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1 Graft Maturity 千葉大学大学院 佐藤 祐介

2 目次 腱と靭帯 腱を移植することになった経緯 Graft maturityにおけるヒトと動物の違い Ligamentizationに関して( ヒトの報告を中心に ) Tendon to Bone healingに関して ( ヒトの報告を中心に ) Graft maturityに影響しそうな因子 ( 動物の報告から ) まとめ

3 前十字靭帯再建術における 自家腱グラフト

4 靭帯 腱 必要とされる機械的特性を提供するために靭帯と腱 は組成が異なる 腱と靭帯の構造的な相違にもかかわらず 腱移植片がACL再建で使用されている

5 目次 腱と靭帯の違い 腱を移植することになった経緯 Graft maturityにおけるヒトと動物の違い Ligamentizationに関して( ヒトの報告を中心に ) Tendon to Bone healingに関して ( ヒトの報告を中心に ) Graft maturityに影響しそうな因子 ( 動物の報告から ) まとめ

6 Law of functional adaptation 臓器は機能的 量的 質的に変化することに構造に適応する 靱帯や腱などの軟部組織が 異なる機械的負荷や生物学的環境にさらされたときに その機械的および生物学的特性に変化を起こす 20 世紀初頭 ヴィルヘルム ルー Ligamentization 1986 年 Amiel らは ウサギの ACL 再建を自家腱で 靭帯化 のプロセスを実証

7 Ligamentization animal Phase Neo Vascularization Cellularity mechanical strength Early healing 原繊維崩壊 Neclosis Proliferation Remodeling hyper vascularity 細胞数増加繊維芽細胞は卵円形に不規則に配置代謝的に活性 Maturation Hypo vascularity 細胞は卵形縦方向に平行に整列コラーゲン線維が ACL に比べて小さい Scheffler,KSSTA2008

8 Ligamentization animal Phase Neo Vascularization Cellularity mechanical strength Early healing 原繊維崩壊 Neclosis Proliferation Remodeling hyper vascularity 細胞数増加繊維芽細胞は卵円形に不規則に配置代謝的に活性 Maturation Hypo vascularity 細胞は卵形縦方向に平行に整列コラーゲン線維が ACL に比べて小さい Scheffler,KSSTA2008

9 The Ligamentization Process:A 4 Year Case Study Following ACL Reconstruction With a Semitendinosis Graft J.G.Lane Arthroscopy 歳男性ハムストリング腱 VS 44 歳男性 ACL 術後 4 年の再建靭帯 VS 64 歳女性正常 ACL H E 染色 偏光顕微鏡 幅が太く長い粗い幅が狭く短い 幅狭で短い長軸方向に配列

10 自家移植腱 (ST) は ACL と細胞組成が類似していた ( 術後 4 年 )

11 目次 腱と靭帯の違い 腱を移植することになった経緯 Graft maturityにおけるヒトと動物の違い Ligamentizationに関して( ヒトの報告を中心に ) Tendon to Bone healingに関して ( ヒトの報告を中心に ) Graft maturityに影響しそうな因子 ( 動物の報告から ) まとめ

12 Ligamentization におけるヒトと動物の決定的な違い Healing Process の早さ

13 Graft Maturity までに要する期間 Leo,Arthroscopy2013

14 Ligamantaization Process 早 Animal>>>Human 遅 Human の報告を中心に Steven, Am J Sports Med 2011

15 目次 腱と靭帯の違い 腱を移植することになった経緯 Graft maturityにおけるヒトと動物の違い Ligamentizationに関して( ヒトの報告を中心に ) Tendon to Bone healingに関して ( ヒトの報告を中心に ) Graft maturityに影響しそうな因子 ( 動物の報告から ) まとめ

16 Graft Maturity Ligamentization animal>human 関節内 ( グラフト全体 ) Tendon to Bone Healing 骨孔内 animal>>human

17 Ligamentization 関節内

18 MATURATION OF ALLOGRAFT TENDONS TRANSPLANTED INTO THE KNEE Shino,JBJS Br 1988 Material &Method 69 例 ( 女性 :26 男性 :43) 手術時平均年齢 22.3 歳他家グラフト : アキレス腱 前脛骨筋腱 後脛骨筋腱 ハムストリング腱 Second look biopsy: 術後 6 週 ~55 か月

19 術後 関節鏡所見 6週 Thick hypervascular synovial sheathで既に被覆 3か月 Synovial sheathはより薄く なるが正常より厚い 表面のhyper vascularは残存 Synovial sheathは正常程度に 薄くなる hyper vascularは残存 正常ACLと似てくる 中間部はhypo vascular 大腿骨側 脛骨側はhyper 6か月 12か月 3年 全体的に表面はhyper 関節鏡写真

20 病理所見 3か月 紡錘形核を有する 線維芽細胞 6か月 細胞増殖 屈折しながらコラーゲン束 が規則的に配列 12か月 滑膜表層細胞はACLに類似 細胞数の増加は持続 か月 きれいに配列したコラーゲ ン束 紡錘形の核 正常細胞数

21 病理所見 3か月 紡錘形核を有する 線維芽細胞 6か月 12か月 か月 細胞増殖 屈折しながらコラーゲン束 が規則的に配列 11 12か月で正常ACLと似た構 造となり 滑膜表層細胞はACLに類似 Graft maturityまでは18か月を要 細胞数の増加は持続 し以後は変わらなかった きれいに配列したコラーゲ ン束 紡錘形の核 正常細胞数

22 Revascularization and Ligamentization of Autogenous Anterior Cruciate Ligament Grafts in Humans Falconiero Arthroscopy1998 ACL 術後 48 人 ( 平均年齢 26.1 歳 ) second look 時に midsubstance biopsy 13-6か月 (n=10) ➁7-12か月 (n=10) 312か月 - (n=23) 4control(native ACL) (n=5) 異形成は無血管 無細胞により配列が乱れた結果に起こるが新生血管の増生にともない解消される 評価項目 (1)Vascularity (2)Cellularity (3)Metaplasia (4)Fiber pattern Maturity:-12 か月

23 Remodelling of human hamstring autografts after anterior cruciate ligament reconstruction Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc セカンドルック時に再建靭帯 ( 関節内 ) を biopsy 組織評価 Hamstring autograft (F:Bone Mulch Screw,T: WasherLoc, N ;knee in full extension. ) group 1 (6 12 months; n = 15) group 2 (13 24 months; n = 16) group 3 (24 months<; n = 11) controls:native HT (n = 17) and 受傷から 8 週以内の ACL (n = 8) 〇細胞密度 :haematoxylin eosin and Masson-Goldner-Trichrom 〇新生血管 :immunostaining von Willebrandt factor (factor VIII) antibody 〇筋線維芽細胞密度 : immunostained with a mouse anti-human ASMA monoclonal 抗体〇コラーゲン配列

24 細胞密度 3 群とも native HT より細胞密度が高い, 特に術後 months で高く 24 か月以降になると減ってくる 新生血管 術後 6-12 か月ではまだまだ少ない か月で native HT と同じくらいになってくるが native ACL には及ばない 筋線維芽細胞 術後 12 か月までと 13 ー 24 か月では大きな差がある

25 細胞密度 3 群とも native HT より細胞密度が高い, 特に術後 months で高く 24 か月以降になると減ってくる 新生血管 ヒトハムストリング腱のリモデリングは二年では終わらない 術後 6-12か月ではまだまだ少ない 13-24か月でnative HTと同じくらいになってくるが native ACL には及ばない 筋線維芽細胞 術後 12 か月までと 13 ー 24 か月では大きな差がある

26 The Ligamentization Process in Anterior Cruciate Ligament Reconstruction What Happens to the Human Graft? A Systematic Review of the Literature Steven, Am J Sports Med 2011

27 血管新生 すべてのグラフトの周囲に血 管新生が認められ 関節内で グラフトは生存する Neo Vascularization hyper vascularity ACL再建後早期に高血管形成 するが リモデリング中に 徐々に低下する 新生血管は 滑膜 膝蓋下脂 肪体 pseudoligamentum mucosumからの発生が示唆さ れているがこれを裏付ける証 拠が含まれている研究はない Hypo vascularity

28 細胞のリモデリング 新たな線維芽細胞の正確な供給源は 不明 ACL再建後にグラフトの細胞再増殖が 起こる 血管新生と並行して 術後 初期に細胞数の増加を示す この初期段階では 繊維芽細胞は 塊状の核に解体され ランダムに配 置され 代謝的に活性である リモデリングが進むにつれ 細胞は ACLのように縦方向に整列し 核は卵 形にならなくなる

29 細胞外基質 初期には組織化されていない 不規則なコラーゲン束 移植片が成熟するにつれコラーゲン束 は密集し平行に整列 横断切片におけるコラーゲン線維が正 常腱およびACLのものに比べて均一に小 さい コラーゲン線維直径の二峰性は 時間 の経過と共に単峰性の径の小さな繊維 になる

30 〇 Falconiero 術後 12 ヶ月のグラフトは組織学的に ACL と比較して有意な差異なし Ligamentization は 12 ヶ月間にわたって起こり 成熟は 1 年以降 〇 Rougraff 術後 3 年までは 変性 新生血管および細胞増加を観察し続けた 〇 Abe 術後 1 年でまだリモデリングが継続している (15 ヶ月以上の症例なし ) 〇 Sa 'nchez グラフトは術後約 2 年で成熟する

31 Systematic Review Ligamentization in Hamstring Tendon Grafts After Anterior Criciate Ligament Reconstruction:A Systematic Review of the Literature and a Glimpse Into the Future Leo,Arthroscopy2013

32 Systematic Review Ligamentization in Hamstring Tendon Grafts After Anterior Criciate Ligament Reconstruction:A Systematic Review of the Literature and a Glimpse Into the Future Leo,Arthroscopy2013

33 Ligamentization of humstring tendon Early healing 前半 後半 グラフト表面に滑膜由来治癒反応 HT と同様のコラーゲンパターンと 不規則なコラーゲン配列が混在血管再生の徴候がなく血管密度は最も低い局所的な細胞減少 全体の細胞密度は増加 細胞密度上昇 強烈な細胞増殖血管新生増加 グラフト周囲は高血管新生繊維芽細胞密度ならびに全体の細胞密度は この段階で最大に増加 Remodering コラーゲン束は規則的に配列 maturation レムナントとグラフトは区別不可全体的に細胞は 成熟したコラーゲンマトリックス内で良好に配列 ACL と同様の規則的なパターン不規則な細胞およびコラーゲン配列が グラフト周囲に一部残存細胞密度は減少 (> 正常 ACL) 血管密度はさらに増加 (< 正常 ACL) ACL に類似した構造になるが ACL の特性を完全に復元することはできない

34 Ligamentization of Autogenous Hamstring Grafts After Anterior Cruciate Ligament Reconctruction Midterm Versus Long-term Results Dong, Am J Sports Med 2015 背景 過去の研究では 前十字靱帯 ACL 再建で移植されたグラフトの 最終的なコラーゲン構造は単峰性で小径のコラーゲン線維のみ ACLおよびハムストリング腱は 大小のコラーゲン線維からなる二峰性の コラーゲン線維分布を示す 仮説 時間依存性に二峰性のコラーゲン線維分布が出現する 方法 ACL再建後 second look biopsy 52人 中期群 27人の患者 13 30ヶ月 長期群 25人の患者 31 62ヵ月 Contorol:正常ACL9人 ハムストリング腱9人 コラーゲン原線維分布を分析した

35 bimodal distribution 62.9% in the midterm group 52.0% in the long-term group

36 目次 腱と靭帯の違い 腱を移植することになった経緯 Graft maturityにおける人と動物の違い Ligamentizationに関して( ヒトの報告を中心に ) Tendon to Bone healingに関して ( ヒトの報告を中心に ) Graft maturityに影響しそうな因子 ( 動物の報告から ) まとめ

37 Tendon to Bone Healing 骨孔内

38 Histological Evaluation of Tendon-Bone Healing of an Anterior Cruciate Ligament Hamstring Graft in a 14-Year-Old Boy Am J Sports Med 2015 ハムストリング腱を用いたsingle 再建 F; EndoButton T; Milagro screw 術後4か月でのwhole Knee Histlogical evaluation 骨肉腫のため切断 脛骨側: 新生血管 良好なosteointegrationを認め コラーゲン線維が移植腱と並行に配列していた スクリューに直接触れている骨は死んでいたが スクリュー近くの骨梁は成熟しており新生骨が混在 層状に成熟した骨がグラフトを取り囲み新生骨が グラフト内にingrowthしていた Interfaceのコラーゲンは未熟で不規則な配列だった 大腿骨側: 腱内に脂肪あり 血管新生は脛骨ほどない osteointegrationなし

39 脛骨側 グラフトは成熟したコラーゲンファイバーになっておりグラフトを取り囲む ように新たなコラーゲンファイバー(Sharpy like fiber)が多く見られた 層状に成熟した骨がグラフトを取り囲み新生骨がグラフト内にbone ingrowth 動物より時間はかかるが傾向は同じ Indirect Healing Salcoma(脛骨近位 が放出する血管内皮細胞増殖因子の影響

40 Hamstring Insertion Site Healing After Anterior Cruciate Ligament Reconstruction in Patients With Symptomatic Hardware or Repeat Rupture:A Histologic Study in 12 Patients Robert,Arthroscopy,2003 術後 3 か月 :1 例境界には多数の細胞や繊維組織と毛細血管を確認し Edema により境界が明瞭に区切られ骨と細胞や繊維組織はコンタクトしていない 術後 5,6 か月 :2 例骨と腱をつないでいる結合組織 ( 線維芽細胞 毛細血管 ) が明瞭となるが Sharpy fiber(type Ⅲ collagen) は少ない層状骨は WOVEN bone に完全に覆われている 術後 か月 :3 例境界には多くの sharpy fiber グラフトは波状に整列し正常な細胞密度となる 術後 1 年 -:4 例全周性に sharpy fiber 幼弱なコラーゲンファイバーが 3 か月からみられ indirect anchorage が成熟するまで 10~12 か月を要した

41 目次 腱と靭帯の違い 腱を移植することになった経緯 Graft maturityにおける人と動物の違い Ligamentizationに関して( 人の報告を中心に ) Tendon to Bone healingに関して ( 人の報告を中心に ) Graft maturityに影響しそうな代表因子 ( 人 動物の報告 ) まとめ

42 年齢 Age-Dependent Healing Potential of Anterior Cruciate Ligament Remnant-Derived Cells Am J Sports Med 2015 ヒトACLレムナントを手術時に採取しACL由来細胞を培養 10 to 19 years (younger group) 30 to 39 years (older group) PBS group ラットACLRモデルに閉創時IAI 評価項目 ラットの組織 micro-ct 引張り試験

43 軟骨内骨化様 Osteointegration が younger group で術後 4 週で観察された 8 週すると older group と PBS group でもこの反応が見られた その間に younger group は bone ingrowth が完成していた human-derived 内皮細胞 オステオカルシン Morphometric Evaluation 毛細血管 ( 血管新生 ) 骨芽細胞

44 Bone Tunnel Evaluation by Micro Computed Tomography Biomechanical Assessment CD34 陽性細胞は多分化能 増殖能力が高いことが in vitro で証明されている Healing potential Teen>older

45 性別 Sex Influences the Biomechanical Outcomes of Anterior Cruciate Ligament Reconstruction in a Preclinical Large Animal Model Am J Sports Med 2015 adolescent Yucatan minipigs (23 male, 18 female) に 片側のACL再建 sex-matched bone patellar tendon bone allografts 評価項目 術後15週 引張り試験 組織 不安定性 軟骨損傷 OA)

46 Healing potential Female < Male

47 腱への負荷 腱へのストレスが増強するとリモデリング後の腱に生体力学的および組織学的に影響を及ぼすか? Group1 : そのまま膝蓋腱を液体窒素で凍結し その後解凍 Group2: 断面積が元の断面積の 66%~67% 理論的には 生理的ストレスの 150% Group3: 断面積は 49% から 51% 理論的には 生理的ストレスの 200% Control:intact 膝蓋腱 3 週 6 週で屠殺し組織修復後の膝蓋腱を評価力学試験 組織評価

48 3 週 6 週

49 組織学的所見 Group1 3 週間で後方に卵形または紡錘形の核を有する細胞 芯部は無細胞 コラーゲン束は縦方向に整列 Group2( ストレス 150%) 細胞核の形状は 第 1 群のものと同様であったが 芯部において無細胞領域がより広い Group3( ストレス 200%) 3 週間でコラーゲン束の断片化 紡錘形核 桿状の核を有する細胞はあまり観察されない 6 週でコラーゲン配列の乱れ ( 図 3f)

50 組織学的所見 Group1 3 週間で後方に卵形または紡錘形の核を有する細胞 芯部は無細胞 コラーゲン束は縦方向に整列 Group2( ストレス150%) 細胞核の形状は 第 1 群のものと同様であったが 芯部において無細胞領域がより広い リモデリング過程において過度に高いストレスは腱の機械的性質を低下させた 膝蓋腱自家移植に対する高いストレスは靱帯再建後に回避するべき Group3( ストレス200%) 3 週間でコラーゲン束の断片化 紡錘形核 桿状の核を有する細胞はあまり観察されない 6 週でコラーゲン配列の乱れ ( 図 3f)

51 手術のタイミング Influence of the Injury-to-Surgery Interval on the Healing Potential of Human Anterior Cruciate Ligament Derived Cells Inokuchi. Am J Sports Med 2017 方法 : ヒトの ACL 断裂組織を 関節鏡視下 ACL 再建を受けた患者から採取 (1)Erarly 群 ( 受傷から 3 ヶ月以内 )(2)Chronic 群 ( 受傷から 3 ヶ月以降 ) 雌性免疫不全ラットに ACL 再建後ヒト ACL 由来細胞を関節内投与

52 TB 界面での Qtracker 655 染色によって示された移植細胞分布 Qtracker 染色 ( 赤色 ) は TB 境界部の移植細胞 ACL 由来細胞の増殖能

53 組織学的評価 第 4 週 Early 群脛骨孔に軟骨内骨化様のosteointegration Tendon-Bone healingの増強促進 第 8 週 Chronic 群と PBS 群でも軟骨内骨化のような集積が見られた. Early 群では成熟骨が認められた 4 週 : 早期群の腱骨境界で有意に多くの線維軟骨が出現 8 週 :3 群間で線維軟骨領域の有意差はなし

54 ヒト ACL 由来細胞移植後に増強された血管新生および骨形成 毛細血管密度で評価した脈管形成 骨形成 骨孔拡大 力学試験

55 ヒト ACL 由来細胞移植後に増強された血管新生および骨形成 Healing 毛細血管密度で評価した脈管形成 Potential 骨形成 Early>Chronic 骨孔拡大 力学試験

56 目次 腱と靭帯の違い 腱を移植することになった経緯 Graft maturityにおける人と動物の違い Ligamentizationに関して( ヒトの報告を中心に ) Tendon to Bone healingに関して ( ヒトの報告を中心に ) Graft maturityに影響しそうな因子 ( ヒト 動物の報告 ) まとめ

57 まとめ 早 Graft maturity か月 遅 teen 早期手術 Elder 陳旧例女性過度な再建靭帯への負荷

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