XM と併用し高感度な DSA 検出法として FCXM- した cold 生理食塩水でリンパ球を洗浄後 flow IgG を導入した全米臓器共有ネットワーク United cytometer FACS Calibur Becton, Dickinson and Network for Organ

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まいかおいもり
5 years ago
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1 技術論文腎臓移植におけるヒトリンパ球を使用した高感度クロスマッチ検査の検討小林悠梨 1) 岩藤和宏 2) 石塚敏 1) 中島一朗 2) 安尾美年子 1) 渕之上昌平 2) 1) 東京女子医科大学中央検査部移植関連検査室 ) 東京女子医科大学腎臓外科要三浦ひとみ 1) 東京都新宿区河田町 8-1 旨臓器移植では液性拒絶反応の免疫学的評価としてドナー特異的抗 HLA 抗体 donor-specific HLA antibodies; DSA を検出することが重要であると考えられている本研究では flow cytometry lymphocyte crossmatch-igg test FCXM-IgG 検査法および解析法の統一化に向けた基礎的検討を行った東京女子医科大学腎臓外科に外来受診された生体腎臓移植希望患者 78 症例とドナーリンパ球を使用し FCXM-IgG と LABScreen single-igg を測定した FCXM-IgG と LABScreen single-igg nmfi の比較ではとにおいて Tcell Bcell-IgG 共に相関係数およそ.8 と良好であった本研究の結果から LABScreen single-igg で検出される natural antibody などの影響も推測されたが本研究において良好な相関性が得られたことによりそれぞれの蛍光強度から近似曲線を作成し定量評価できる可能性が期待されるキーワード組織適合性抗原ドナー特異的抗 HLA 抗体リンパ球細胞傷害性試験フローサイトメトリークロスマッチ検査 HLA 特異性抗体検査近年ではヒトリンパ球を使用しない精製 HLA はじめに分子を Class I II に分けて結合させた合成ビーズ法 bead-based assay 5 ) が開発され FCXM-IgG と同様の臓器移植では液性拒絶反応の免疫学的評価とし DSA が検出できる検査法として普及してきているてドナー特異的抗 HLA 抗体 donor-specific HLA しかしこの方法では DSA と同時に natural antibodies; DSA を検出することが重要であると考 antibody 6) 8)も検出される可能性があるまたヒトえられているリンパ球から抽出した HLA 抗原を Class I II に分け DSA 検出法にはヒトリンパ球を使用した細胞て合成ビーズに結合した cell-based assay と bead- 傷害性試験 lymphocyte cytotoxicity crossmatch; LCT- based assay とを組み合わせた immunocomplex capture XM や flow cytometry lymphocyte crossmatch-igg fluorescence analysis ICFA 法 9)が新たに開発され test FCXM-IgG 4)などがあるこの方法も FCXM-IgG と同様の DSA が検出できる 1) 2 ), 3 ) LCT-XM は補体結合性のある DSA を検出する方検査法であるしかし白血球上の HLA 抗原は locus 法であるが FCXM-IgG は補体結合性の有無に関わによって発現量が異なるためビーズに対して HLA らず DSA を検出できる方法であるしかしこの 2 抗原が capture されない可能性がある 1) 法では自己抗体などの免疫グロブリンも検出される 214 年 4 月より日本臓器移植ネットワークでは膵臓腎臓におけるレシピエント選定基準に LCT- 可能性がある平成 27 年 2 月 2 日受付平成 27 年 11 月 25 日受理 7 小林他腎臓移植におけるヒトリンパ球を使用した高感度クロスマッチ検査の検討

2 XM と併用し高感度な DSA 検出法として FCXM- した cold 生理食塩水でリンパ球を洗浄後 flow IgG を導入した全米臓器共有ネットワーク United cytometer FACS Calibur Becton, Dickinson and Network for Organ Sharing; UNOS 11)においても従来 Company にて測定した法に加えより高感度な検査法を併用することを推 1 ドナー候補リンパ球の Protease 処理の有無およ奨しているびリンパ球数と血清量の検討しかし FCXM-IgG は国内でも未だ検査法が統アメリカ組織適合性学会 American Society for 一化されておらず導入している施設も少ないのが現 Histocompatibility and Immunogenetics の検査マニュ状であるアル ASHI Laboratory Manual 12)に準じた Protease そこで今回筆者らは FCXM-IgG 検査法および解 Type XIV Sigma Chemical, St. Louis, Mo, United 析法の統一化に向けた基礎的検討を行ったので報告 States 未処理リンパ球 5 15 個 3 μl と血清する量 3 μl を基準 I としそれぞれ血清量 1 μl と Protease 未処理 II および処理リンパ球 III I 対象および方法 5 15 個 1 μl による 3 群について検討を行った対象は東京女子医科大学腎臓外科に外来受診さ 2 FCXM-IgG 解析法の検討れた生体腎臓移植希望患者のうち同意を得た 78 名 anti-human IgG を Linear (log) values median 慢性腎不全患者男性 34 名女性 44 名平均年齢 fluorescence intencity MFI および MFI 49.5 ± 標準偏差 13.1 の患者血清とドナー候補リンにて解析を行ったまた可溶性蛍光色素分子等量パ球および血清を使用した Molecules of equivalent soluble fluorochrome 方法はドナー候補血液から DNA を抽出し Quantum FITC-5 (Premix), Bangs Laboratory, LABType HD One Lambda, Canoga Park, CA の HLA- Fishers, IN についても解析した 13) A B C DRB1 DQB1 Locus キットを使用し HLA 3 最低検出感度の検討対立遺伝子を測定したまた FCXM-IgG の基礎的 LABScreen-IgG で検出した抗 HLA 抗体 B*7:2 検討には比較対照として LABScreen Single Antigen 陽性血清 normalized mean fluorescence intencity IgG Test LABScreen single-igg, One Lambda, Canoga nmfi を 16 倍から 1,24 倍まで市販 AB 型 Park, CA を用いたヒト血清で希釈し anti human IgG-FITC を Linear 1 flow cytometry lymphocyte crossmatch-igg test values およびにてそれぞれ n = 2 ドナー候補ヘパリン加末梢血液から RosetteSep mean ± 2.6 法において重ならないポイントを最低 HLA Human Total Lymphocyte StemCell Technol- 検出感度とした ogies や Ficoll 比重遠心法によりリンパ球を分離 4 FCXM-IgG Cut-off 値の検討ドナー候補血清および抗 HLA 抗体陰性患者血清したドナー候補血清市販 AB 型血清 Sigma-Aldrich, n = 35 について anti-human IgG をおよ St. Louis, MO, United States 抗 HLA 抗体陽性血清びにて ASHI Laboratory Manual 1)に準患者血清 1 μl にそれぞれドナー候補リンパ球 5. じてそれぞれ mean + 3. 法により Cut-off 値を設 15 個 1 μl を加え室温 3 分静置反応した定した cold 生理食塩水でリンパ球を洗浄後 fluorescein- 2 LABScreen Single Antigen IgG Test IgG LABScreen single Class I Class II Beads にそれぞれ Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, 陰性コントロール血清および患者血清を加え室温 3 Penn, United States Peridinin chlorophyll protein (Per- 分反応させる 3 回洗浄後 anti-human IgG-PE を加 CP)-conjugatedanti-CD3 および phycoerythrin (PE)- え遮光室温 3 分反応後 2 回洗浄して LABScan1 isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-human conjugated anti-cd19 Becton Dickinson, San Jose, One Lambda, Canoga Park, CA にて測定した Calif, United States を加え 4 遮光 2 分静置反応医学検査 Vol.65 No

3 1 LABScreen single-igg と FCXM-IgG の比較検討 values の MFI が高く約 5 付近でと患者血清 78 検体について抗 HLA 抗体をの MFI 値が逆転現象を認めたまた LABScreen single-igg で測定しそれぞれの検体におとを単位に演算ける陽性 DSA nmfi を合計した蛍光強度と FCXM- することによりデータがほぼ一致していた IgG MFI および FCXM-IgG の比較検討を行っ Figure 2 た 3 最低検出感度の検討抗 HLA 抗体 B*7:2 陽性血清を希釈し n = 2 II 結果 mean ± 2.6 法で解析した結果 FCXM Tcell-IgG ではと共に LABScreen- 1 flow cytometry lymphocyte crossmatch-igg test IgG において 256 倍希釈 84 nmfi まで抗体検出 1 ドナー候補リンパ球の Protease 処理の有無およが可能であったまた FCXM Bcell-IgG においてもびリンパ球数と血清量の検討と共に LABScreen-IgG FCXM Tcell-IgG の抗 HLA 抗体陽性血清ではにおいて 256 倍希釈 84 nmfi まで抗体検出が可能であった Table 1 III の条件において MFI であり I の MFI よりも反応性が良好であったまた 4 FCXM-IgG Cut-off 値の検討 FCXM Bcell-IgG の市販 AB 型血清では II に比べドナー候補血清および抗 HLA 抗体 DSA 陰性患者 III の条件において非特異的な反応が抑えられてい血清 n = 35 をそれぞれ mean + 3. 法で解析した結た Figure 1 果 anti-human IgG のでは Tcell Bcell- 2 FCXM-IgG 解析法の検討 IgG 共に -NC でおよそ 1 以下 Ratio 比では FCXM Tcell Bcell-IgG 共に MFI が高値領域にお /NC でおよそ 2. 以下であったまた Channel いて anti-human IgG のよりも Linear values では FCXM Tcell Bcell-IgG 共に -NC FCXM Tcell-IgG FCXM Bcell-IgG 市販AB型血清市販AB型血清 FL1-H::Anti-Human IgG FITC 14 Median Count Count Median FL1-H::Anti-Human IgG FITC 14 (Ⅰ) (Ⅱ) (Ⅲ) 抗HLA抗体陽性血清 1 Median Count Median Count 抗HLA抗体陽性血清 FL1-H::Anti-Human IgG FITC FL1-H::Anti-Human IgG FITC 14 Figure 1 ドナー候補リンパ球の Protease 処理の有無およびリンパ球数と血清量の検討 I Protease 未処理リンパ球 5 15 個 3 μl と血清量 3 μl ASHI Laboratory Manual II Protease 未処理リンパ球 5 15 個 1 μl と血清量 1 μl III Protease 処理リンパ球 5 15 個 1 μl と血清量 1 μl 72 小林他腎臓移植におけるヒトリンパ球を使用した高感度クロスマッチ検査の検討

4 FCXM Tcell-IgG 8 1, 8 MFI MFI 抗HLA抗体陽性血清希釈倍率抗HLA抗体陽性血清希釈倍率 25, 2, , 1, 5, Figure 2 FCXM Bcell-IgG 抗HLA抗体陽性血清希釈倍率 35, 3, 25, 2, 15, 1, 5, log values 抗HLA抗体陽性血清希釈倍率 FCXM-IgG 解析法の検討 Table 1 FCXM-IgG 最低検出感度の検討 FCXM Tcell-IgG LABScreen-IgG B*7:2 FCXM Bcell-IgG 1, LABScreen-IgG B*7:2 1, n = ,24 n = ,24 CV % CV % m m m m 最低検出感度最低検出感度 FCXM Tcell-IgG LABScreen-IgG B*7:2 n = FCXM Bcell-IgG 1, m m n = , , CV % m m 2.6 最低検出感度医学検査 Vol.65 No LABScreen-IgG B*7: , CV % 最低検出感度 73

5 Table 2 FCXM-IgG Cut-off 値の検討 n = 35 CD3 NC /NC CD19 NC /NC NC CV % , , NC , ,44 1, , 959 2,41 3, ,896 1, , ,345 1,11 4,235 7, ,982 2, ,962 m ,288 4,37 1, ,75 6,96 2,265 /NC CD19 NC /NC NC NC CD3 NC CV % , , , ,439 1, , ,24 3, ,898 1, , ,338 1,19 4,228 7, ,945 2, ,933 m ,291 4,34 1, ,749 6,8 2,256 でおよそ 1 以下 Ratio 比では /NC でおよ Bcell-IgG のが r =.846 そ 1.5 以下であった Table 2 が r =.879 であった Figure 3 LABScreen single-igg nmfi と FCXM-IgG 2 LABScreen Single Antigen IgG Test 1 LABScreen single-igg と FCXM-IgG の比較検討の比較ではとにおいて LABScreen single-igg nmfi と FCXM-IgG MFI の共にほぼ一致した結果であり FCXM Tcell-IgG が比較では FCXM Tcell-IgG のが r = r =.87 FCXM Bcell-IgG が r =.836 であった 1, 8, 6, 4, 2, 16, 14, 12, 1, 8, 6, 4, 2, Figure , r.875 1, 2, FCXM Tcell-IgG MFI 3, r.846 1, 2, 3, FCXM Bcell-IgG MFI 4, LABScreen IgG ClassⅠnMFI 14, Figure 4 LABScreen IgG ClassⅠ/ⅡnMFI LABScreen IgG ClassⅠ/ⅡnMFI LABScreen IgG ClassⅠnMFI.875 が r =.849 であり FCXM 14, 12, 1, 8, 6, 4, 2, r , 14, 12, 1, 8, 6, 4, 2, 2 4 FCXM Tcell-IgG MFI 6 r FCXM Bcell-IgG MFI 6 LABScreen single-igg nmfi と FCXM-IgG MFI の比較 n = 78 小林他腎臓移植におけるヒトリンパ球を使用した高感度クロスマッチ検査の検討

6 1, 8, 6, 4, 2, r.87 16, 14, 12, 1, 8, 6, 4, 2, Figure 4 5, 1,, FCXM Tcell-IgG r.836 5, 1,, FCXM Bcell-IgG 1,5, LABScreen IgG ClassⅠnMFI 12, 14, 12, 1, LABScreen IgG ClassⅠ/ⅡnMFI LABScreen IgG ClassⅠnMFI LABScreen IgG ClassⅠ/ⅡnMFI 14, 8, 6, 4, 2, r.87 16, 14, 12, 1, 8, 6, 4, 2, 5, FCXM Tcell-IgG 1,, r.836 5, 1,, 1,5, FCXM Bcell-IgG LABScreen single-igg nmfi と FCXM-IgG の比較 n = 78 がると考えられる患者血清 78 検体において FCXM III 考察 Bcell-IgG と LCT-XM Bcell warm とは陽性一致率 61.9%であったがこれは検出感度ではなく補体当院では 1996 年頃から FCXM-IgG の基礎的検討結合性のある DSA 有無の問題と考えられるを重ね 2 年頃より検査導入を開始している 14) そ FCXM-IgG 解析法について flow cytometer FACS して腎臓移植に使用される新しい免疫抑制剤の導 Calibur のは 1,24 は入により検査法自体に非特異的な反応を示す薬剤も 1, の scale range である海外では anti-human 確認され徐々に検査法の改良を加えてきた 15) IgG の解析法を導入している施設が本研究ではまず FCXM-IgG 測定条件として日多いようであるのに対し国内では解常精度管理に使用している CaliBRITE Beads をすべ析法が主流であるそして近年では anti-human IgG ての初期設定値とし測定結果に測定技師の主観がのおよびを単位影響しないようにしたに演算することにより測定閾値直線性機器間なこの測定条件において ASHI Laboratory Manual 12) に準じた方法を基準としドナー候補リンパ球のどによる測定結果を統一化した定量比較を可能にする単位として導入が検討されてきている Protease 処理の有無およびリンパ球数と血清量につ ASHI Laboratory Manual 1)では解いて検討した結果 Protease 処理したリンパ球では析法のみ記載されているため筆者らは同一条件 Bcell に対する Fcγ レセプターなどの非特異的な反応における anti-human IgG のおよびが抑制され 16) Tcell に対する抗 HLA 抗体陽性血清解析法について検討した結果 Linear の反応性も本研究では良好であったしかし Protease values と解析法で FCXM Tcell Bcell- 処理に関して偽陽性反応が生じる可能性を懸念する IgG 共に約 5 付近で結果に逆転現象が生じること報告文献 17)もあり未だ統一した見解は得られていなを確認したこの逆転現象に伴い特に /NC いまた血清量に対してリンパ球数の少ない割合比など Cut-off 値の設定において大きく結果に影響をにおいて反応性が良好であり検出感度の向上に繋及ぼすことを証明し筆者らはこの現象についてそ医学検査 Vol.65 No

7 れぞれの scale range の違いが要因であると推察したしかしそれぞれを単位に演算することによりほぼ一致した解析結果が得られることも同時に証明したまた本研究での測定条件において得られた解析結果は Bray 18)の報告と概ね一致した結果でもあったそして比較対照として用いた LABScreen singleigg nmfi と FCXM-IgG を比較した結果 FCXM-IgG で検出される自己抗体などの免疫グロブリンや LABScreen single-igg で検出される natural antibody 6) 8)などの影響も推測されたが本研究において良好な相関性が得られたことによりそれぞれの蛍光強度から近似曲線を作成し定量評価できる可能性が期待される最後に FCXM-IgG 最低検出感度の検討では LABScreen-IgG の Cut-off を 5 nmfi から 1, nmfi の範囲で設定している施設が多いようであるが mean ± 2.6 法において FCXM Tcell Bcell-IgG 共に LABScreen-IgG と比較すると 84 nmfi まで抗体検出が可能であったこの結果から臨床上必要な検出感度が十分得られた高感度クロスマッチ検査法であると示唆されるが抗 HLA 抗体以外の免疫グロブリンなどヒトリンパ球に対する特異性については今後基礎的な追加検討が必要であると考える IV 結語 FCXM-IgG はヒトリンパ球を使用した高感度な DSA 検出法として今後検査法および解析法を統一化することにより国内でも普及していくと思われるなお本論文は 214 年 5 月開催の第 63 回日本臨床検査学会にて発表した文献 1) 石塚敏臓器移植における HLA 抗体検査について日本組織適合性学会 213; 2: ) Terasaki PI, Mcclelland JD: Microdroplet assay of human serum cytotoxins, Nature, 1964; 24: ) Patel R, Terasaki PI: Significance of the positive crossmatch test in kidney transplantation, N Engl J Med, 1969; 28: ) Lobo PI et al.: The use of pronase-digested human leukocytes to improve specificity of the flow cytometric crossmatch, Transplant International, 1995; 8: ) Tait BD et al.: Review article: Luminex technology for HLA antibody detection in organ transplantation, Nephrology (Carlton), 29; 14: ) Morales-Buenrostro LE et al.: Natural human leukocyte antigen antibodies found in nonalloimmunized healthy males, Transplantation, 28; 86: ) El-Awar N et al. Epitopes of HLA antibodies found in sera of normal healthy males and cord blood, Clinical Transplants, 28; ) El-Awar N et al.: Epitopes of human leukocyte antigen class I antibodies found in sera of normal healthy males and cord blood, Human Immunology, 29; 7: ) Fujiwara K, et al.: Application of bead array technology to simultaneous detection of human leucocyte antigen and human platelet antigen antigen antibodies, Vox Sang, 29; 96: ) 矢澤浩治他リンパ球クロスマッチにおける immunocomplex capture fluorescence analysis ICFA の有用性についての検討移植 213; 48: ) United Network for Organ Sharing (UNOS). Guidelines. Updated June 25, 24. Accessed September 23, ) ASHI Laboratory Manual, 4th Edition. 13) Schwartz A et al.: Formalization of the unit of fluorescence intensity, Cytometry Part B: Clinical Cytometry, 24; 57: ) Abe M et al.: Postoperative production of anti-donor antibody and chronic rejection in renal transplantation, Transplantation, 1997; 63: ) 石塚敏他リツキシマブを投与した症例におけるプロテアーゼ処理フローサイトメトリークロスマッチテストの検討移植 27; 42: ) Lobo PI et al.: Improved specificity and sensitivity when using pronase-digested lymphocytes to perform flow-cytometric crossmatch prior to renal transplantation, Transplant International, 22; 15: ) Hetrick SJ et al.: Impact of pronase on flow cytometric crossmatch outcome, Hum Immunol, 211; 72: ) Bray RA: Lymphocyte crossmatching by flow cytometry, Methods in Molecular Biology, 213; 134: 本論文に関連し開示すべき COI 状態にある企業等はありません 76 小林他腎臓移植におけるヒトリンパ球を使用した高感度クロスマッチ検査の検討

8 Technical Article A novel procedure of flow cytometry lymphocyte crossmatch test with high sensitivity using human lymphocytes in renal transplantation Yuri KOBAYASHI 1) Tsutomu ISHIZUKA 1) Mineko YASUO 1) Hitomi MIURA 1) Kazuhiro IWADOH 2) Ichiro NAKAJIMA 2) Shohei FUCHINOUE 2) 1) Division of Transplant Immunology, Central Clinical Laboratories, Tokyo Women s Medical University (8-1, Kawada-cho, Shinjuku-ku, Tokyo , Japan) 2) Department of Surgery, Kidney Center, Tokyo Women s Medical University Summary In renal transplantation, it is immunologically critical to detect donor-specific HLA antibodies (DSA) at a highly sensitive level before transplantation to avoid antibody-mediated acute rejection. We conducted basic research on refining the conventional flow cytometry lymphocyte crossmatch-igg (FCXM-IgG) test to detect HLA antibodies at a highly sensitive level and on standardizing this novel procedure. We measured the levels of FCXM-IgG and LABScreen single-igg using human donor lymphocytes in serum samples of 78 renal transplant recipients who visited the outpatient clinic of the Department of Surgery III at Tokyo Women s Medical University. The correlation coefficients between FCXM-IgG MFI level and LABScreen single-igg nmfi level were as good as about.8 for both B and T cells. These coefficients measured in linear values were almost equal to those measured in channel values. Even if we consider that the LABScreen single-igg level could be affected by the coexistence of natural antibodies to some extent, we demonstrated in this study that the measured levels of FCXM-IgG and LABScreen single-igg with fluorescence intensity correlated well with each other. Key words: human leukocyte antigen (HLA), donor-specific HLA antibodies (DSA), lymphocyte cytotoxicity crossmatch test (LCT-XM), flow cytometry lymphocyte crossmatch-igg test (FCXM-IgG), LABScreen Single Antigen IgG Test (LABScreen single-igg) (Received: February 2, 215; Accepted: November 25, 215) 医学検査 Vol.65 No

日本組織適合性学会誌第20巻2号

日本組織適合性学会誌第20巻2号 Major Histocompatibility Complex 2013; 20 (2): 121 129 平成 25 年度認定 HLA 検査技術者講習会テキスト HLA 1) 1) HLA HLA HLA PRA Panel reactive antibody DSA Donor specific alloantibody class subclass non-hla HLA キーワード :Human

XM と併用し高感度な DSA 検出法として FCXM- した cold 生理食塩水でリンパ球を洗浄後 flow IgG を導入した 全米臓器共有ネットワーク United cytometer FACS Calibur Becton, Dickinson and Network for Organ

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