平成 24 年度 7 月 20 日平成 24 年度食品健康影響評価技術研究成果発表会 ( 課題番号 :0903) かび毒きのこ毒の発生要因を考慮に入れたリスク評価方法の開発カビ毒発生要因を考慮に入れたリスク評価方法の開発きのこ毒

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へいぞうさかわ
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1 平成 24 年度 7 月 20 日平成 24 年度食品健康影響評価技術研究成果発表会 ( 課題番号 :0903) かび毒きのこ毒の発生要因を考慮に入れたリスク評価方法の開発カビ毒発生要因を考慮に入れたリスク評価方法の開発きのこ毒

2 米のかび毒に関する研究摂取形態モデルの構築毒性評価米および穀類中のカビ毒のリスク評価シミュレーションシートかび毒の分析

3 主食である米に汚染するカビカビ毒の推定米に汚染するカビを単離同定しカビ毒産生能を検討した頻度高く検出されるかび毒産生菌菌種検出頻度 * 産生する可能性のあるかび毒 Aspergillus.flavus 25 % アフラトキシン Penicillium.islandicum 25 % ルテオスカイリンシクロクロロチン A.versicolor 20 % ステリグマシスティン P.citrinum 5 % シトリニン A.clavatus 5 % パツリン A.ochraceus 5 % オクラトキシン

4 米および米加工品でのカビ毒の残存率の算出 (1)

5 米および米加工品でのカビ毒の残存率の算出 (1) chratoxin A 調理によるオクラトキシン A の残存率 % %

6 米のかび毒分析分担担当者 : 久城真代 ( 独 ) 農研機構食品総合研究所 p1 アフラトキシンステリグマトシスティンオクラトキシン A シトリニンパツリンを選定したまた近年諸外国において日本で醸造に使われる黒麹菌と近縁の Aspergillus niger によるフモニシン産生の報告が出ていることからフモニシンを加えたさらに新たに標品が入手できたシクロクロロチンを加え LC-MS/MS 測定条件を検討した同時検出条件を見出すとともに問題となっていたシトリニンの回収率の改善を行った H HC CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 オクラトキシンA アフラトキシンB1 アフラトキシンG1 ステリグマトシスティンシトリニン H H H H H 3 C CH 3 H CH 3 CH 3 H NH 2 パツリン H フモニシン B1 シクロクロロチン図 1. 選定した主要かび毒の構造式

7 < 具体的データ > 表 1.MS/MS 測定条件と保持時間研究項目名 : 米のかび毒分析 p2 効率的な一斉分析条件を見出した

オクラトキシン A(TA) の腎発がん機序に対する遺伝毒性メカニズムの関与を調べるために

実験方法 0 4 13 weeks 動物種系統 : 雌雄 F344 gpt delta

ppm TA 腎全体由来 genomic DNA を用いた in vivo 変異原性評価 (

雌雄ともに陰性 : Sacrifice 病理組織学的検索髄質外帯外層における毒性発現

有機アニオントランスポーターアポトーシス空胞変性皮質を含むその他の部位に著変なし TA

8 オクラトキシン A(TA) の腎発がん機序に対する遺伝毒性メカニズムの関与を調べるために gpt delta ラットを用い標的臓器腎臓における in vivo 変異原性評価を実施した実験方法 weeks 動物種系統 : 雌雄 F344 gpt delta ラット実験開始時週齢 :6 週齢結果のまとめ Control (Basal Diet) 5 ppm TA 腎全体由来 genomic DNA を用いた in vivo 変異原性評価 ( 投与 13 週目の腎臓 ) gpt および Spi - mutant frequency: 雌雄ともに陰性 : Sacrifice 病理組織学的検索髄質外帯外層における毒性発現カリオメガリー TA S3 セグメント TA TA TA TA TA 部位特異的毒性発現 : 有機アニオントランスポーターアポトーシス空胞変性皮質を含むその他の部位に著変なし TA の腎臓中動態に起因した毒性発現の部位特異性から標的部位での in vivo 変異原性評価が必要であると考えられた

TA の部位特異的毒性発現を考慮し腎皮質部および髄質外帯部における in vivo 変異原性評価を実施した実験方法動物種系統 : 雄

in vivo 変異原性 5 ppm TA 皮質 gpt およびSpi - mutant frequency: 陰性髄質外帯 (

frequency: 陽性 1 剖検時眼科用反剪ばさみを用いて肉眼的に各部位を採取 gpt mutant frequency ( 10-5

2 0 Control TA Spi - mutant frequency ( 10-5 2 0 Control TA *:

9 TA の部位特異的毒性発現を考慮し腎皮質部および髄質外帯部における in vivo 変異原性評価を実施した実験方法動物種系統 : 雄 F344 gpt delta ラット実験開始時週齢 :6 週齢 0 Control (Basal Diet) 4 weeks 部位毎の in vivo 変異原性 5 ppm TA 皮質 gpt およびSpi - mutant frequency: 陰性髄質外帯 ( 毒性標的部位を含む ) : Sacrifice gpt mutant frequency: 陰性 1 Spi - mutant frequency: 陽性 1 剖検時眼科用反剪ばさみを用いて肉眼的に各部位を採取 gpt mutant frequency ( 10-5 ) Control TA Spi - mutant frequency ( 10-5 ) Control TA *: Significantly different from the control at p<0.05. * 発がん標的部位を含む髄質外帯の in vivo 変異原性が明らかとなったことから TA により誘発される腎発がん機序に遺伝毒性メカニズムの関与が強く示唆された

TA の腎発がん機序をより詳細に調べるために腎皮質および髄質外帯部における cdna マイクロアレイ法による網羅的遺伝子発現解析を実施した実験方法動物種系統 : 雄

TA : Sacrifice 髄質外帯部において DNA 二重鎖切断修復に関わる (Chek1 Rad18 Brip1 Brcc3 等 ) 細胞周期促進に関わる

Bik) 癌抑制遺伝子 p53 に関わる (Phlda3 Ccng1) 遺伝子群が顕著な変動を示した TA が誘発する欠失変異は DNA

Phlda3 Cyclin G1 Bak1 Cyt c Bik Caspase Activation Apoptosis DSBRs (HRRs) Brip1 Rad18

10 TA の腎発がん機序をより詳細に調べるために腎皮質および髄質外帯部における cdna マイクロアレイ法による網羅的遺伝子発現解析を実施した実験方法動物種系統 : 雄 F344 gpt delta ラット実験開始時週齢 :6 週齢 0 Control (Basal Diet) 4 weeks 部位毎の網羅的遺伝子発現解析 5 ppm TA : Sacrifice 髄質外帯部において DNA 二重鎖切断修復に関わる (Chek1 Rad18 Brip1 Brcc3 等 ) 細胞周期促進に関わる (Ccne1 Ccna2 Ccnb1 等 ) DNA 損傷応答を介した G2/M arrest 誘発に関わる (Chek1 Wee1) Bcl-2 family (Bak1 Bik) 癌抑制遺伝子 p53 に関わる (Phlda3 Ccng1) 遺伝子群が顕著な変動を示した TA が誘発する欠失変異は DNA 二重鎖切断後の修復過程に生じている可能性が示された TA が誘発するカリオメガリーアポトーシスは何れも DNA 損傷が引き金となって引き起こされている可能性が考えられた Phlda3 Cyclin G1 Bak1 Cyt c Bik Caspase Activation Apoptosis DSBRs (HRRs) Brip1 Rad18 p53 Bcl-2 family activation Chk1 Brcc3 Mitochondrial pathway DNA damage DNA repair error?? TA Gene Mutation (Deletion mutation) Carcinogenesis DSB P Chk1 P Wee1 p53 Cyclin B M Cyclin A2 G2 G2/M arrest activation G1 Cell proliferation Karyomegaly G1/S arrest? Cyclin E1 S Cyclin A2 p53

11 TA 誘発腎発がん機序解明に関する研究の総括研究成果のまとめ 1. TA は DNA 二重鎖切断を引き起こしその修復過程で遺伝子欠失変異を誘発していることが示唆され TA 腎発がん機序への遺伝毒性メカニズムの関与の可能性が示された 2. TA 誘発欠失変異ならびにアポトーシスに対し p53 が抑制的に寄与することが明らかとなった 3. TA は発がん標的部位で細胞増殖活性能ならびに DNA 傷害を引き金とした細胞周期停止能を有し結果として巨大核の出現が誘発されるものと考えられたまたこの細胞増殖亢進作用は TA の腎発がん過程に促進的に作用していることが示唆された結論 TA 誘発腎発がん機序に対する遺伝毒性メカニズムの関与が明らかとなり本研究成果はヒトの食に対する安全に大きく貢献するものと思われた

12 摂取形態モデルの構築かび毒の分析毒性評価カビ毒のまとめ米に着床するカビから汚染するカビ毒を特定 AFL, TA, CIT の調理中の残存率を明らかにした米に汚染すると予想されるカビ毒を対象に一斉分析を確立遺伝毒性メカニズムの関与が明らかにした TA 誘発腎発がん機序に対する米および穀類中のカビ毒のりスク評価シミュレーションシート

13 米および穀類中のカビ毒のりスク評価シミュレーションシート Excel をご覧ください

14 きのこ毒 ( スギヒラダケ毒素 ) に関する研究スギヒラタケのシアン化物イオンの存在状態解析スギヒラダケ中毒の原因物質の解明スギヒラタケ由来シアノ配糖体画分の経口投与による毒性評価スギヒラタケ培養条件の検討

菌株 ITS グループ CN - (mg/g 乾燥菌体 ) 相対生長量 (PDA medium) スギヒラタケ単離菌株の培養栄養菌糸体の形態多様性 < 結果及び考察 > 1 CHU0006 B 0.002 ++ 2 CHU0011 B 0.

15 スギヒラタケ培養条件の検討 < 研究内容と方法 > スギヒラタケの人工培養は子実体組織及び担子胞子から分離培養を行う併せて発生要因を評価するためにスギヒラタケの亜種成長速度とスギヒラタケのシアン配糖体の生産能の関連ついても明らかにする Table 1 スギヒラタケ栄養菌糸体のシアン配糖体含有量と隠蔽分類群生長量との関係 No. 菌株 ITS グループ CN - (mg/g 乾燥菌体 ) 相対生長量 (PDA medium) スギヒラタケ単離菌株の培養栄養菌糸体の形態多様性 < 結果及び考察 > 1 CHU0006 B CHU0011 B CHU0022 B /++ 4 CHU0023 B /++ 5 CHU0035 A NBRC30334 A NBRC30384 B 各菌株の ITS 配列による 2 種類の隠蔽分類群, 生長量とシアン配糖体含有量との間にも一定の関係はみられなかった以上のことからスギヒラタケのシアン配糖体生産能は菌株の系統や栄養菌糸速度との相関を示さず各菌株毎の遺伝特性に基づくところが大きいと推察された

16 アデニン誘発性腎不全ラットへのスギヒラタケ由来シアノ配糖体画分の経口投与による毒性評価手法シアン配糖体投与実験方法試験群投与液濃度 ( シアン化物イオン産生量として ) アデニン誘発性腎不全ラット被験物質経口投与 20ml/kg 体重になるよう被験物質を投与した採血被験物質投与 8 時間後被験物質投与 24 時間後経過観察 (8 時間 ) 採血剖検対照群 (3 匹 ) 正常な腎臓注射用蒸留水低用量群 (3 匹 ) 360mg/kg 体重 (0.31mg/kg 体重 ) 高用量群 (q3 匹 ) 2840mg/kg 体重 (2.44mg/kg 体重 ) 腎臓の尿細管に 2,8-dihydroxyadenine (DHA) 結晶沈着, 尿細管拡張, 異物巨細胞及び好中球浸潤間質の線維化等慢性腎不全様の症状がみられたアデニン摂取群全血を全摘する採血脳を採取する全血液中のシアン化物イオン及びチオシアン酸イオン分析 0.1 規定 NaH 溶液を加えて溶血させ -30 で保存対照群投与 1 時間後の様子 ( 丸まって寝ている様子 ) 0.1 規定 NaH 溶液を加えてホモジェネートし -30 で保存脳中のシアン化物イオン及びチオシアン酸イオン分析高用量群投与 1 時間後の様子 ( 横たわって寝ている様子 ) 10% 中性ホルマリンで固定病理学的検査高用量群投与 1 時間後の様子 ( 力がはいらない様子 ) 対照群低用量群は変化が認められなかった高用量群の 1 個体の披験物質投与 1 時間後に神経症状が観察された高用量投与 1 時間後に認められた神経症状はスギヒラタケシアン配糖体摂取の影響が示唆された Cerebrum, Caudal nucleus Cerebrum, Cortex 対照群高用量群大脳皮質大脳尾状核海馬において病理学的所見に

17 全血中のシアン化物イオンとチオシアン酸イオンの経口投与後の値から経口投与前の値を差し引いた値 ( 増加量 ) 脳中のチオシアン酸イオン濃度の分析シアン化物イオン (CN-) チオシアン酸イオン (SCN-) ** ** ** ** ** * 対照群中用量群高用量群対照群中用量群高用量群対照群中用量群高用量群血中のシアン化物イオン (CN-) 濃度及びチオシアン酸イオン (SCN-) 濃度の増加量は対照群の増加量と比べて高値を示した高用量投与群の増加量は低用量投与群の増加量と比べて高値を示したシアノ配糖体投与群では対照群と比べて有意に高値を示しまた高用量投与群の値は低用量投与群の値に比べ有意に高値を示し投与量依存的に増加することが示唆された H H H H H H b-glucosidase H H H 糖生体内生体内シアノ配糖体代謝経路 CN? スギヒラタケシアノ配糖体蓄積 CN - (HCN) rhodanese 蓄積 SCN - 腎障害尿排泄結論スギヒラタケ中のシアノ配糖体画分をアデニン投与慢性腎不全ラットに投与し生体内でシアン化物イオンにその後チオシアン酸イオンに代謝され血中及び脳中に蓄積されることが示唆された

18 発表論文 1) Masayo Kushiro, Hiroyuki Nakagawa, Hitoshi Nagashima, Michihiko Saito. Fumonisin B2 production on agar media by Aspergillus niger of Japanese origin. Mycotoxins 2(61), (2011). 2) Masayo Kushiro, Hatsuo Saitoh, Yoshitsugu Sugiura, Takayuki Aoki, Shin-ichi Kawamoto, Toyozo Sato. Experimental infection of Fusarium proliferatum in ryza sativa plants; fumonisin B1 production and survival rate in grains. International Journal of Food Microbiology 156(3), (2012). 3) Hibi D, Suzuki Y, Ishii Y, Jin M, Watanabe M, Sugita-Konishi Y, Yanai T, Nohmi T, Nishikawa A, Umemura T. Site-Specific In Vivo Mutagenicity in the Kidney of gpt Delta Rats Given a Carcinogenic Dose of chratoxin A. Toxicological Sciences (2), ) Akira Suzuki, Hoang Pham Nguyen Duc, Kosuke Nakamura, Hiroshi Akiyama and Yoshimasa Kasahara, Remarkable growth variation in a natural Japanese population of Pleurocybella porrigens, Jpn.J. Food Chem.Safety, 18, (2011). 5) Asako Watanabe-Ishitsuka, Hiroshi Akiyama, Kazunari Kondo, Saemi bitsu, Nobuo Kawahara, Reiko Teshima, and Yukihiro Goda, Determination of cyanogenic glycoside linamarin in cassava flour using liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Jpn.J. Food Chem.Safety, in press (2011). 6) Tsuruda S, Akaki K, Hiwaki H, Suzuki A, Akiyama, Multiplex Real-Time PCR Assay for Simultaneous Detection of mphalotus guepiniformis and Lentinula edodes. H.Biosci

Untitled

Untitled 上原記念生命科学財団研究報告集, 25 (2011) 86. 線虫 C. elegans およびマウスをモデル動物とした体細胞レベルで生じる性差の解析井上英樹 Key words: 性差, ストレス応答,DMRT 立命館大学生命科学部生命医科学科緒言性差は雌雄の性に分かれた動物にみられ, 生殖能力の違いだけでなく形態, 行動などそれぞれの性の間でみられる様々な差異と定義される. 性差は, 形態や行動だけでなく疾患の発症リスクの男女差といった生理的なレベルの差異も含まれる.

平成 24 年度 7 月 20 日 平成 24 年度食品健康影響評価技術研究成果発表会 ( 課題番号 :0903) かび毒 きのこ毒の発生要因を考慮に入れたリスク評価方法の開発 カビ毒 発生要因を考慮に入れたリスク評価方法の開発 きのこ毒

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