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いおりごちょう
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1 ウシ受精卵の凍結におけるダイレクト法の普及と成績香川県畜産試験場酪農肉牛担当 1. ウシ受精卵の凍結方法 (1) ステップワイズ法 (SW 法 ) 耐凍剤に 10% % グリセリンを使用凍結 :3~5: 段階に耐凍剤の濃度を上げて凍結融解 : 段階的に希釈し耐凍剤を除去移植 : ストローに詰め直して移植 ( 実験室が必要 ) 香川畜試 :28.6: 28.6%( %(12/42), 昭和 62 年 0% 10% 10% 0% 凍結時 3% 6% 融解時 6% 3% 1

2 (2)2 2ステップ法 (2St 法 ) 3~5 段階に濃度をあげて 10% % グリセリンで凍結 ( ステップワイズと同じ ) 現場でストロー内のグリセリン層にある受精卵を 0.6M シュークロース層と 5 分間混合しその後さらに PBS 層と混合しグリセリン除去を行った後そのまま移植実際には現場で融解移植されることは少なく県が実験室で融解詰め直しして使用することが多かった受胎率 :42.9: 42.9%( %(3/7) 香川畜試, 平成元年 (3)0 0ステップ法 ( ダイレクト法 :Di: 法 ) 現場でストロー融解後そのまま移植する耐凍剤に 1.6M 1,2 プロパンジオールを使用受胎率 :60.0: 60.0%( %(6/10) 香川畜試, 平成 5 年対照 :2: ステップ法 34.0%( %(17/50)) 現在耐凍剤にエチレングリコールを使用して広く普及 2. 本県でのでの凍結方法凍結方法の変遷 (1)SW 法法 2St 法法 Di 法と実証試験法実証試験されされ平成元 ~8 年頃まではまでは 2St 法がメイ法ンであったであった (2) その後下記下記の理由理由から SW 法がメイン法がメインとなり 2St 法は廃れた法れた 2St 法の受胎率法受胎率が予想予想どおりにどおりに上がらなかったがらなかった 2St 法はストロー法ストロー内でのでの希釈希釈が難しい ( 作成使用両面 ) 現場現場で融解融解移植移植することがすることが少なくなく融解融解からから移植移植までにまでに時間時間がかかったためと推察推察される SW 法は融解後法融解後受精卵受精卵の品質品質をチェックチェックできる ( 卵の保管保管融解融解は県 ) SW 法は凍結法凍結のダメージダメージが少なくなく受胎率受胎率が高いとされてきたいとされてきた (3) 平成 17 年度まで Di 法を希望法希望するする農家農家を除き SW 法を使って法って凍結保存凍結保存されてきた ( 融解処理を県が実施 ) (4) 平成 18 年度からから畜試畜試で凍結凍結するする受精卵受精卵は全て Di 法に変更法に変更した畜試畜試でのでの卵の保管保管を廃止廃止農家農家移植師移植師が卵を保管保管し現場現場で自由自由に融解融解移植移植できるようになったできるようになった 2

3 3. ダイレクト法の本格的使用平成 18 年度からから畜試畜試で凍結処理凍結処理したした受精卵受精卵は全てダイレクトダイレクト法に変更変更また作成方法作成方法は従来従来のものからのものから一部変更一部変更しているしている従来型橙色 :20 20%CS 加 1.8M エチレングリコール現在広く使われているわれている改良型青色 :20 20%FCS 加 PBS 黄色 :20 20%FCS 0.2M トレハロース加 1.8M エチレングリコール 4. 改良型ダイレクト法の考え方子ウシ血清に比べウシ胎児血清の方が受精卵への影響が少ないまたロット差も少ない細胞膜外からの凍結保護物質として 0.2M トレハロースを添加保護作用は他の糖類よりも優れている植氷時間が短く効率的かつ卵への影響が少ない (-7 での暴露時間が短い ) カラムの構成は Voelkel&Hu (1992)) の報告に基づく PBS 層を設けることにより移植後の胚の復水が促進されるとともにエチレングリコールの持ち込み量を少なくし子宮内膜に対する局所作用を軽減する 3

4 種類別移植頭数頭数 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 年度新鮮 Di 2S SW 受精卵の種類別受胎率 60% 58.6% 57.1% 受胎率 50% % 30% 20% 51.7% 45.6% 46.2% 45.2% 42.9%.5% 35.7% 39.5% 36.4% 31.7% 36.8% 34.3% 28.8% 27.9% 22.5% 17.6% 52.0% 36.9% 36.8% 33.3% 46.2% 43.7% 39.0% 36.7% 31.4% 31.3% 29.7% 30.0% 32.1% 36.3% 29.7% 28.2% 25.7% 25.7% 16.7% 44.6% 36.1% 34.5% 27.9% 45.2% 42.1% 33.3% SW 2S Di 新鮮平均 10% 0% 0.0% 0.0% H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 年度 4

5 H18~H20 年度凍結方法別受胎率受胎率 70% 60% 50% % 30% 60.7% 43.0% 42.4% 29.4%.4% 20% 10% / / 17 / / / 10% 85. 改良型ダイレクト全体従来型改良型その他ステップワイズ改良型ダイレクトダイレクト法移植状況供卵牛移植頭数受胎頭数受胎率 (%) 移植師 A B C B3 D C A A A 合計

6 6. まとめ (1) ステップワイズ法は過去 20 年以上使用してきたが受胎率が大きく向上することはなかった ( 本県での受胎率は % 強が限界と思われる ) (2) 畜試では H18 年度凍結受精卵の保管開始 20 年目の方針転換として凍結受精卵を農家移植師が保管することとした同時に現地融解移植できるダイレクト法への転換により県の実験室内での融解処理が省略され休日の移植にも対応できるようになった ( 最適な移植タイミングを確保できる ) (3) ダイレクト法の利用上の注意を熟知し正確な移植に努めることによりさらなる受胎率の向上が期待できるようになった 7. 凍結受精卵の保存保存と融解方法 (1) 底に穴が開いているいているキャニスターキャニスターは底を布テープテープ等で塞ぎ常に受精卵受精卵が液体窒素中に浸かっているかっている状態状態にするにする (2) 融解前に手を石鹸石鹸でよくでよく洗い 70% アルコールで消毒消毒 (3) ストローカッターも 70% アルコールで消毒消毒ただしただし使う前にはにはアルコールアルコールを十分気化してからしてから使う ( アルコールの残留残留は受精卵受精卵に有害 ) (4)30 30~35 35 の温湯温湯を準備 ( 温度計を使ってって正確正確に ) (5) 融解は時計時計を使ってって正確正確に行うピンセットでキャニスターキャニスターからからストローストローを取り出し (11 秒目 ) 大気中大気中で 10 秒間保持したあとしたあと温湯中温湯中に投入 (10 秒目 ) (6)10 秒間ストローストローをゆっくりをゆっくり振ってからってから取り出す (20 秒目 ) (7) ストローについているについている水滴水滴を固く絞った 70% アルコール綿でふきでふき取る引用 :(: 社 ) 家畜改良事業団牛体外受精卵移植マニュアル 6

7 7 8. 受精卵受精卵受精卵受精卵の取り扱い場の注意注意注意注意 8. 受精卵受精卵受精卵受精卵の取り扱い場の注意注意注意注意 (1) 受精卵受精卵受精卵受精卵は紫外線紫外線紫外線紫外線に弱いのでいのでいのでいので取り扱いはいはいはいは日光日光日光日光の当たらないたらないたらないたらないまたまたまたまた細菌汚細菌汚細菌汚細菌汚受精卵受精卵受精卵受精卵は紫外線紫外線紫外線紫外線に弱いのでいのでいのでいので取り扱いはいはいはいは日光日光日光日光の当たらないたらないたらないたらないまたまたまたまた細菌汚細菌汚細菌汚細菌汚染が起こらないようなこらないようなこらないようなこらないような無風無風無風無風の場所場所場所場所で行う染が起こらないようなこらないようなこらないようなこらないような無風無風無風無風の場所場所場所場所で行う (2) 車内等車内等車内等車内等で行う場合場合場合場合エアコンエアコンエアコンエアコン等は埃を舞い上げるのでげるのでげるのでげるのでエンジンエンジンエンジンエンジンを止めるめるめるめる車内等車内等車内等車内等で行う場合場合場合場合エアコンエアコンエアコンエアコン等は埃を舞い上げるのでげるのでげるのでげるのでエンジンエンジンエンジンエンジンを止めるめるめるめる (3) ストローストローストローストローを持つ位置位置位置位置は綿栓部分綿栓部分綿栓部分綿栓部分急激急激急激急激な温度変化温度変化温度変化温度変化を避けるためけるためけるためけるためストローストローストローストローの受ストローストローストローストローを持つ位置位置位置位置は綿栓部分綿栓部分綿栓部分綿栓部分急激急激急激急激な温度変化温度変化温度変化温度変化を避けるためけるためけるためけるためストローストローストローストローの受精卵精卵精卵精卵の入っているっているっているっている部分部分部分部分は触らないらないらないらない精卵精卵精卵精卵の入っているっているっているっている部分部分部分部分は触らないらないらないらないまたまたまたまた先端先端先端先端も受精卵受精卵受精卵受精卵の通り道となるためとなるためとなるためとなるため触らないらないらないらないまたまたまたまた先端先端先端先端も受精卵受精卵受精卵受精卵の通り道となるためとなるためとなるためとなるため触らないらないらないらない (4) 最適温度最適温度最適温度最適温度は最適温度最適温度最適温度最適温度は夏季夏季夏季夏季夏季夏季夏季夏季以上以上以上以上の場所場所場所場所に放置放置放置放置しないしないしないしない以上以上以上以上の場所場所場所場所に放置放置放置放置しないしないしないしない冬季冬季冬季冬季はストローストローストローストローをセットセットセットセットするするするする移植器移植器移植器移植器やシースシースシースシース管の温度温度温度温度にもにもにもにも注意注意注意注意冬季冬季冬季冬季はストローストローストローストローをセットセットセットセットするするするする移植器移植器移植器移植器やシースシースシースシース管の温度温度温度温度にもにもにもにも注意注意注意注意 (5) 凍結保存時凍結保存時凍結保存時凍結保存時融解後融解後融解後融解後常に衝撃衝撃衝撃衝撃振動振動振動振動を与えないえないえないえない新鮮卵新鮮卵新鮮卵新鮮卵も同様同様同様同様凍結保存時凍結保存時凍結保存時凍結保存時融解後融解後融解後融解後常に衝撃衝撃衝撃衝撃振動振動振動振動を与えないえないえないえない新鮮卵新鮮卵新鮮卵新鮮卵も同様同様同様同様 (6) 処理前処理前処理前処理前に受卵牛受卵牛受卵牛受卵牛の除糞除糞除糞除糞洗浄洗浄洗浄洗浄消毒消毒消毒消毒を行い融解後融解後融解後融解後速やかにやかにやかにやかに移植移植移植移植を行う処理前処理前処理前処理前に受卵牛受卵牛受卵牛受卵牛の除糞除糞除糞除糞洗浄洗浄洗浄洗浄消毒消毒消毒消毒を行い融解後融解後融解後融解後速やかにやかにやかにやかに移植移植移植移植を行う (5 分以内分以内分以内分以内が目安目安目安目安 5 分以内分以内分以内分以内が目安目安目安目安 ) 引用引用引用引用 : 引用引用引用引用 :( 社 ) 家畜改良事業団家畜改良事業団家畜改良事業団家畜改良事業団社 ) 家畜改良事業団家畜改良事業団家畜改良事業団家畜改良事業団牛体外受精卵移植牛体外受精卵移植牛体外受精卵移植牛体外受精卵移植マニュアルマニュアルマニュアル牛体外受精卵移植マニュアル牛体外受精卵移植牛体外受精卵移植牛体外受精卵移植マニュアルマニュアルマニュアルマニュアル

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< F2D90AB94BB95CA93808C8B97912E6A7464> 神畜研研報 No. 88 2001 牛性別判定受精卵の凍結融解後の生存性秋山清仲沢浩江仲沢慶紀岸井誠男 Survival of Cryopreserved Bovine Embryo after Sex Detection Kiyoshi AKIYAMA, Hiroe NAKAZAWA, Yoshinori NAKAZAWA and Yoshio KISHII 性別判定された分割卵の新鮮卵及び凍結卵での生存性