家畜ふん尿の効率的土地還元技術の確立

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しほこつつの
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1 18 栃木畜試研報第 16 号 (2000) 豚胚の凍結保存技術に関する試験野沢久夫 1 中村真弓阿部泰男 2 1 大久保彰夫中島芳郎栃木県県央家畜保健衛生所 2 栃木県農務部畜産振興課 1 要約豚の胚移植関連技術は繁殖生理の特異性により未確立の部分が多く存在し特に凍結保存技術は著しく遅れているそこで凍結方法の基礎的技術の確立と豚繁殖生理の解明を目的として超急速凍結法 ( ガラス化凍結法 ) による保存技術について検討した試験 1 では凍結媒液中のエチレングリコール (EG) 濃度について試験を実施した融解手法については凍結媒液と DPBS を基礎液とした耐凍剤除去液をストロー中で混合する方法において胚の生存性が比較的向上した EG 濃度については 6M 以上の濃度においてストローのガラス化状態が形成されたまた 6M 以下の濃度において融解培養後に回復する胚が認められた試験 2 では凍結媒液は試験 1 の結果を踏まえて EG 濃度を 6M とし耐凍剤除去液中のガラクトース (GAL) 濃度について検討した胚の融解培養後における生存性及び状態については GAL 濃度との関連性は認められずいずれの GAL 濃度においても発育率が低い結果となった以上のことから凍結媒液の EG 濃度は常法である 8M 以下の 6M であってもガラス化状態が完全に形成され融解後における胚の損傷も減少できることが示唆されたしかし GAL 濃度についてはさらに検討する必要があると思われる緒言豚胚の凍結保存技術は豚胚の脂肪酸組成比や脂肪顆粒の存在等その特異性により 13 以下の低温に極めて弱く一部の研究機関で成功例があるものの依然として技術確立が遅れている状況にある現時点では豚胚の凍結保存法には緩速凍結法及び超急速に凍結するガラス化凍結法があるガラス化凍結法は高濃度の耐凍剤を用いて直接液体窒素中で凍結するが高濃度の耐凍剤は豚胚への毒性が大きく変性や崩壊等の要因となっているそこで凍結方法の基礎的技術の確立と豚繁殖生理の解明を目的としてガラス化凍結時の凍結媒液や融解液等について検討した試験 1 では凍結媒液のエチレングリコール (EG) 濃度試験 2 では耐凍剤除去剤であるガラクトース (GAL) 濃度について比較検討した試験 1(EG 濃度の検討 ) 材料及び方法 1 試験期間平成 9 年 4 月 ~ 平成 10 年 3 月 2 供試豚当場繋養のランドレース種系統豚トチギ L 若齢雌 (200 日齢前後 ) を用いた 3 供試豚の飼養管理当場慣行法とした 4 胚の採取 (1) 発情誘起及び人工授精発情誘起及び人工授精は下記のとおり実施したア ecg1,500iu を筋肉内投与イ 72 時間後に hcg500iu を筋肉内投与ウ 24 時間後に人工授精 (1 回目 ) エ 24 時間後に人工授精 (2 回目 ) オ 5 日後に胚の採取 (2) 胚の採取胚の採取は豚の胚移植マニュアル 1) に基づき下記のとおり開腹手術またはと殺子宮摘出により行ったア塩酸ケタミン (1.25g) 及びアザペロン (0.4g) を筋肉内投与後ハロセンにより吸入麻酔イ術野の洗浄消毒及び手術準備ウ開腹子宮灌流及び閉腹灌流には 10%FBS 加 DPBS にペニシリン G カリウム及び硫酸ストレプトマイシンを添加した溶液を用いたまた両抗生物質は凍結媒液等他の溶液にも添加した (3) 胚の選定胚の選定は下記の手順で実施したア洗浄液 (10%FBS 加 DPBS) で洗浄イ正常胚と変性胚に分別

2 ウ発育が遅れている正常胚は培養液 (10%FBS 加 0.2%BSA 加 M199) で CO 2 インキュベーター (37 5%CO 2 湿度 100%) を用いて培養エ拡張胚盤胞及び脱出胚盤胞を供試胚として使用 5 調査項目 (1) 胚の採取成績 : 黄体数採取胚数正常胚数正常胚率等 (2) 凍結融解後における胚の生存性ア各融解手法における胚の生存性凍結ストローの融解時に表 1 のとおり CPA と耐凍剤除去液の混合方法を設定し培養後における胚の生存性について調査した融解及び培養方法は下記のとおりである ( ア ) 表 1 による各試験区での処理 ( イ ) 洗浄液 (10%FBS 加 DPBS) で洗浄 ( ウ ) 培養液 (10%FBS 加 0.2%BSA 加 M199) で CO 2 インキュベーター (37 5%CO 2 湿度 100%) を用いて培養 ( エ ) 24 時間後に胚の状態を調査なお胚の凍結は下記のとおり超急速凍結法 ( ガラス化凍結法 ) により実施した ( ア ) 2M EG+10%FBS 加 DPBS に 5 分間浸漬 ( 平衡 ) ( イ ) 8M EG+7%PVP 加 10%FBS 加 DPBS に浸漬 ( ウ ) 浸漬後 40 秒以内に 0.25ml ストローへの封入及び液体窒素中での凍結 ( オ ) ストロー中の内容液については図 1 のとおり 3 パターン製造したイ各 EG 濃度におけるストロー凍結時のガラス化状態 EG 濃度を 4M 5M 6M 7M 8M と 5 段階に設定し図 2 のとおり胚は封入せず CPA のみストローに注入し液体窒素への投入時における各濃度でのガラス化状態の有無を調査したウ各 EG 濃度における胚の発育状況上記イと同様に CPA 中の EG 濃度を 4M 5M 6M 7M 8M と設定し下記の手順により培養後における胚の生存性について調査した ( ア ) 2M EG+10%FBS 加 DPBS に 5 分間浸漬 ( 平衡 ) ( イ ) 各濃度 EG+7%PVP 加 10%FBS 加 DPBS に浸漬 ( ウ ) 1.7M GAL+10%FBS 加 DPBS に浸漬 ( エ ) 洗浄液 (10%FBS 加 DPBS) で洗浄 ( オ ) 培養液 (10%FBS 加 0.2%BSA 加 M199) で CO 2 インキュベーター (37 5%CO 2 湿度 100%) を用いて培養 ( カ ) 24 時間後に胚の状態を調査表 1 試験区試験区 A 区 B 区 C 区融解手法ストロー外のシャーレ中で耐凍剤除去液と混合ストロー中で耐凍剤除去液と混合耐凍剤除去液の基礎液を M199 に代えてストロー中で混合 a:2m EG+10%FBS 加 DPBS CPA:8M EG+7%PVP 加 10%FBS 加 DPBS 試験区分 B 区で使用 a:1.7m GAL+10%FBS 加 DPBS CPA:8M EG+7%PVP 加 10%FBS 加 DPBS 試験区分 C 区で使用 a:1.7m GAL+10%FBS 加 0.2%BSA 加 M199 CPA:8M EG+7%PVP 加 10%FBS 加 DPBS 図 1 各融解手法における胚の生存性調査で製造したストロー封入状態模式図試験区分 A 区で使用

3 20 栃木畜試研報第 16 号 (2000) air air air air sponge CPA CPA CPA CPA CPA seal CPA:8M EG+7%PVP 加 10%FBS 加 DPBS 図 2 各 EG 濃度におけるストロー凍結時のガラス化状態調査で製造したストロー封入状態模式図試験 2(GAL 濃度の検討 ) 1 試験期間平成 11 年 1 月 ~ 平成 12 年 3 月 2 供試豚試験 1 に同じ 3 供試豚の飼養管理試験 1 に同じ 4 胚の採取凍結融解培養 (1) 発情誘起及び人工授精試験 1 に同じ (2) 胚の採取胚の採取は開腹手術により行った (3) 胚の選定試験 1 に同じ (4) 胚の凍結胚の凍結は下記のとおり超急速凍結法 ( ガラス化凍結法 ) により実施したア 2MEG+10%FBS 加 DPBS に 5 分間浸漬 ( 平衡 ) イ 6M EG+7%PVP 加 10%FBS 加 DPBS に浸漬ウ浸漬後 40 秒以内に 0.25ml ストローへの封入及び液体窒素中での凍結エストロー中の内容液については図 3 のとおりとした (5) 胚の融解胚の融解は下記の手順により行ったアストローを液体窒素から取り出し空気中に 5 秒間保持イ 25 の水槽中に 10 秒間浸漬ウ CPA 部分を GAL+10%FBS 加 DPBS の入ったシャーレに排出エ直ちに胚を洗浄液 (10%FBS 加 DPBS) で洗浄 (6) 胚の培養試験 1 に同じ 5 調査項目 (1) 胚の採取成績 : 試験 1 に同じ (2) GAL 濃度の違いによる凍結融解後における胚の生存性耐凍剤除去液中の GAL 濃度を 0.4M 0.8M 及び 1.7M の 3 区に設定し培養後における胚の生存性について調査した a:2m EG+10%FBS 加 DPBS CPA:6M EG+7%PVP 加 10%FBS 加 DPBS 図 3 各融解手法における胚の生存性調査で製造したストロー封入状態模式図試験 1(EG 濃度の検討 ) 結果 1 胚の採取成績表 2 に胚の採取成績を示した胚の採取は 11 頭の雌豚から 7 回実施した 168 個の黄体から 137 個の胚を採取し胚の回収率は 81.5% となったまた 137 個の胚のうち正常胚は 96 個変性胚 ( 形態的異常死滅未発育 ) は 41 個となり正常胚率は 70.1% であった 2 凍結融解後における胚の生存性 (1) 各融解手法における胚の生存性表 3 に凍結融解培養後における胚の生存性を示した B 区 ( ストロー中で耐凍剤除去液と混合 ) において 1 時間後の生存数が 24 個中 9 個と比較的良好な結果を示したが 24 時間後の生存性については試験区 3 区とも認められなかった (2) 各 EG 濃度におけるストロー凍結時のガラス化状態表 4 に各 EG 濃度によるストローのガラス化状態を示した 4M~8M の 5 濃度をストローに注入し液体窒素中で超急速に凍結させたところ 6M 以上でガラス化状態になり 5M 以下では氷晶が形成される結果となった (3) 各 EG 濃度における胚の発育状況表 5 に各 EG 濃度による胚の発育状況を示した 4M~8M の 5 濃度の耐凍剤と融解液を用いて凍結以

4 外の処理を行い培養後発育状況を調査した 6M 以下の濃度では 5 時間後においては収縮していたが 24 時間後においては回復する胚が認められた 7M 及び 8M の濃度では 5 時間後においては収縮しているものの生存している胚が 24 時間後においては死滅や著しい変性となった表 2 採取日別による胚の採取成績 No. 採取方法頭数黄体数採取胚正常胚変性胚凍結胚正常胚率 1 と殺 2 頭 28 個 16 個 10 個 6 個 10 個 62.5% 2 外科と殺外科と殺と殺外科計平均表 3 各融解手法による胚の生存性試験 1 時間後 24 時間後区分生存数維持一部崩壊全体崩壊 A 区 5/ B 区 9/ C 区 4/ 表 4 ストローのガラス化状態 4M 5M 6M 7M 8M 状態白色半透明透明透明透明備考結晶化一部結晶ガラス化ガラス化ガラス化表 5 EG 濃度による胚の発育状況 No. 濃度 5 時間後 24 時間後 1 8M 6 割の収縮胞胚腔あり 9 割突起あり 2 同上完全に変性 3 7M 7 割の収縮胞胚腔あり変性がひどい 4 同上変性崩壊 5 6M 9 割の収縮胞胚腔あり 6 割周囲変性胞胚腔あり 6 完全に収縮胞胚腔あり 6 割変性部位が多い 7 5M 8 割の収縮胞胚腔あり完全に回復 8 生存変性部位 2 カ所変性部位 2 カ所死滅 9 4M 8 割の収縮胞胚腔あり完全に回復 10 6 割の収縮変性部位付着 9 割まで回復試験 2(GAL 濃度の検討 ) 1 胚の採取成績表 6 に胚の採取成績を示した 17 頭を供胚豚として準備したが No.9 No.14 及び No.16 の 3 頭が子宮内膜炎のため採取不能であった 14 頭からの採取結果については黄体数は 268 個採取胚数は 189 個となり回収率は 70.5% であったまた 189 個中正常胚数 99 個変性胚数 90 個で正常胚率は 52.4% であった 2 GAL 濃度の違いによる凍結融解後における胚の生存性表 7 に各 GAL 濃度における胚の発育状況を示した GAL 濃度 1.7M で融解した胚 (1.7M 区 ) においては

5 22 栃木畜試研報第 16 号 (2000) 脱出胚盤胞 2 個の胚 0.8M 区及び 0.4M 区では 1.7M 区と同様に脱出胚盤胞が 1 個ずつ発育したしかし各区とも発育率が極めて低く死滅した胚の状態についても各区間に一定の傾向は認められなかった表 6 採取日別による胚の採取成績 No. 採取年月日頭数黄体数採取胚正常胚変性胚凍結胚正常胚率 1 H 個 0 個 0 個 0 個 0 個 0% 2 H H H H H H H H H H H H H H H H 計平均頭の平均値表 7 GAL 濃度による胚の発育状況 GAL 濃度胚ステーシ N 生存 24 時間培養後における胚の状態死滅 ( 発育 ) 維持収縮変性崩壊死滅計 1.7M 拡張胚盤胞脱出胚盤胞 M 拡張胚盤胞脱出胚盤胞 M 拡張胚盤胞脱出胚盤胞考察豚における胚の採取技術は開腹手術ではその手法はほぼ確立されているまた採取効率を向上させるためホルモン投与による過排卵誘起試験も以前から実施され ecg1000iu+hcg500iu が現在一般的な方法とされている 1) 本試験では ecg1500iu 投与後 72 時間後に hcg500iu を投与し 24 時間後に人工授精を行うことにより効率的な胚の採取ができる 2) ことから同法により過排卵処理を実施した試験 1 及び試験 2 の平均黄体数はそれぞれとなり今吉ら 3) の報告とほぼ同様の数値となったが明確な効果は認められなかったまた正常胚率が 70.1% 及び 52.4% であり特に試験 2 では子宮内膜炎により 3 頭が採取不能だったことから既報 1,4) のとおり ecg の投与単位数増加に伴う弊害が発生したものと考えられるガラス化凍結でのストロー充填法は小林ら 5) が耐凍剤除去液として非常に有効な GAL を CPA の両側に挟み込む形で充填し温湯中で融解後ストローを振って両液を混合し耐凍剤を除去する方法を採用して以来各研究機関では同様の方法を用いている

6 本来ストロー内混合は牛胚において庭先融解及び移植を実用化するために開発された 6) が豚胚においても耐凍剤浸漬時間の短縮化や融解作業の簡素化が図れるなど有効な方法である本試験ではストロー外のシャーレ中で混合する手法との比較を行ったが有意ではないもののストロー中で混合する手法において生存性が向上する傾向が認められ同方法の有用性が実証されたまた本試験ではストローに充填する耐凍剤除去液の基礎液を DPBS から M199 に代えて胚の生存性を比較した両液ともほぼ同様の結果を示すものと推測して試験を実施したが M199 を用いた除去液では培養後に胚の形態が崩壊する胚が多数見受けられたこれは DPBS と M199 における組成成分の差によるものと考えられるが短時間しか浸漬しない耐凍剤除去液がどの程度まで胚に影響を与えるのか今後さらに検討する必要がある CPA 中の耐凍剤である EG については小林ら 5) により他の実験動物や牛における手法を参考に試験が開始されたが本試験ではまず EG 濃度におけるガラス化の形成状態を確認した LEIBO ら 7) は EG 濃度が 6M 以上でガラス化されることを報告しているが本試験においても同様の結果が示されておりガラス化の最低濃度は 6M であることが実証された現在豚胚のガラス化凍結に用いられている一般的な EG 濃度は 8M であるこれは小林ら 5) が諸文献を基に 8M EG+7%PVP を採用し凍結融解後における高生存率を証明したことによるものであるが本試験では EG 濃度 6M 以上でガラス化状態が形成されることまた EG はプロピレングリコールやグリセロールと比較して毒性が低いものの僅かでも低濃度に抑制した場合が豚胚の生存性を向上させるのではないかと予測し 6M を中心とした各 EG 濃度での融解培養後における胚の生存性を調査したその結果牛胚の超急速凍結においては 6M EG では低い生存率が示されているものの豚胚においては 6M 濃度においても凍結保存が可能であることが示唆された CPA 除去には従来段階希釈法が用いられていたが細胞膜不透過性物質である糖類液に胚を浸漬すると細胞内外の浸透圧差により CPA が細胞外へ排出される 6) ことからシュクロースやトレハロース等が耐凍剤除去剤として使用されるようになったしかし小林ら 5) は糖類液内での胚の収縮状態や同濃度における胚への影響は単糖類が優れているとの報告により単糖類である GAL を採用し現在では各研究機関とも同様の手法により耐凍剤を除去している本試験では試験 1 により EG6M においてもガラス化凍結が可能であるとの結果を得たことから 6M の EG 濃度に適した GAL 濃度を確立するため試験 2 において GAL 濃度試験を実施したしかし GAL 濃度による明確な傾向は認められず胚の生存性はいずれの試験区 (1.7M 0.8M 及び 0.4M) においても極めて低い結果となったその原因として未熟な技術も考えられるが今回の試験では融解の手順としてストローから GAL に浸漬後直ちに DPBS で洗浄し低濃度の EG で平衡しなかったそのため生存性を低下させたと考えられる小林ら 8) は段階的な濃度の EG に浸漬したことにより高い生存率と細胞への損傷が極めて少ない成績を得ており平衡が非常に重要であることを証明しているまた本試験では培養後の生存胚は拡張胚盤胞ではなく脱出胚盤胞であった拡張胚盤胞の生存率は脱出胚盤胞と比較して高くなるとの報告が多数あり本試験での成績との相違原因についても検討する必要がある以上のことから CPA の EG 濃度は常法である 8M 以下の 6M であってもガラス化が完全に形成され融解後における胚の損傷も軽減できることが示唆されたしかし GAL 濃度についてはさらに検討が必要であると思われた文献 1) 農林水産省家畜改良センター豚新技術開発研究会. 豚の胚移植マニュアル ) 中嶋洋藤野幸宏浜口充物江彊. 拡張胚盤胞の効率的な採取法. 埼玉畜試. 3) 今吉豊一郎丸山信明釘宮啓紀吉田孝美. 豚受精卵の採取移植技術の開発. 大分県農業技術センター畜産部試験研究成績書,28: ) 小林章二市川明加藤泰之石原武. 開腹手術によるブタの胚移植の受胎成績. 愛知農総試研報,22: ) 小林章二冨田政秋田中義昭. ポリビニールピロリドン加工エチレングリコール液で急速凍結したブタ胚の生存性. 愛知総農試研報,26: ) 杉江佶. 家畜胚の移植, 養賢堂 )LEIBO.S.P Oda.K.High survival of mouse zygotes and embryos cooled rapidly or slowly in ethyleneglycol pluspolyvinylpyrrolidone. Cryo-Letters,14: ) 小林章二武井真理市川あゆみ岩田久史. ガラス化保存したブタ胚の凍結保護物質除去方法が生存性に及ぼす影響. 愛知総農試,27: ) 阿部泰男野沢久夫中島芳郎川野辺章夫上野昌司. 豚の胚移植に関する研究. 栃木県畜産試験場研究報告,13:

マイクロボリュームエアクーリング (MVAC) 法によるブタ胚 ( 体内生産胚 ) のガラス化保存方法 - 1 -

マイクロボリュームエアクーリング (MVAC) 法によるブタ胚 ( 体内生産胚 ) のガラス化保存方法 - 1 - 胚の採取 MVAC 法でガラス化するのに適している胚の発育ステージは胚盤胞 ~ 拡張胚盤胞である ( 図 1) このステージであれば加温後に高い生存性が得られているそのためこれらの発育ステージの胚を効率的に採取するため供胚豚は発情誘起処理後に胚を採取する方が望ましい性成熟豚の発情誘起で確実性の高い人工流産法での発情誘起処理開始から採胚までのタイムスケジュールを下記に示したので参考にしてください