研究成果報告書(基金分)

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きょういちみおか
5 years ago
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ウマの関節内骨折や離断性骨軟骨炎の症例から採取した滑液 (SF) や滑膜 (SM) 組織に含まれる間葉系幹細胞 () の分離培養に成功したこれらの細胞は, 関節鏡視下手術後, 形成される骨軟骨欠損部に硝子軟骨を再生させるために有用であろうと考え,SF-, 及び SM- を体外で増幅し, 高密度な細胞浮遊液として手術後の関節腔に直接注射し, 治療後の硝子軟骨再生について肉眼的

研究の目的 (1) 実験にはブタを使用し,SF 及び SM- 移植による軟骨再生治療の安全性を試験する関節の実験的軟骨掻爬手術の後, 細胞浮遊液を同関節内の骨軟骨欠損部に移植し, 組織学的評価を行う (2) 手根関節の関節内骨折を起こしたウマに SF, 及び SM- の移植を行う関節鏡視下で骨片摘出と軟骨掻爬を実施し, 予め SF から準備した幹細胞浮遊液を手術直後に関節内注射する術後,

2 様式 C-19 F-19 Z-19( 共通 ) 1. 研究開始当初の背景損傷した関節軟骨の再建治療は, 骨穿孔術による骨髄刺激法やモザイクプラスティー ( 自家骨軟骨移植術, 非加重面の軟骨を欠損部へ転位する手術 ) に始まり, 今や骨髄 (BM) や脂肪 (AT) 由来幹細胞を用いた軟骨再生治療の実用化に向け, 臨床研究が進められている我々は, これまでに培ったブタ脂肪由来幹細胞の分離培養技術を基に, ウマの関節内骨折や離断性骨軟骨炎の症例から採取した滑液 (SF) や滑膜 (SM) 組織に含まれる間葉系幹細胞 () の分離培養に成功したこれらの細胞は, 関節鏡視下手術後, 形成される骨軟骨欠損部に硝子軟骨を再生させるために有用であろうと考え,SF-, 及び SM- を体外で増幅し, 高密度な細胞浮遊液として手術後の関節腔に直接注射し, 治療後の硝子軟骨再生について肉眼的組織学的に評価するという臨床試験を着想するに至った 2. 研究の目的 (1) 実験にはブタを使用し,SF 及び SM- 移植による軟骨再生治療の安全性を試験する関節の実験的軟骨掻爬手術の後, 細胞浮遊液を同関節内の骨軟骨欠損部に移植し, 組織学的評価を行う (2) 手根関節の関節内骨折を起こしたウマに SF, 及び SM- の移植を行う関節鏡視下で骨片摘出と軟骨掻爬を実施し, 予め SF から準備した幹細胞浮遊液を手術直後に関節内注射する術後, 軟骨表面及び滑膜の肉眼的評価を行う 3. 研究の方法実験 1 SF, 及び SM- の特性解析. すでに一部の研究結果を得ているウマの SF, 及び SM- について, 細胞の倍加率, 細胞老化に伴う幹細胞としての分化特性を解析し, 幹細胞として先に確立されている BM, 及び AT 由来のと比較し, 相違点について検討を行った関節内骨折及び離断性骨軟骨症から関節症となったサラブレッドの手根関節及び足根関節から, 関節鏡視下手術時において SF を無菌的に 3~4ml 採取した SF は, 培養液と懸濁後に播種し,37,5%CO 2 環境下で 4 ~5 週間培養した関節鏡視下手術時に SM を mg採取した SM はコラゲナーゼ処理して, 組織片を除去後, 遠沈した細胞層を播種培養した BM(30ml), 及び AT(30g) は, 健常なウマから, それぞれ胸骨穿刺及び脂肪吸引法によって採取した採取した BM はヘパリンと混和し, 播種した AT は, コラゲナーゼ処理した後, サンプルを遠沈して, その沈査を播種培養した培養細胞の表面抗原と遺伝子発現をそれぞれフローサイトメトリーと RT-PCR で解析した幹細胞としての多分化能については, 骨軟骨腱脂肪細胞への分化誘導に伴う特異的な遺伝子発現と基質産生に基づき評価した実験 2 実験用ブタにおける SF, 及び SM- 移植の安全性評価と, 軟骨再生の組織学的評価. ブタの膝関節から,1~2ml の SF と mg の SM を無菌的に採取した SF は, 増殖培地と懸濁した後, 培養フラスコに播種した接着細胞の継代を繰り返し,P3 で個以上まで増幅させた SM はコラゲナーゼ処理した後, 組織破片を除去し, 同フラスコに播種して同様に増幅させた培養細胞の一部を用いて, 細胞表面抗原の特性評価, 骨軟骨脂肪細胞への分化能について遺伝子及び蛋白レベルで評価したが移植に用いる目標数に達するまでに約 1 ヵ月を要した移植用の細胞が用意で来た時点で, 同じ個体の両側肩関節に関節切開を行い, 両側の上腕骨頭に骨軟骨欠損 ( 直径 6mm) を作出した右側欠損部には, 個の SF-, 及び SM- の浮遊液 (µl の PBS で希釈 ) を滴下し,10 分間静置して手術を終えた ( 図 1) 左側の骨軟骨欠損部には細胞移植を行わずに, 対照とした移植前細胞移植後図 1. 細胞移植の手術中写真. ピペットを使って, 骨軟骨欠損部にの細胞懸濁液を滴下, 静置した実験 3 正常ウマを用いた SF, 及び SM- 移植の安全性評価自然発生性の関節内骨折のウマ症例への SF, 及び SM- の移植に先立ち, 正常なウマの関節内にの細胞懸濁液を注射して, 合併症の発現を評価した関節疾患 ( 関節内骨折 ) のあるウマから採取した SF 及び SM を用いを分離増幅した個の MSCc を 3 mlの生理食塩液に浮遊させて, 健常なウマの右側橈骨手根骨間関節内に注射した左側橈骨手根骨間関節内には生理食塩のみを注射し, 対照側とした図 2. 正常なウマの橈骨手根骨間関節 ( 右写真 ) への細胞浮遊液 ( 左写真 ) の投与.

4. 研究成果実験 1 SF から分離,4~5 週間の培養後, 1.0 10 7 個以上のを得た ( 図 3) BMderived A. CD11a/CD18 B.

MHC-II Numbers of cells 10 7 10 6 BMderived ATderived 図 5-2.BM, 及び AT- の表面抗原解析の結果.

また SF- の倍加率は,BM, 及び AT- と比較してゆっくりしていることが明らかとなった ( 図 4) 000000 00000 0000 000 00 0

SF- と,BM, 及び AT- の増殖曲線の比較. 図 5-3.SF- における Nanog と Sox2 の遺伝子発現.

を平板培養下で軟骨へと分化誘導した場合, SF, 及び SM- ではゲル状のシートを形成する一方で,BM, 及び AT- ではシートが形成されなかった ( 図 6)

及び特異遺伝子 (Nanog 及び Sox2) 発現は,BM, 及び AT- の結果と一致しており, 幹細胞としての特徴を有していた ( 図 5-1,5-2, 5-3)

CD45 Normal SFderived Diseasedc SFderived Numbers of cells Passage (P) number A C B

3 4. 研究成果実験 1 SF から分離,4~5 週間の培養後, 個以上のを得た ( 図 3) BMderived A. CD11a/CD18 B. CD34 C. CD44 D. CD ATderived E. CD90 F. CD105 G. MHC-I H. MHC-II Numbers of cells BMderived ATderived 図 5-2.BM, 及び AT- の表面抗原解析の結果. Nanog Sox P1 P2 P3 P4 Passage (P) number 図 3.SF- の細胞増殖曲線. また SF- の倍加率は,BM, 及び AT- と比較してゆっくりしていることが明らかとなった ( 図 4) SF-Normal (3ml) SF-Disease (4ml) AT-MSC (29ml) BM-MSC (35ml) P0 P1 P2 P3 P4 P5 図 4.SF- と,BM, 及び AT- の増殖曲線の比較. 図 5-3.SF- における Nanog と Sox2 の遺伝子発現. SF, 及び SM- は,BM, 及び AT- と同様な多分化能を有していたが, 軟骨細胞分化誘導による軟骨特異基質の産生能が, BM, 及び AT- に比べて高かったを平板培養下で軟骨へと分化誘導した場合, SF, 及び SM- ではゲル状のシートを形成する一方で,BM, 及び AT- ではシートが形成されなかった ( 図 6) SF, 及び SM-MSC に認められる表面抗原 ( 抗 CD44,CD90,MHC-I モノクロナール抗体に陽性, 抗 CD34 CD45 抗体では陰性 ), 及び特異遺伝子 (Nanog 及び Sox2) 発現は,BM, 及び AT- の結果と一致しており, 幹細胞としての特徴を有していた ( 図 5-1,5-2, 5-3) A. CD11a/CD18 B. CD34 C. CD44 D. CD45 Normal SFderived Diseasedc SFderived Numbers of cells Passage (P) number A C B D E. CD90 F. CD105 G. MHC-I H. MHC-II Normal SFderived derived Diseased SF- 図 5-1.SF- の表面抗原解析の結果. 図 6.SF-(A), SM-(B), BM-(C), 及び AT-(D) の軟骨誘導を平板培地で行った後, アルシアンブルーで染色図上段 A,B では青染されるゲル状シートが確認されたものの, 下段 C,D では形成されなかった

骨, 軟骨, 脂肪, 及び腱細胞への分化誘導能については, 各特異遺伝子の発現についても確認された ( 図 7-1,7-2,7-3) ALP OC Runx2 図 7-1.SF- の骨芽細胞への分化誘導に伴う特異遺伝子の発現.

多くの表面抗原を認識できる特異抗体が揃っておらず, 抗 CD90 及び CD105 抗体に対して陽性を示す細胞であることを確認したブタの SM- は,4 週間の培養で, 移植に十分な数に達した SM-

細胞を移植していない対照側の骨軟骨欠損も軟骨で被覆されていたが, 新生軟骨は薄く, 周囲との正常軟骨との違いや境界が明瞭であった ( 図 8) 図 7-2.SF- の軟骨細胞への分化誘導に伴う特異遺伝子の発現.

以上, 実験 1 の成果から, 関節症と診断されたウマの SF から分離培養される群は, 幹細胞としての性質を有し, 特に軟骨再生の新たな細胞源になることが明らかとなった SF- は SM-

軟骨分化誘導後の軟骨基質産生能が低下することが明らかとなった正常滑液についても幹細胞の分離を試みた関節疾患のある関節由来の SF と比べて, 正常関節由来の SF からは, 初代培養によって得られる

右 ( 細胞移植側 ) 左 ( 対照側 ) 図 8. 骨軟骨欠損部の病理解剖肉眼所見.

4 骨, 軟骨, 脂肪, 及び腱細胞への分化誘導能については, 各特異遺伝子の発現についても確認された ( 図 7-1,7-2,7-3) ALP OC Runx2 図 7-1.SF- の骨芽細胞への分化誘導に伴う特異遺伝子の発現. Agg Col2 Sox9 からを分離培養した方が, 移植に用いる細胞数を短期間で確保するために有用であった実験 1 で実施したウマの SM- に関する実験成果を基に, ブタの SM- を分離培養したブタにおいては, 多くの表面抗原を認識できる特異抗体が揃っておらず, 抗 CD90 及び CD105 抗体に対して陽性を示す細胞であることを確認したブタの SM- は,4 週間の培養で, 移植に十分な数に達した SM- を移植した右肩関節の骨軟骨欠損部では, 術後 3 ヵ月に行った剖検の肉眼所見において, 骨軟骨欠損部は周囲と区別できる厚い白色の軟骨によって再被覆されており, その表面には滑膜が癒着していた細胞を移植していない対照側の骨軟骨欠損も軟骨で被覆されていたが, 新生軟骨は薄く, 周囲との正常軟骨との違いや境界が明瞭であった ( 図 8) 図 7-2.SF- の軟骨細胞への分化誘導に伴う特異遺伝子の発現. PPARγ2 Scx TenC 図 7-2.SF- の脂肪及び腱細胞への分化誘導に伴う特異遺伝子の発現. 以上, 実験 1 の成果から, 関節症と診断されたウマの SF から分離培養される群は, 幹細胞としての性質を有し, 特に軟骨再生の新たな細胞源になることが明らかとなった SF- は SM- と非常に類似した分化特性を有しており, いずれも軟骨分化に適した細胞群であると考えられたまた SF- を 10 継代し, 細胞老化に伴うこの特性変化について検討したところ, 軟骨分化誘導後の軟骨基質産生能が低下することが明らかとなった正常滑液についても幹細胞の分離を試みた関節疾患のある関節由来の SF と比べて, 正常関節由来の SF からは, 初代培養によって得られるのコロニー数が有意に少なかった正常 SF からの MSC の分離培養には時間を要する可能性があり, 正常関節から移植用細胞を得るためには, 正常 SM の方が適当と考えられた実験 2 ブタの SF は採取量が少なく,SM 右 ( 細胞移植側 ) 左 ( 対照側 ) 図 8. 骨軟骨欠損部の病理解剖肉眼所見. 細胞移植側の骨軟骨欠損部には滑膜が付着し, その表面は厚い白色軟骨で被覆されている対照側に認める新生軟骨は白さを欠く矢頭で囲む領域が, 骨軟骨欠損部分である病理組織学的検査では, ヘマトキシリンエオジン (HE) 染色において,SM- を移植した骨軟骨欠損部に, 滑膜が誘導され, その下層に厚い軟骨が新生していることがわかった滑膜付着部を中心に, 軟骨表面のわずかな不整が認められたものの周辺の正常部からの移行も滑らかで, 陥凹部はほぼ解消されていた ( 図 9-1) 図 9-1. 細胞移植部の HE 染色. 骨軟骨欠損部に誘導された滑膜 ( 矢頭部分 ) の下層に, 厚い軟骨が新生されている軟骨表面の不整は少ない一方, 細胞を移植していない対照側の骨軟

骨欠損では滑膜の誘導は確認されず, 陥凹部が大きく残存しており, 軟骨表層も不整なままであった周囲との境界についても, 組織学的に明瞭であった ( 図 9-2) 骨欠損部の AB 染色では,

小腔内に収まる軟骨細胞が観察されたしかし, それらの上層の大部分は線維性結合組織及び線維軟骨の様相を呈していた ( 図 11-2) 図 9-2.

滑膜の誘導付着はなく, 陥凹部が残る陥凹部表面は不整であり, 周囲健常部との違いが明瞭である SM- を移植した骨軟骨欠損部のアルシアンブルー (AB) 染色 ( 軟骨基質を青染する特殊染色

細胞成分が少なく,1 ないし数個の軟骨細胞が 1 つの小腔内に収まり, 硝子軟骨の様相を呈していた ( 図 10-2) 図 11-1. 対照側における骨軟骨欠損部の AB 染色.

少量の硝子軟骨の上層に線維性組織と線維軟骨が観察された ( 左図 ) 線維性組織の拡大像 ( 右図 ) 図 10-1. 細胞移植部の AB 染色.

均質に染色される軟骨基質に取り囲まれる小腔内には, 軟骨細胞が収まっている細胞成分は少なく, 硝子軟骨の様相を呈している SM- を移植しなかった対照側の骨軟実験 2 の結果から,SM-

陥凹部は少量の硝子軟骨によって薄く被覆されたのみであった SM- を移植することで, 骨軟骨欠損部には軟骨再生が促されたが, それは周辺滑膜の付着を伴うものであった

5 骨欠損では滑膜の誘導は確認されず, 陥凹部が大きく残存しており, 軟骨表層も不整なままであった周囲との境界についても, 組織学的に明瞭であった ( 図 9-2) 骨欠損部の AB 染色では, 陥凹部の表層に薄く青染される軟骨基質領域が観察されるのみであり, その上層には染色性の低い線維性組織が増生していた ( 図 11-1) 軟骨基質が強く青染される数少ない領域の強拡大像では, 小腔内に収まる軟骨細胞が観察されたしかし, それらの上層の大部分は線維性結合組織及び線維軟骨の様相を呈していた ( 図 11-2) 図 9-2. 細胞移植を行わなかった骨軟骨欠損部の HE 染色. 滑膜の誘導付着はなく, 陥凹部が残る陥凹部表面は不整であり, 周囲健常部との違いが明瞭である SM- を移植した骨軟骨欠損部のアルシアンブルー (AB) 染色 ( 軟骨基質を青染する特殊染色 ) では, 軟骨表面に付着する滑膜を中心に, 正常軟骨と同様, 強く青染される軟骨基質が欠損分に充填されている組織像が認められた ( 図 10-1) 軟骨基質が強く青染される領域の強拡大像では, 細胞成分が少なく,1 ないし数個の軟骨細胞が 1 つの小腔内に収まり, 硝子軟骨の様相を呈していた ( 図 10-2) 図対照側における骨軟骨欠損部の AB 染色. 滑膜の誘導付着はなく, 再生軟骨も乏しい軟骨表面は不整であり, 周囲健常部との差が明らかである X X 図対照側における骨軟骨欠損部の AB 染色. 少量の硝子軟骨の上層に線維性組織と線維軟骨が観察された ( 左図 ) 線維性組織の拡大像 ( 右図 ) 図細胞移植部の AB 染色. 骨軟骨欠損部に誘導された滑膜下で, 強青染される軟骨基質 ( 矢頭部分 ) が再生している軟骨表面の不整は少ない X X 図細胞移植部の AB 染色 ( 強青染部分の拡大像 ). 均質に染色される軟骨基質に取り囲まれる小腔内には, 軟骨細胞が収まっている細胞成分は少なく, 硝子軟骨の様相を呈している SM- を移植しなかった対照側の骨軟実験 2 の結果から,SM- 幹細胞を移植することによって, 骨軟骨欠損部における軟骨再生が促進される可能性が示唆された細胞移植を行わなかった欠損部では, 軟骨再生活動に乏しく, 陥凹部は少量の硝子軟骨によって薄く被覆されたのみであった SM- を移植することで, 骨軟骨欠損部には軟骨再生が促されたが, それは周辺滑膜の付着を伴うものであった幹細胞移植によって周辺の健常滑膜が軟骨損傷部に誘導されて, 組織治癒及び硝子軟骨の再生を高めている可能性が強く示唆された本実験は, 実験室で分離培養した幹細胞を生体に移植することに生じる合併症を観察することが当初の目的であった SM- は PBS による細胞懸濁液として投与したが, 移植側に強い組織炎症や軟骨変性部分の拡大を示唆する所見は観察されておらず, むしろ細胞移植による有効性のみが現れる結果となった半月板損傷 ( 断裂 ) モデル動物を用いた SM- の移植治療効果に関する最近の研究によると, 移植された SM- には, 周

辺滑膜を断裂部に誘導する働きがあり, それを介して, 半月板断裂部の再生が促されると考えられている実験 2 で観察された滑膜の付着を伴う旺盛な軟骨再生という所見は, このような新しい研究成果と一致しており, SM- が関節内構造体の組織再生に適した幹細胞であることを支持するものと考えられた実験 3 自然発生性の関節内骨折のウマから採取した SF からを増幅させて, 健常なウマの右側橈骨

対照側 ) 図 12.SF- の細胞移植を行った健常馬の橈骨手根骨間関節内腔の剖検時写真.

6 辺滑膜を断裂部に誘導する働きがあり, それを介して, 半月板断裂部の再生が促されると考えられている実験 2 で観察された滑膜の付着を伴う旺盛な軟骨再生という所見は, このような新しい研究成果と一致しており, SM- が関節内構造体の組織再生に適した幹細胞であることを支持するものと考えられた実験 3 自然発生性の関節内骨折のウマから採取した SF からを増幅させて, 健常なウマの右側橈骨手根骨間関節内に注射した左側の同関節には生理食塩液のみを注射して対照とした移植後剖検を行うまでに, 左前肢及び注射部位に特異的な臨床症状 ( 関節の腫脹, 疼痛, 跛行 ) は観察されなかった投与後 3 日で病理解剖して, 肉眼的に関節内腔を評価した図 12 に示すように, 関節軟骨及び滑膜に細胞移植による影響を示唆する炎症や変性病変は認められなかった右 ( 細胞移植側 ) 左 ( 対照側 ) 図 12.SF- の細胞移植を行った健常馬の橈骨手根骨間関節内腔の剖検時写真. 移植した関節に対照側との明らかな違い ( 軟骨の変性や欠損 ) を認めない当初, ウマの関節内骨折や離断性骨軟骨炎の自然発症例に対する SF- の自家移植を行うことによって, 軟骨再生への効果を試験する計画となっていたしかしながら, 受傷後に SF- を分離培養して移植に必要な十分数の細胞を準備するためには, 1 ヵ月以上を要することが分かったこれは, 実験 1 において示したように,SF- が BM-, 及び AT- と比べて増殖率がゆっくりであることに起因すると考えられた結果的に, 自然発症例では, 関節鏡視下手術を遅らす必要が生じることから, 獣医臨床において本技術を普及させる上での障害になると考えられたそこで, 受傷後の手術までの期間を従来通り (2 週間以内 ) に保ちながら, 手術直後の細胞移植を, 予め関節内骨折の別症例 ( 別個体 ) から採取した SF- を移植する同種他家移植とすることを考えた実験 3 では, 幹細胞移植の同種他家移植の安全性を試験するために自然発症したウマの関節内骨折例から SF-, 及びを分離, 培養して, 健常な別のウマの関節内に注射した免疫抑制措置を講じなかったものの, 急性の副反応は認められなかった今後継続予定の試験では, より長期的な経過観察を行うことになっている継続中試験ウマ SF- の実験的骨軟骨欠損モデルへの移植試験他機関との共同研究として,SF-, 及び SM- の同種他家移植を実施する計画である実験用サラブレッドを 2 頭用意しており,H27 年 6 月の移植手術に向けて, 現在は, 自然発症した関節疾患への関節鏡手術の際に細胞源となる滑液や滑膜を採取し,SF, 及び SM- の増幅を継続しているこの試験を終えた後に, 臨床応用へと向かう 5. 主な発表論文等雑誌論文 ( 計 1 件 ) 1. Murata, D., Miyakoshi, D., Hatazoe, T., Miura, N., Tokunaga, S., Fujiki, M., Nakayama, K., and Misumi, K. Multipotency of equine mesenchymal stem cells derived from synovial fluid. Vet. J. 202, 53-61, (2014 Oct). 査読有学会発表 ( 計 1 件 ) 1. 村田大紀, 德永暁, 宮越大輔, 畠添孝, 三浦直樹, 藤木誠, 中山功一, 三角一浩. ウマ滑液由来間葉系幹細胞の培養とその性質第 157 回日本獣医学会於札幌市 (2014) その他ホームページ等 urg/index.php?%e7%a0%94%e7%a9%b6%e7 %B4%B9%E4%BB%8B にデータの一部を公開. 6. 研究組織 (1) 研究代表者三角一浩 (MISUMI KAZUHIRO) 鹿児島大学共同獣医学部教授研究者番号 : (2) 研究分担者帆保誠二 (HOBO SEIJI) 鹿児島大学共同獣医学部教授研究者番号 : 川口博明 (KAWAGUCHI HIROAKI) 鹿児島大学共同獣医学部准教授研究者番号 :

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<4D F736F F D20819C817990AC89CA95F18D908F91817A A196D890BD F8A A2E B CA48BA6816A> 様式 C-19 科学研究費助成事業 ( 科学研究費補助金 ) 研究成果報告書平成 24 年 5 月 31 日現在機関番号 :17701 研究種目 : 挑戦的萌芽研究研究期間 :2010 ~ 2011 課題番号 :22658100 研究課題名 ( 和文 ): 半月板損傷モデルの作成と BRP システムによる半月板の再生に関する研究研究課題名 ( 英文 ):Cruciate injury model