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ひでたつちづ
5 years ago
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1 ラット桑実胚のガラス化保存と加温京都大学大学院医学研究科附属動物実験施設滝澤明子タイムスケジュールラット桑実胚採取とガラス化保存第 1 日目 (16:00 以降 ) 第 2 日目 (9:00~11:00) 第 5 日目 (13:00~15:00) 性周期が発情前期の雌を同系統の成熟雄と交配させる交配の確認をプラグの有無とスメア検査により確認する桑実胚採取およびガラス化保存個体復元第 1 日目 ( 午後 13:00 以降 ) 性成熟に達したメスを精管結紮したオスと同居する第 2 日目 ( 午前 9:00~11:00) プラグ確認と膣垢検査を行う第 4 日目 ( 午前 13:00~15:00) 保存した桑実胚を加温して子宮内移植する第 25 日目 ( 午後 ) 自然出産しない場合帝王切開を行う * 動物室 : ライトサイクル ( 明期 7:00~21:00) 湿度 55±5% 温度 24±2 1. 準備 1) 凍結用培地の調整準備蒸留水エチレングリコール Ficoll70 Sucrose BSA 18G 注射針 1mL シリンジ 10mL シリンジ滅菌用フィルター (0.45μm) ガラスアンプル修正 PBS の作製 ( 表 1) 1. 蒸留水 70 ml に上記の試薬全てを入れて溶かし蒸留水で 100 ml にメスアップする μm のフィルターで濾過滅菌する 3. チューブに 10 ml ずつ分注して-20 で保存する 4. 使用前に BSA を 3 mg/ ml になるように加えて 0.20 μm のフィルターで濾過滅菌する表 1. PB1 の組成試薬 NaCl KCl CaCl 2-2H 2 O KH 2 PO 4 MgCl 2-6H 2 O Na 2 HPO 4-12H 2 O Na-pyruvate Glucose Streptomycin Penicillin G BSA 100mL mg 20.0 mg 13.2 mg 20.0 mg 10.0 mg mg 3.6 mg mg 5.0 mg 7.5 mg 300 mg 11

2 EFS40 の作製 1. PB1(BSA 添加前 )35.1 ml に FicollTM PM g を加え静置する ( 数時間 ~ 一晩 ) 2. sucrose 8.56 g を加えて攪拌し完全に溶かす (50 ml となる ) 3. BSA 105 mg を加えて溶解する (FS 表 2) 4. 18G の注射針をつけた 1 ml のシリンジを用いてエチレングリコールと FS を容積比が 2 : 3(4 ml + 6 ml) となる表 2. FS の組成 Ficoll 70 sucrose BSA PB1 (- BSA) 表 3. EFS40 の組成 15.0 g 8.56 g 105 mg 35.1 ml ようにフタ付きチューブに入れる (EFS40 表 3) 注) 正確 40 % (v/v) ethylene glycol に量るようにするためにシリンジは同じロットで目盛 18 % (w/v) Ficoll 70 の位置が同じものを使用する 0.3 M sucrose 5. チューブを穏やかに反転させて完全に両液を混合させてから 0.45 μm のフィルターで濾過滅菌する注 )0.20 in PB1 μm のフィルターだと目詰まりが起きる 6. 滅菌したガラスアンプルに分注して封入する ( 室温保存 ) S-PB1 の調整 (0.5 M sucrose 添加 PB1) ml の PB1(BSA を添加したもの ) に g の sucrose を加えて溶かし 0.20 μm のフィルターで濾過滅菌する 2. ガラス化保存 1) ドナーラットの準備 1. 膣垢採取により性成熟した雌ラットの性周期を確認する 2. 夕方から発情前期から発情期の雌ラットを性成熟した雄ラットと同居させる 3. 翌日の午前中に雌ラットと雄ラットを離してプラグ膣内精子の確認をする 2) 桑実胚の回収準備 PB1 ミネラルオイル灌流針(26-30 G) 1 ml シリンジプラスチックシャーレ胚操作用キャピラリーマウスピース滅菌ろ紙ピンセット外科用ハサミ眼科用ハサミ実体顕微鏡方法 1. プラスチックシャーレ (35 mm) に 100 μl の PB1 のドロップ 4 個を作りミネラルオイルで覆い室温に平衡させておく 2. プラグ確認日から 3 日目の午後に交配を確認した雌ラットから卵管と子宮を摘出する 3. 滅菌ろ紙の上に子宮と卵管をのせ脂肪や付着した血液をできるだけ取り除くその後子宮の卵管側半分を残して切りとる 12

3 4. 灌流針つきシリンジに PB1 を吸引し卵管采から灌流針を入れて卵管から灌流して桑実胚を流し出す 5. 桑実胚を回収し PB1 のドロップに移して 3 回以上洗浄し細胞や血液を取り除く 3) 桑実胚のガラス化準備 EFS40 S-PB1 ミネラルオイル液体窒素プラスチックシャーレ(35mm) 胚操作用キャピラリーマウスピース 1 ml シリンジ 18 G 注射針ストロー連結用シリコンチューブ人工授精用プラシチックストロー (0.25mL) 発泡スチロール板( 厚さ 6-10 mm) タイマー温度計ピンセット熱シーラー実体顕微鏡液体窒素容器 ( 広口のデュワー瓶または発泡スチロール容器 : ストローが水平に入る容器 ) 方法 1. ガラス化保存を行うための胚操作を行う部図 1. 桑実胚吸引用シリンジとストローとの接続部屋の室温を 25 になるよう調節する凍害保護物質の胚への浸透速度が異なるため a b 胚への毒性が影響するので注意が必要である 2. 18G 注射針を装着した 1 ml のシリンジに EFS40 を吸引し室温に平衡させる 3. プラスチックシャーレ (35 mm) に EFS40( 約 0.1 ml) と S-PB1( 約 1-3 ml) を入れる注 )EFS40 は蒸発して濃縮されやすいのでサンプルごとにシリンジから必要量のみを出して使う 4. ストロー (0.25 ml 授精用ストロー ) の綿栓側を 1 ml シリンジに連結し S-PB1(~60 mm) 空気 (~20 mm) EFS40(~5 mm) 空気(~5 mm) EFS40(~12 mm) の順に吸引する ( 図 3) 5. 注 ) ストローをシリンジに連結するためのシリコンチューブ等 ( 図 1 a) がない場合は 200 μl ピペット用のチップで代用することが出来る ( 図 1 b) それぞれの溶液がコンタミすることのないようそれぞれの液を吸引する前にキムワイプでストロー先端をぬぐうようにする図 3: 凍結用ストローの作製綿栓 S-PB1 EFS40 桑実胚 Heat-sealed 6. 液体窒素を用意し発泡スチロール板 ( 厚さ 6-10 mm) を浮かべる 7. 凍結する胚を PB1 にプールする顕微鏡下での作業の際にはステージの温度が上がらないように顕微鏡の照明を出来る限り落として使用する 13

4 8. 胚をピペットに充填して少量の PB1 と共に水平に置いたストロー中の EFS40 カラム (~12 mm) のほぼ中央に導入するこのときの正確な時間を確認する ( タイマーをスタートする 0 m 0 s) ピペットの気泡の動きを胚導入の目安にするためピペットに幾つか空気層を吸引してからピペットの先端に数珠つなぎ状に胚を充填する ( 図 4) 温度を一定( 室温 ) に保つためストローの EFS40(~12 mm) の部分を絶対に触れないように注意をする図 4. キャピラリーへの桑実胚の充填桑実胚気泡 9. S-PB1 が綿栓内のパウダーに達して止まるまでシリンジを吸引してストローの開口部を熱シーラーで封じ ( 図 3) 室温で放置する 10. EFS40 に移してから 30 秒後にストローを液体窒素上の発泡スチロール板上に置く (0 m 30 s) 室温で置いておく時間は凍害保護物質が胚へ浸透する速度を変化させ加温後の胚の発生能にも影響するので注意する (20 なら 1 分 ) 11. ストローを液体窒素ガス中に 3 分以上保持した後液体窒素中に浸漬して保存用タンクに移す (3 m 30 s) 3. 加温準備 PB1 S-PB1 ミネラルオイル室温の水道水プラスチックシャーレ(35 mm) 胚操作用キャピラリーマウスピース 1 ml シリンジ 18 G 注射針温度計ピンセットストローカッター実体顕微鏡広口の容器 ( 水道水を入れるための容器 ) 方法 1. S-PB1 と PB1 を室温に平衡させる 2. シャーレに S-PB1 と PB1 のドロップを 4 個ずつ作りミネラルオイルで覆う 3. 室温の水道水を広口の容器に用意する G 注射針付き 1 ml シリンジに S-PB1 を ml 吸引する 5. 液体窒素の中からストローを空気中に取り出しタイマーをスタートさせる (0 m 00 s) 秒後に室温の水中に浸し軽く揺する (0 m 10 s) 7. ストローの S-PB1 の部分が溶け始めたら (~ 0 m 18 s) 直ちに取り出しキムワイプ等でストロー表面の水を拭きとるこの時ストローの EFS40 のカラムを指で触れないように注意する 8. S-PB1 の部分を持ってストローを平衡に保ち EFS40 側の端と綿栓を切り落とす 9. EFS40 側の端をシャーレの上になるようにしてストローを僅かに傾け反対側の端から S-PB1 を含むシリンジの 18 G 注射針を差し込み中身をシャーレ上に灌流する (~1 m 00 s) 融解後灌流までは出来るだけ素早く行う 14

10. 胚をピペットで回収して準備した S-PB1 のドロップに移して洗浄する (~2 m 30 s) 全ての胚が回収されなかった場合はストローに残した S-PB1 を取り出して胚を探す 11. S-PB1 で灌流した 5 分後に準備した PB1 のドロップに胚を移して洗浄する (6 m 00 s) 正常な胚は図 5.

移植準備ネンブタール生理食塩水ギムザ染色液胚操作用キャピラリーマウスピース 1mL シリンジ 26G 注射針綿棒スライドガラスピンセット外科用ハサミ眼科用ハサミクレンメオートクリップ縫合針実体顕微鏡方法 1. 性成熟した雌ラットの性周期を確認し発情前期を示す雌を精管結紮したオスと交配させる 2. 翌日の午前中にメスラットと精管結紮オスを離しプラグの確認を行う 3.

5 10. 胚をピペットで回収して準備した S-PB1 のドロップに移して洗浄する (~2 m 30 s) 全ての胚が回収されなかった場合はストローに残した S-PB1 を取り出して胚を探す 11. S-PB1 で灌流した 5 分後に準備した PB1 のドロップに胚を移して洗浄する (6 m 00 s) 正常な胚は図 5. S-PB1(a) と PB1(b) 中の桑実胚 S-PB1 中では収縮し PB1 に移すと正常な形態に回復する ( 図 5) 移植に使用する際は実際に使うまでは R1ECM 等の培地に移して 37 の CO 2 インキュベーター内に静置しておく a b 4. 移植準備ネンブタール生理食塩水ギムザ染色液胚操作用キャピラリーマウスピース 1mL シリンジ 26G 注射針綿棒スライドガラスピンセット外科用ハサミ眼科用ハサミクレンメオートクリップ縫合針実体顕微鏡方法 1. 性成熟した雌ラットの性周期を確認し発情前期を示す雌を精管結紮したオスと交配させる 2. 翌日の午前中にメスラットと精管結紮オスを離しプラグの確認を行う 3. プラグの確認日から 2 日目の午後に偽妊娠メス ( レシピエント ) ラットの子宮角に桑実胚を移植する 4. レシピエントラットにネンブタール液を腹腔内に投与する 5. 背部を毛刈りする 6. 背部の皮膚を正中線に沿って約 1cm 切開し眼科剪刀の先端を切開した部分におしつけハサミを開くように表皮と筋層をはがす 7. 筋層を約 1cm 切開し腹腔内に見える脂肪を引き出すように卵巣と子宮を引き出し滅菌したガーゼの上におきクレンメで保定する 8. 子宮角の卵管結合部から約 1cm の場所に 26G の注射針で刺し針穴にピペットを差し込み桑実胚を注入する注 ) ピペットにいくつかの空気層を吸引してからピペットの先端に数珠繋ぎ上に桑実胚を挿入する 9. 引き出した卵巣から子宮までを腹腔内に戻して筋層を縫合し外皮をオートクリップで留める 10. 反対側の子宮にも同様に桑実胚を移植する 11. 移植後麻酔が覚めるまでウォームプレート上で温め動き始めたらケージに移し出産予定日まで飼育を行う 15

6 5. 器具試薬リスト桑実胚ガラス化保存器具メーカーコード直せん刀片鋭片鈍 (NAPOX 製 ) 夏目製作所 B-3 小直せん刀両鋭 (NAPOX 製 ) B-12 虹彩無鈎ピンセット直型 (NAPOX 製 ) A-7 尖鋭ピンセット (INOX-1)(DUMONT 製 ) MA-41 灌流針 28G 田口注射針製作所 28G( 特注 ) 1mlシリンジテルモ SS01T シャーレ 35mm コーニングシャーレ 60mm ファルコンキャピラリー Drummond Science チューブ 15ml コーニングチューブ 50ml ファルコン凍結ストロー 0.25ml マイサイエンス ( 株 ) AAA201 薬品メーカーコード NaCl ナカライテスク KCl ナカライテスク CaCl 2-2H 2 O ナカライテスク KH 2 PO 4 ナカライテスク MgCl 2-6H 2 O ナカライテスク Na 2 HPO 4-12H 2 O ナカライテスク Na-pyruvate ナカライテスク Glucose ナカライテスク Streptomycin 明治製菓 ( 株 ) Penicillin G 明治製菓 ( 株 ) Sucrose ナカライテスク Ficoll 70 Amersham Biosciences Ethlene Glycol ナカライテスクミネラルオイル SIGMA M8410-1L BSA ナカライテスク桑実胚子宮内移植器具メーカーコード直せん刀片鋭片鈍 (NAPOX 製 ) 夏目製作所 B-3 小直せん刀両鋭 (NAPOX 製 ) B-12 先細無鈎ピンセット直型 A-3-1 尖鋭ピンセット (INOX-1) MA-41 虹彩無鈎ピンセット直型 (NAPOX 製 ) A-7 動脈クレンメ小直型溝付 (NAPOX 製 ) C-17 オートクリップ ( スティル社 ) C-29 毛刈せん刀 ( 小 ) (NAPOX 製 ) B-39 超硬付スティル持針器 (NAPOX 製 ) C-35-T 1mlシリンジテルモ SS01T シャーレ 35mm コーニングシャーレ 60mm ファルコンキャピラリー Drummond Science チューブ 15ml コーニングチューブ 50ml ファルコン縫合糸秋山製作所 CA1370N2 薬品メーカーコード BSA ナカライテスクミネラルオイル SIGMA M8410-1L ネンブタール注射液 (1ml 中ヘントハルビタール 50mg) 大日本製薬 ( 株 ) ボスミン第一製薬 ( 株 ) 生理食塩水 5ml cc アンプル 100 管扶桑薬品工業 500ml ボトル入り大塚製薬 ( 株 ) 024-3L1 16

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MANUAL 顕微授精 (ICSI) 自然科学研究機構生理学研究所行動代謝分子解析センター平林真澄顕微授精タイムスケジュール第 1 日目 (19:00) 300IU/kg の妊馬血清性性腺刺激ホルモン (PMSG) を投与第 3 日目 (19:00) 300IU/kg のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン (hcg) を投与第 4 日目 (9:00~) hcg 投与 14~17 時間後に採卵および ICSI 第