卒業論文ダイジヱスト微生物叢解析及びメ夕ボローム解析から探る沢庵漬けの発酵過程の解明環境情報学部 4 年梅田栄美要旨沢庵漬けは大根を干して米糖と塩で漬け, 乳酸菌や酵母などの微生物による発酵させることによって作

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あいねしろみず
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1 Powered by TCPDF ( Title 微生物叢解析及びメ夕ボローム解析から探る沢庵漬けの発酵過程の解明 Sub Title Author 梅田, 栄美 Publisher 慶應義塾大学湘南藤沢学会 Publication year 2013 Jtitle 生命と情報 No.20 (2013. ),p Abstract 沢庵漬けは大根を干して米糖と塩で漬け, 乳酸菌や酵母などの微生物による発酵させることによって作られる日本の伝統的な漬物である本研究では微生物発酵の仕組みを理解することを目的に, 沢庵漬けの本漬けの過程における糠床中の細菌叢の変化及び沢庵漬け内のメタボライトの変化を, 16S rrnaクローンライブラリー解析, RT-PCRにより細菌数の定量及びCE-TOFMSによるメ夕ボローム解析を行った解析対象は本漬け開始から12ヶ月までのぬか床を1ヶ月おきにサンプリングしたものである本漬け開始から2-3ヶ月で既に乳酸菌群が優占種となっていたが, その後発酵 8ヶ月から9ヶ月目までは急激に細菌数も上昇する事が明らかになった一方で発酵開始直後から3ヶ月目まではLactobacillus sakeiが増殖しているものの, 8ヶ月では既にLactobacillus malefermentasやpediococcus inopinatusなどが増殖している事がわかった乳酸菌の菌種の入れ替わりによって生じる違いを考察するため, これらの菌を単離し培養を行ったまた発酵開 11ヶ月以降ではMarinomonas 属, Halomonas 属など, Oceanospirillales 目の細菌がサンプル中 20%-70% を占める程に増殖していたこれらの好塩菌はキムチ漬けからの報告はあるが, 日本の漬物からは分離されておらず, 沢庵漬けの発酵におけるこれらの菌の役割が注目される近縁の細菌では抗菌作用を持つ例もあるので, 糠からこれらの菌を分離し, 種同定と抗菌活性等についての解析も行ってメタボローム解析の結果と共に議論したい Notes 慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス先端生命科学研究会 2013 年度学生論文集卒業論文ダイジェスト Genre Technical Report URL

2 卒業論文ダイジヱスト微生物叢解析及びメ夕ボローム解析から探る沢庵漬けの発酵過程の解明環境情報学部 4 年梅田栄美 11Q14Qeu@sfc.keio.ac.jp 要旨沢庵漬けは大根を干して米糖と塩で漬け, 乳酸菌や酵母などの微生物による発酵させることによって作られる日本の伝統的な漬物である. 本研究では微生物発酵の仕組みを理解することを目的に, 沢庵漬けの本漬けの過程における槺床中の細菌叢の変化及び沢庵漬け内のメタボライトの変化を, 1 6 S rr N A クローンライブラリー解析,R T -P C R により細菌数の定量及びC E - T O F M S によるメ夕ボローム解析を行った. 解析対象は本漬け開始から 1 2 ヶ月までのぬか床を 1 ヶ月おきにサンプリングしたものである. 本漬け開始から 2-3 ヶ月で既に乳酸菌群が優占種となっていたがその後発酵 8 ヶ月から9 ヶ月目までは急激に細菌数も上昇する事が明らかになった. 一方で発酵開始直後から 3 ヶ月目までは Locto わ adz/ws soto' が増殖しているものの,8 ヶ月では既に Ld ぬ ma/e/ermento や尸 etftococcws などが増殖している事がわかった. 単離し培養を行った. 乳酸菌の菌種の入れ替わりによって生じる違いを考察するため, これらの菌をまた発酵開 1 1 ヶ月以降では Marinomonos: 属,//a/omonas 属など目の細菌がサンプル中 2 0 % ~ 7 0 % を占める程に増殖していた. これらの好塩菌はキムチ漬けからの報告はあるが, 日本の漬物からは分離されておらず沢庵漬けの発酵におけるこれらの菌の役割が注目される. 近縁の細菌では抗菌作用を持つ例もあるので糠からこれらの菌を分離し, 種同定と抗菌活性等についての解析も行ってメタボローム解析の結果と共に議論したい. 158

1. 背景 1.1 発酵食品と微生物漬物は日本の伝統的な発酵食品であり, 米糖に含まれる麹や乳酸菌が主にデンプンやタンパク質を分解し, 糖分や乳酸が生成されていると考えられているが, 野菜の種類や地域の違いによって様々な製法が存在し, 味の違いも大きい. 昔は各家庭で日常的に漬物をっけて食しており, それだけ古くから日本人に親しまれた発酵食品であると言える.

3 1. 背景 1.1 発酵食品と微生物漬物は日本の伝統的な発酵食品であり, 米糖に含まれる麹や乳酸菌が主にデンプンやタンパク質を分解し, 糖分や乳酸が生成されていると考えられているが, 野菜の種類や地域の違いによって様々な製法が存在し, 味の違いも大きい. 昔は各家庭で日常的に漬物をっけて食しており, それだけ古くから日本人に親しまれた発酵食品であると言える. しかし漬物においてはその発酵の詳しい仕組みは明らかになっていない. J u n g らによって行われたキムチのメタゲノム解析では, 発酵が進むにつれてシークエンスされた配列のコピー数は増え, それとともに乳酸, 酢酸, マニトールの濃度が上昇していることが報告されている [ 1. この時優位な細菌はム ^ 〇 6 〇〇 7/ 奶, 肠如 e//aなどであった. このことから, 乳酸菌が漬物の発酵において主な働きをになっていることは間違いないを言える. 漬物以外の日本の伝統的な発酵技術では, 味噌, 醤油, など様々な発酵食品の研究がなされているが [2], 日本酒の発酵の研究も多くなされている [ 3 ]. 味噌や醤油などは大豆の発酵であるのに対し, 日本酒は米の発酵であるが, その日本酒の発酵過程においては乳酸菌が製造の暖気入れと呼ばれる工程で増殖し, 発酵が進むと作られた乳酸菌によって産生が強くなり, 乳酸の増殖が弱り始める. そこで酵母を添加し, その生成するアルコールによってさらに乳酸菌は減っていく, という発酵のメカニズムが知られている. このように発酵が進むに連れて細菌叢が変化しており, その影響で食品の成分も大きく変化している. このことから発酵食品の味や香りにも微生物細菌叢が重要な役割をになっている事がわかる S rrna クローンライブラリー解析 1 6 S r R N A クローンライブラリ一法は次世代シーケンサーを用いて行う微生物叢解析において主流の手法である. 本手法の最大の利点は培養を介さずにサンプルに含まれる微生物を推定することが出来るという点である. この手法により, 非常に多くの難培養性微生物についても解析対象とすることができる. 1 6 S r R N A クローンライブラリ一法ではサンプルからD N A を抽出後,D N A の 1 6 S r R N A 遺伝子 (1 6 S r D N A ) の一部を P C R によって増幅し, それをクローニングしたあと配列を解読することでサンプル中の微生物群衆の解析し推定を行う [ 4 ]. 16S s R N A の配列は非常に保存性が高く, 難培養性の微生物も含めた広範囲の生物において共通のプライマーの作成が可能である [ 1 0 ]. そのため 16S r D N A は生物種の同定や進化系統分析にも頻繁に使われているが, この 16S r D N A クローンラーブラリー法により難培養性の微生物も含めた環境サンプル中の微生物叢を正確に知る事が可能になる. 本研究では他機種に比べて長いリードを得ることが出来るという理由から R o c h e 社製 G S J r を用いてシークエンシングが行われている. この手法ではサンプル中に含まれる細菌を網羅的に推定することができ, その細菌叢を観察するのに適している. その一方でサンプルに含まれる細菌の絶対数はわからないという問題点がある. しかし発酵過程の観察においては細菌数がどのように変化しているのかという点は非常に重要であり, 細菌数の変化を考慮しないで発酵過程にっいて考察することは難しい. そこで本研究では沢庵漬けの発酵過程において細菌数がどのように変化していくのかをR e a l T i m e P C R (R T -P C R ) を用いて定量的に観察することで, 実際に発酵がどのように進んでいるのかを考察した. 2. 対象と手法 2.1 対象 159

4 山形県鶴岡市の月山パイロットファームでは沢庵など漬物を中心に野菜の発酵食品を製造している. 本研究で発酵させる時間または空間的違いにより生じる細菌叢の特徴を探ることを目的に, 野菜の発酵食品の 16S r R N A クローンライブラリー解析を行った. 解析対象としたのは大根沢庵の本漬けから0, 1,2,3,8,9,1 0,1 1,1 2 ヶ月間経過した沢庵である. T a b l e 1. 本解析に用いた各サンプルの詳細 Position I v r m e m a n o n 〇〇 :<^1 S i m p l e 0 M 純供 0.25 I M B i» M 一 J S 0,25 ハ.1 ^ ^ i!!.!.:.;? 0.25 乂 : 一 U 2 J 2» J 沾! 9 M , ^ , i l i l l :! ^ U 2 J J 0 J 0 _1_ 丨!1 1:3 丨議議 _ 画! I M : 一 J I2 J I.2? 0 J 一 J J J 2. 3 シークェンスデータの系統解析シークェンスデ一夕のクオリティ値の評価などの配列選択や,O T U 作成, アラインメント, 及び配列の分類には, 配列解析の統合ソフトである Q iim e (h ttp ;// q iim _e_,o r g ) を用いた [6 ]. F ig 1 に示すのは行った配列処理のフローチャートであるまず始めに, プライマー及び各サンプルごとに付けられたタグ配列の認識, すべてのシークェンスデータのクオリティチヱック及び短い配列を行うクオリティー値は最低スコアを2 5 とし, また長さが2 0 0 b p 以下の配列はすべて取り除いた. O T U 作成においては,U C L U S T のアルゴリズムを用いて [7 ], 配列類似性のスレッシュホールドはとした. アラインメントにはアラインメントツールであるP y N A S T を用いた [8]. これはテンプレートとなる配列をデ一夕セットから選び, そのテンプレート配列に対してすベての配列でペアワイズアラインメントをとっていく手法である. テンプレートのデ一夕セットにはg re e n g e n e s (h ttp :/ / g re e n g e n e s.lb l,g o v ) を用 V ゝ [9], ペアワイズアラインメントにはu c lu s tのアルゴリズムを用いた. O T U の系統分類には,R D P の C la s s ifie rを用いた [ 1 0 ]. なおこの時, 配列の類似性が 9 7 % 以上のものを分類できたとした. F ig 1 バクテリアの系統解析のフローチャート 160

5 3 結果と考察 3.1 バクテリアの系統 _ F ig 2 は作成した O T U を門レベルで分類した結果示している. 既存のデータベースとの類似性が 9 7 % 以上のもののみを分類できたとみなし, それ未満のものは O th e r の後に門以上のレベルで分類できている結果を示した. 分類できたものの内, 割合の多い 1 5 門を色分けし, その他の全体に占める割合が少ないものは O T H E R としてまとめた. バクテリアの系統解析において,0-3 ヶ月のサンプルで没の存在が多く確認された. これはバクテリアではなく, 広義の緑色植物の分類群である. バクテリアのシークェンスをしているにも関わらず ; 植物の D N A が検出された理由としては, 発酵初期段階においてはまだバクテリアが増殖しておらず ; そのD N A 量が少ないために, 米ぬかのD N A が混入しX L まっナこのではないかh 考えられる. まナこ Cyanobacteria, Chlorvplast,Chroococcales も少量ではあるが分類されている. これらに関しても同様に米ぬか D N A の混入により観察されたのではないかと考えられるそのためこの図から, Straptophyta,Cyanobacteria,Chloroplast, Chroococcales <0 べつの分摄卷を取り除いて同様に積み上げグラフを作成した. グラフから, すべてのサンプルにおいて全体の 9 0 % 以上を分類できている事がわかる. この結果から 0 M から 1 2 M までの最初の 1 年間の発酵では, 細菌叢の変化が多く見られ,2 年や 3 年の長期発酵ではあまり大きな細菌叢の変化が見られないという結果を得た. ム妨〇んぬ 7/a/ がは 0 M 時点ではほとんど存在していないが, 1 ヶ月たった 1 M のサンプルでは急激にその割合が増えており既に優占している. このことから乳酸菌は沢庵漬けの発酵において重要な役割を担っていることが予想される. 発酵の後半段階である 1 1 M 以降ではまたその割合は減少しており, 逆にがの割合が増加している. は海洋性の好塩菌であり, 通常食品から検出はされない. 以上のことから Lactobacilkdes と OseanosDirillales の 2 点に注百 'L X 解析を行っナこ. 100% 90% i'.w 欲 OTHER ::SjMinlsj^aerates BuHdK>ldef1a!es ^ Pseudomonadaies ^ Acttnomycetates ^ Flavobaderiates :s Rhfeoblales 30% 20% I f I I I* f l f ^ I l l l l ^ Sphingomonada)e$ ^ Atterom<mddates ^ Ent*M*obacleriales ^ Other^Sacterta 10% " 和 0% 私 XQ ax 12 to% tx% u 12 嫌 BaciHales ^Oceanospirilbles 嫌 Uctobadliates 雠 Other-Unclassified A B Fig 2. 各サンプルごとにバクテリアの OTU を門レベルで分類した推定結果から Straptophyta,Cyanobacteria,Chloroplaist, Chroococcales を取 ^) 餘いナこもの割合の多い上位 15 の分類群を色分けし, その他の分類群は OTHER としてまとめた. 161

6 3. 2 発酵過程における乳酸菌の変化 F ig 2 からわかるように, 乳酸菌 ( ム妨 0 み a d / t o M は発酵開始から 1 ヶ月で既に優占種となっているが実際にその細菌数が増加しているかは確かめられない. そのため R T -P C R を用いて細菌数の定量を行い, さらにム妨〇 6 奶 7 ゎ / がを属レベルで分類した ( F i g 3 ). グラフから乳酸菌の細菌数は発酵開始から8 ヶ,9 月目までに急激に増えており, 逆にそれ以降は減少していることがわかる. また発酵開始から3 ヶ月目まではZewcowo 伽 cge/zwwwやなどが優占種となっているのに対し,8 ヶ月目以降では JPediococcus inopinatus や Lactobacillus melefermentans が優占種となり, 細菌種の入れ替わりが起き X いる. ma/ が rm e n to ra はへテロ発酵を行う乳酸菌であり, ビールのから単離されている [ 1 3 ]. ム加 ftadz/ws 伯たd もへテロ発酵を行う乳酸菌であり, ヨーロッパでは古くからソーセージの製造や精肉の保存に利用されている [1 4. Je/ftrwecた /z はヨーグルトなどの発酵に頻繁に使われる乳酸菌であり, ホモ乳酸発酵を行う [ 15. また i^cto6ac///w1s か / 以 /vonm s ヘテロ発酵を行い, アルコール強いことで知られている. そのため日本酒などに入り込むと酸イ匕を起こし濁りや臭みを生じさせる [1 6. また味噌やケチャップにもコン夕ミすることで腐敗を起こすとされている [1 7. またと同様に尸汉 /iococcwsも8 ヶ月経過以降のサンプルでは安定して多く観察されされている. Peぷ0⑶ はグラム陽性の四連球菌であり, 乳酸の他にC 0 2, アルコール, 酢酸などの副産物を多量につくるへテロ発酵を行う細菌属である. また複数の属の細菌種が乳酸のラセミ体 (D L 体 ) を発酵することでも知られている [ 1 8 ] [ 1 9 ]. 乳酸菌のラセミ体は融点が低く, 常温でも粘り気があるのが特徴である. 今回発見された /W/OCOCCMS /«0/W>2<3 加はビールから単離されており [2 0, この細菌が発酵途中のビールにコンタミするとジアセチルの濃度が高くなり, 香りが損なわれることが知られている [ 2 1 ]. ジアセルはバターやチーズの匂いの元になっている物質であり, これがキユウリの漬物では感じないような沢庵独特の香りを作っていると考えられる. さらに8 ヶ月以降のサンプルで次に多く観察されているのが ^ である. は海洋中や夕イ料涅のカピと呼ばれる小ェビの塩漬けから見つかっている耐塩性の乳酸菌である. このように乳酸菌の種類や増減が沢庵漬けの発酵過程, 及び味を決定づけるのに重要な役割を果たしている可能性が高いことが示された. 162

7 は obadhaceae Leuconostocaceae lactococcos WeisseHd Leuconostoc ' f_leuconostocaceae 凝 Pediococcus Lactobacillus 纖 Othe し Lactobacil 丨 aceae ^Tetragenococcus 雜 Enterococcus ^ Other^Enterocoaaceae Carnobacteiium arinitactibaciltus ^Alkaiibaaerium o laaobaciilales ^ Other_laa 〇 bacillales A B F ig 3. 各サンプルごとにム actofeaczy/a/es の O T U を属レベルで分類した推定結果に R T -P C R によって得られた細菌数を反映させた. 3.3 Oseanospinllales 先程も述べたように, O 從門の細菌は海洋性の好塩菌であり, 通常は食品からは検出されない. そこで啊 >/ 此 / 烈門の細菌がサンプル中で増えている生物学的意味を探るため, 乳酸菌と同様に1 0 ^ 1 1 を用いて細菌数の定量を行った奶 8 4 ). その結果, ひ^ «〇 ^>77 仏 / 以門の細菌は11 ヶ月目, もしくは 12 ヶ月目以降に急激にその細菌数を増やしていることがわかった. (91sea«〇 1s'/?z>///a/e1s 門の細菌のほとんどが MaWwomowos 属であることがわかった. MaWwomoms 属の細菌には, 抗菌作用を持つものも知られており [20], 沢庵漬けの後期の発酵において他の細菌の増殖を抑える役割を果たしている可能性がある E E ^ E+08 観 P E E E+00 y g-jviarinwnonas ^ Other g Kushneria Halomonas ^ ghaererehalobacter ^g«jcc^>etia 級 g 一 Chromohalobacter 鑛級 Other 纖 g 一和 canivorax 鑛 Other Fig 3. 各サンプルごとに Creams/? か ///a fes の O T U を属レベルで分類した推定結果に R T -P C R によって得られた細菌数を反映させた. 163

Acknowledgements 本研究においてデ一夕を取るための実験を行ってくださりまた解析においても多くの適切なアドバイスを下さった中東憲治氏に厚く御礼申し上げますまたこのような研究の場を与えてくださつた冨田勝教授に深く感謝いたしますありがとうございました参考文献 1. Ju n g,y,j., L e e,h?s., et al (2 0 11 ) M etagenom ic A n a lysis o f K im c h i,a Traditional K orean Ferm ented Food.

8 Acknowledgements 本研究においてデ一夕を取るための実験を行ってくださりまた解析においても多くの適切なアドバイスを下さった中東憲治氏に厚く御礼申し上げますまたこのような研究の場を与えてくださつた冨田勝教授に深く感謝いたしますありがとうございました参考文献 1. Ju n g,y,j., L e e,h?s., et al ( ) M etagenom ic A n a lysis o f K im c h i,a Traditional K orean Ferm ented Food. Appl. Environ. Microbiol. 77(7), C io u,y,y,r o b in., and C h e n g,l,s. ( ) isoflavone Transform ation during Soybean K o ji Preparation and Subsequent M is o Ferm entation Supplemented w ith Ethanol and N a C l.j. Agric. Food Chem. 49, Le roy, Frederic, and V u y s t,d,l u c. ( ) La ctic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Trends in Food Science & Technology 15, F u jim o to J. and F u k u ji JVI., ( ) A nalysis if H u m a n Intestinal R o ra -1 6 S r D N A -C lo n e Lib ra ry Intestinal Microbiology, 1 9, M u y z e r,g., D e W a a l,c,e., ef a/ ( ) P ro filing o f C o m p le x M icro b ia l Populations b y D enaturing Gradient G e l Electrophoresis A nalysis o f Polym erase C h a in R e a ction-a m p lified Genes C o d in g for 16S r R N A. Appl. Environ. Microbiol. 5 0 (3), C ap ora so,g,j., K u czyn sk i,j., et al ( ) Q I I M E allow s analysis o f h ig h - throughput com m unity sequencing data. Nature Methods. 7 (5 ), E d g a r,c,r. ( ) Search and clustering orders o f m agnitude faster than B L A S T. Bioinformatics. 26(19), C ap ora so,g,j., B ittin ger,k., et al ( ) P y N A S T : a flexible tool for aligning sequences to a template alignm ent. Bioinformatics. 2 6 (2 ), D e S a n tis,z,t., H ugenholtz,p., e ta l ( ) Greengenes, a C him era -C hecked 16S r R N A Gene Database and W orkbench C om patible w ith A R B. ^4/?/?/. Environ. Microbiol. 7 2 (6 ), W a n g,q., G a rrity,m,g., et al ( ) N a ive Bayesian Classifier for Rapid A ssignm ent o f r R N A Sequences into the N e w Bacterial Taxonom y. A ppl Environ. Microbiol. 7 3 (16), R o m a n e n k o,a,l., Tanaka,N. and F ro lo v a,m,g. (2009J Marinomonas arenicola sp. nov., isolated from m arine sediment. International Journal o f Systematic and Evolutionary Microbiology. 59, L u c a s -E l io,p., G o m e z,d., et al ( ) Th e A n tim icro b ia l A c tiv ity o f M arinocine, Synthesized by Marinomonas mediterranean Is D u e to H yd ro g e n Peroxide Generated by Its Lysine Oxidase A ctivity. American Society fo r Microbiology. 118(7), R ussell,c. and W a lk e r,k,t. ( ) Lactobacillus malefermentans n.sp., Isolated from Beer. Journal o f the Society fo r General Microbiology. 8, Jones,J,R., H u s s e in,m,h., et al ( ) Isolation o f lactic acid bacteria w ith inhibitory activity against pathogens and spoilage organisms associated w ith fresh meat. Food Microbiology. 25, John,P,R N a m p o o th iri,m. and Pandey,A. ( ) Solid-state fermentation for L -la c tic a d d production from agro wastes using Lactobacillus delbrueckn. Process Biochemistry. 4, S u zu k i,k., A sa n o,s., et al ( ) Sake and B e er Spoilage La ctic A c id Bacteria. Journal o f the Institute o f Brewing. 114(3), B jo rk ro th,k., Johanna; Korkeala, H annu J. ( ) Lactobacillus Jructivorans Spoilage o f Tom ato Ketchup. Journal o f Food Protection. 6 0 (5 ), G o rd o n,l,g. and D o e lle,w,h. ( ) Production o f Racem ic Lactic A c id in Pediococcus cerevisiae Cultures by T w o Lactate Dehydrogenases. Journal o f Bacteriology. 121(2), H a g g s tro m,h,m., A n d e rson,e-, et al ( ) Production o f L - A N D D -lactate b y Pediococcuspentosaceus in batch and steady-state continuous culture. Appl. Environ. Microbiol. 5 2 (1),

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Powered by TCPDF ( Title 明治以前日本水害史年表 Sub Title A chronological table of flood disasters before Meiji era in Japan Author 高木, 勇夫 (Takagi,

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