrna 遺伝子ライブラリを作成後各 150 クローンの塩基配列を解析乾燥地である黄砂発生源土壌においても黄砂と同様に多種多様な細菌種が存在することを明らかにした

14 黄砂現象とともに日本へ飛来する細菌約 2,000クローン黄砂発生源土壌および北京へ飛来する黄砂に存在する細菌約 600クローン黄砂現象に関連する約 2,600 クローンの細菌データベースを構築 ( 公開の予定 )

15 黄砂の免疫影響生体影響生体侵入した場合黄砂に曝露するとマクロファージ ( 貪食細胞 ) 免疫応答炎症性サイトカインの産生!? 黄砂黄砂が移行する臓器は!? 細胞は!? 炎症惹起!? 黄砂が免疫系へ及ぼす影響についての詳細は不明黄砂の生体影響のメカニズム解明に有用な情報となり得る黄砂の体内動態生体影響の詳細は不明

40 20 Si Si 0 SEM-EDX により各 100 粒子の黄砂粒子の成分を分析サンプリング :

16 Percentage of elemental contents (%) 水分との接触による黄砂粒子の分散粘着シートで捕集水の存在下で捕集 100 水の存在下で Al Na, Ca, Mg など Al Si Si 0 SEM-EDX により各 100 粒子の黄砂粒子の成分を分析サンプリング : 日本海 ( 鳥取県沿岸 ) 上空高度 900 m 黄砂粒子が粘膜上で分散し粒径が1 mm 以下の微粒子になる可能性を示した

17 黄砂および黄砂発生源土壌の起炎性評価 TNF- (ng/ml) RAW264.7 細胞 ( マウスマクロファージ細胞株 ) 黄砂黄土高原土壌 100 mg/ml 添加 24 hr ELISA 培養上清を回収し TNF- 量を測定 N.D. N.D. LPS (1.5 μg/ml)n.d.; not detected 黄砂は黄土高原土壌と比較して炎症性サイトカイン産生を強く誘導することがわかった

18 黄砂発生源土壌の起炎性と粒子径 TNF- (ng/ml) RAW264.7 細胞 ( マウスマクロファージ細胞株 ) 黄砂黄土高原土壌 100 mg/ml 添加 24 hr ELISA 培養上清を回収し TNF- 量を測定 5 4 ** P < ** N.D. 小さな粒子ほど強い起炎性を有することがわかった LPS (1.5 μg/ml)n.d.; not detected

TNFα (ng/ml) ファゴサイトーシスによる炎症惹起評価黄砂マウスマクロファージ細胞株

p38 p38 炎症性サイトカイン産生 P 7 6 5 4 3 2 1 0 N.D.

control LPS 黄砂 1 黄砂 2 黄土 [10 mm 以下 ] LPS (1.

19 TNFα (ng/ml) ファゴサイトーシスによる炎症惹起評価黄砂マウスマクロファージ細胞株 JNK JNK MAPK 経路 P ROS ERK ERK 核 P cytochalasind p38 p38 炎症性サイトカイン産生 P N.D. ファゴサイトーシス阻害剤 (cytochalasind) 0 mm 5 mm 10 mm control LPS 黄砂 1 黄砂 2 黄土 [10 mm 以下 ] LPS (1.5 μg/ml)**p < 0.01 黄砂による炎症性サイトカインの産生にはファゴサイトーシスによる黄砂の取り込みが関与していることが示唆された

20 TNF- (ng/ml) 黄砂による活性酸素種 (ROS) の産生黄砂マウスマクロファージ細胞株 JNK JNK MAPK 経路 P ROS ERK ERK 核 P p38 p38 BHA 炎症性サイトカイン産生 P ROS 阻害剤 (BHA) ** ** 阻害剤 (-) 阻害剤 (+) control LPS 黄砂 1 黄砂 2 黄土 (10 µm 以下 ) ** ** LPS (1.5 μg/ml)**p < 0.01 黄砂による炎症性サイトカインの産生には ROS などの酸化ストレス因子が関与していることが示唆された

TNF- (ng/ml) TNF- (ng/ml) 黄砂の炎症惹起における MAP キナーゼ (MAPK) の関与黄砂マウスマクロファージ細胞株 ROS MAPK inhibitor 50 40 30 20 10 ** JNK 阻害剤 ** ** 阻害剤 (-) 阻害剤 (+) * MAPK 経路 JNK ERK p38 JNK P ERK P p38 P 0 15

21 TNF- (ng/ml) TNF- (ng/ml) 黄砂の炎症惹起における MAP キナーゼ (MAPK) の関与黄砂マウスマクロファージ細胞株 ROS MAPK inhibitor ** JNK 阻害剤 ** ** 阻害剤 (-) 阻害剤 (+) * MAPK 経路 JNK ERK p38 JNK P ERK P p38 P control LPS 黄砂 1 黄砂 2 黄土 (10 µm 以下 ) ERK 阻害剤 ** ** ** ** 核 5 炎症性サイトカイン産生 0 N.D. control LPS 黄砂 1 黄砂 2 黄土 (10 µm 以下 ) LPS (1.5 μg/ml)**p < 0.01 *P < 0.05 黄砂は MAPK 経路の活性化を介して炎症を惹起する可能性が示唆された

22 黄砂による炎症性サイトカイン産生の誘導の機序黄砂 MAPK 経路 JNK ERK p38 JNK P ROS ERK 核 P p38 P ファゴサイトーシスによる黄砂の取り込み活性酸素の発生 MAPキナーゼ経路の活性化炎症惹起炎症性サイトカイン産生黄砂による炎症性サイトカイン産生の誘導の機序の一部を明らかにした

23 黄砂の体内動態評価黄砂黄土高原土壌 30 mg/mouse 単回経鼻投与黄砂投与群電子顕微鏡観察 24 hr 肺鼻腔粘膜脳脾臓肝臓を回収黄土高原土壌投与群 100 nm 1 μm 1 μm 黄砂黄土高原土壌投与群ともに肺胞表面で粒子が確認された

24 黄砂および黄砂発生源土壌の病理学的解析鼻腔構造 Control 黄砂黄土高原土壌吸い込んだ空気の加湿加温に働く鼻腔下部で呼吸気の通ずる道呼吸部嗅覚器である嗅細胞を含む部分嗅細胞から出発する嗅神経の軸索が脳に繋がる嗅部鼻甲介呼吸部上皮細胞 50 µm 50 µm 50 µm 鼻前庭外鼻孔嗅部上皮細胞 50 µm 50 µm 50 µm 嗅細胞の壊死変性!! 黄土高原土壌投与群において異常所見は観察されなかったが黄砂投与群では嗅細胞の壊死や変性が観察された

25 本研究の成果微生物のキャリアーとしての黄砂 : 黄砂は細菌のキャリアーとなり黄砂とともに飛来する細菌の現存量は上空で約 10 4 cells/m 3 ( 生活環境中の空気と同程度の細菌量 ) 黄砂とともに飛来する細菌種はこれまで報告されていた以上に多種多様微小粒子としての黄砂 : 黄砂粒子は水に触れることにより1 mm 以下の微粒子に分散する黄砂粒子は強い起炎性を示し微細な粒子ほどより強い起炎性を有する黄砂粒子は生体内に侵入し細胞障害を起こす可能性がある黄砂とともに飛来する細菌は定着や遺伝子伝播により生態系に影響を及ぼしうる微小粒子としての黄砂は生体に影響を与える可能性がある

26 見込まれる環境政策への貢献黄砂現象の環境生態系健康へのリスクを評価するための基盤的普遍的知識ベースを構築科学的データに立脚した環境リスクマネジメントやリスクコミュニケーション等の政策に貢献国際的に公表 : 地球規模の問題解決のための政策立案国際協力体制の確立一般社会へ紹介 : 科学的根拠のない情報にもとづく社会的不安の排除

( 続紙 1 ) 京都大学博士 ( 薬学 ) 氏名大西正俊論文題目出血性脳障害におけるミクログリアおよびMAPキナーゼ経路の役割に関する研究 ( 論文内容の要旨 ) 脳内出血は高血圧などの原因により脳血管が破綻し脳実質へ出血した病態をいう漏出する血液中の種々の因子の中でも血液凝固に関

( 続紙 1 ) 京都大学博士 ( 薬学 ) 氏名大西正俊論文題目出血性脳障害におけるミクログリアおよびMAPキナーゼ経路の役割に関する研究 ( 論文内容の要旨 ) 脳内出血は高血圧などの原因により脳血管が破綻し脳実質へ出血した病態をいう漏出する血液中の種々の因子の中でも血液凝固に関 Title 出血性脳障害におけるミクログリアおよびMAPキナーゼ経路の役割に関する研究 ( Abstract_ 要旨 ) Author(s) 大西, 正俊 Citation Kyoto University ( 京都大学 ) Issue Date 2010-03-23 URL http://hdl.handle.net/2433/120523 Right Type Thesis or Dissertation