健康研究成果の実用化加速のための研究 開発システム関連の隘路解消を支援するプログラム 多能性幹細胞由来移植細胞の安全性評価研究 ( 公財 ) 先端医療振興財団川真田伸 2015 年 1 月 23 日

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1 健康研究成果の実用化加速のための研究 開発システム関連の隘路解消を支援するプログラム 多能性幹細胞由来移植細胞の安全性評価研究 ( 公財 ) 先端医療振興財団川真田伸 2015 年 1 月 23 日

2 スーパー特区 (7) H20-24 ICR の推進による再生医療の実現化 PI 西川伸一 ( 先端医療振興財団研究所長 ) 再生医療の実現化を阻む基礎課題解決西川伸一 再生医療の普及医療への転換 (CRP の実現 ) 田中紘一 Neo biomarker, epigenetic study 理研 CDB, MIC,CLST, 関西 tissue initiative ( 阪大 産総研尼崎 ) 京大再生研 京大病院 橋渡し研究拠点を活用し 医師主導治験を実施神戸拠点 多拠点 NW 形成 心筋シートによる心筋再生阪大 スーパー特区採択枠で科研費採択 ips 細胞由来 RPE 網膜再生理研 CDB CPC 教育京大 軟骨再生神戸大 財団 角膜再生京府医 財団 文科省橋渡し拠点形成 P で支援

3 健康研究成果の実用化加速のための研究 開発システム関連の隘路解消を支援するプログラム スーパー特区 (7) 神戸 再生医療実現化 理研 CDB 高橋 G IPS 細胞由来 RPEによるAMD 治療計画 先端医療振興財団川真田 G 隘路 : 前臨床安全性試験隘路解消のため安全性試験実施 安全性試験に関するサイトの管理運営 情報発信の実施 国立衛生研究所佐藤 G JST 隘路解消研究解題

4 ips 細胞由来分化細胞の臨床試験開始に 前臨床試験造腫瘍性試験 向けた臨床開発の流れ 理研 CDB ヒト幹細胞臨床指針への申請 2013 年 先端医療振興財団 隘路 理研 CDB 細胞製造細胞規格臨床プロトコール決定 Whole genome sequence Methylome analysis CiRA 審議 / 許可 臨床試験の実施 2014 年 9 月

5 自家 ips 細胞由来網膜色素上皮細胞による 加齢黄斑変性症の治療実施 読売新聞 2014 年 9 月 13 日

6 当該プログラムでの成果 1 ヒト幹細胞指針申請用安全性 ( 造腫瘍性 ) データ 造腫瘍性試験(in vivo) in vitroにおける移植細胞評価方法の開発 確立 H25 年度ヒト幹臨床研究申請, H26 年度臨床実施 2 ips 由来移植細胞の安全性に関する情報収集 発信 ガイダンス提言 国衛研のHPとして運営 関連リンクも充実しており science community で大いに活用されている 論文 1. Kuroda et al PLoS ONE 2012 : detection of ipsc in RPE by qrt-pcr 2. Kanemura et al Science Report 2013 : induction apoptosis of ipsc by PEDF 3. Kanemura et al PLoS ONE 2014: summary of tumorigenicity test of RPE 4. Kawamata et al JCM 2015 : Design of tumorigenicity tests of Pluripotent Stem cell derived cell products 受賞 2014 日本再生医療学会 Johnson and Johnson Innovation Award 国衛研佐藤陽治 ヒト多能性幹細胞加工製品に残存する未分化多能性幹細胞の高感度検出法の開発

7 造腫瘍性試験の実施の課題 細胞治療に使われる細胞の造腫瘍性試験のガイドライン 存在していない WHO Technical Report Series No.878, Annex Requirements for the Use of Animal Cells as in Vitro Substrates for the Production of Biologicals. FDA commentary report Science Translational Medicine. 2012, 4, 147fs28 Bailey A.M; Balancing tissue and tumor formation in regenerative medicine. Geron: GRNOPC1, ACT: RPE case by case

8 網膜色素上皮細胞 (RPE) の造腫瘍性試験実施 1 次安全性試験 2 次安全性試験 3 4 次安全性試験 ips 作製方法 RV,SV mouse feeder Plasmid A set mouse feeder Plasmid B set auto feeder 製造施設 ラボ CPC CPC 被験細胞のキャラクタライゼーション遺伝子発現 (qrt-pcr) 抗体染色 FACS 最終的な RPE 製造 品質管理工程との差異 大きい ( 原材料 製造方法 製造施設に顕著な差異 ) 小さい ( 原材料 製造方法に顕著ではない差異 ) 最終的な製造 品質管理工程とほぼ同一 皮下 n=80 1 次安全性試験 Nude mouse, SCID NOD-SCID NOG mouse NOD-SCID 皮下 n=71 2 次安全性試験 NOG mouse Nude rat 皮下 n=47 3 次安全性試験 網膜下 n= 皮下 n=12 網膜下 n=15 4 次安全性試験

9 各種免疫不全マウスにおける腫瘍形成能比較試験 e 造腫瘍性試験 Log 10 TPD50 Matrigel あり Matrigel なし HeLa 細胞皮下移植 皮下移植後の週齢

10 NOG マウス皮下移植での造腫瘍性試験 (ips 細胞 HeLa 陽性 control 試験 ) 細胞種 ipsc 201B7 Hela 細胞形状 imatrigel 包埋単細胞懸濁 imatrigel 包埋単細胞懸濁 腫瘍形成最少量 腫瘍形成週 ( 最初と最終 ) 使用マウス数 TPD50 1 x 10 1 個 5 週と 40 週 30 匹 132 個 1 x 10 1 個 5 週と 18 週 75 匹 12.6 個 4 Log 10 造腫瘍性試験 (Log10TPD50) 3 ipsc Log10TPD50 = 2.12 Mesoderm 2 1 Hela Log10TPD50 = 1.1 Endoderm 50 mm 50 mm 0 Matrigelに包埋 皮下移植週 (weeks) Kawamata et al 2015 JCM 改 Ectderm 50 mm

11 qrt-pcr を用いた RPE 中の ips 細胞混入の検出 Lin28 を primer にすれば 0.002% の ips 細胞混入を qrt-pcr で検出可能 Kuroda et al PLoS ONE 2012

12 NOG 皮下移植での ips 細胞由来 RPE の造腫瘍性試験 RPE 株名細胞形態移植細胞数観察期間マウス数 ( 匹 ) 腫瘍形成 59-G3 9 なし Matrigel 包埋 K21-G18 RPE 細胞懸濁 1x10 6 個 60 週 8 なし 101-G25 10 なし 59-G3 5 なし Matrigel 包埋 K21-G18 RPEシート 1x10 6 個 60 週 5 なし 101-G25 5 なし primary RPE primary RPE Matrigel 包埋 RPE 細胞懸濁 1x10 6 Matrigel 包埋 (-) RPE 細胞懸濁 1x10 6 個 52 週 3 なし 個 52 週 2 なし 59-G3 32 週 3 なし Matrigel 包埋 RNT10 RPE RPEシート 1x10 6 個 28 週 3 なし RNT9 RPE 20 週 3 なし 101-EV3 Matrigel 包埋 RPE 細胞懸濁 1x 週 5 なし個 K11-EV9 39 週 3 なし K21-EV15 Matrigel 包埋 (-) RPE 細胞懸濁 1x 週 4 なし個 K11-EV9 39 週 2 なし

13 NOG 皮下移植での ips 細胞由来 RPE の造腫瘍性試験 50 mm Ki mm VIS 20 mm Hoechst 20 mm VIS 20 mm Lamin A 20 mm VIS 20 mm BEST1 20 mm Hoechst 20 mm BEST1 + Hoechst 20 mm Kanemura et al PLoS ONE 2014

14 Nude rat 網膜下移植での ips 細胞由来 RPE 造腫瘍性試験 細胞種 細胞形態 腫瘍形成最少細胞数 腫瘍形成観察 ( 最初と最後 ) ラット数 TPD50 ipsc 201B7 単細胞懸濁 1 x 10 4 個 7 週と 33 週 20 匹 5.0X10 4 個 Hela 単細胞懸濁 1 x 10 1 個 5 週と 33 週 13 匹 21 個 Log10 7 造腫瘍性試験 (Log10TPD50) ipsc Hela NC ipsc Mesoderm 6 5 ipsc Log10TPD50 = 4.73 ipsc 50 mm 4 NC Endoderm 3 2 Hela Log10TPD50 = mm 1 網膜下移植週 Ectoderm Kawamata et al 2015 JCM 改 ( 週 ) teratoma 2 mm 50 mm

15 移植部位 ( 網膜下部位 ) の微細環境評価 ips 細胞と RPE の共培養による ips 細胞への影響 ips 細胞培地 ips 細胞 253G1 細胞数 ips 細胞 253G1 由来 RPE ipsc clone :253G Day Day2 Day4 Day6 ips 細胞単独培養 RPE と共培養

16 Kanemura et al Science Reports 2013 移植部位微細環境の評価 RPE 分泌因子 (PEDF) による ES/iPS 細胞の細胞死誘導 (50mg/ml)

17 Nude rat 網膜下移植での ips 細胞由来 RPE 造腫瘍性試験 RPE 株細胞形態移植細胞数観察期間ラット数 ( 匹 ) 腫瘍形成 59-G3 4 なし K21-G18 RPE 細胞シート x10 4 個 60 週 5 なし 101-G25 3 なし 59-G3 32 週 8 なし RNT10 RPE RPE 細胞シート x10 4 個 28 週 8 なし RNT9 RPE 20 週 8 なし

18 Nude rat 網膜下移植での ips 細胞由来 RPE 造腫瘍性試験 Vitreous body NT RPE 500 mm 20 mm Ki mm Hoechst 20 mm Hoechst + VIS 20 mm J Lamin 20 mm Hoechst 20 mm Hoechst + lamin A 20 mm 20 mm BEST1 20 mm Hoechst 20 mm Hoechst + BEST1 20 mm 20 mm Kanemura et al PLoS ONE 2014

19 Nude rat 網膜下移植での ips 細胞由来 RPE 造腫瘍性試験 NT transplanted Vitreous body Vitreous body Lamin Lamin DAPI + Lamin

20 造腫瘍性試験の結果と結論 臨床では 4-8x104 個の網膜色素上皮細胞 (RPE) を移植 1.QRT-PCRでの移植前の品質検査実施 >0.002% のiPS 細胞混入を検知 臨床用 RPEのQRT-PCR 試験が (-) 陰性なら 移植用 RPE 内の未分化 ips 細胞残留は 2 個以下と想定 品質規格試験 2. 皮下移植試験では130 個のiPS 細胞残留で半分のマウスで腫瘍ができる 皮下移植試験で1x106 個のRPE 皮下移植でも腫瘍形成 (-) n=96, 19M 移植用 RPE 内の未分化 ips 細胞残留は 10 個以下と想定 移植用 RPE 内に腫瘍形成能のある細胞の残留はない In vitro 腫瘍能評価試験 3. 網膜下移植試験では5x104 個のiPS 細胞を移植しないと腫瘍ができない 網膜下に x104 個の移植用 RPEを移植したが 腫瘍形成 (-) n=36,18m RPEは ips/es 細胞に細胞死を誘導するPEDFを分泌 網膜下移植では 臨床用 RPE 内にiPS 細胞残の可能性ほぼない 網膜下移植では RPE 内に腫瘍形成能のある分化細胞の残留はない In vivo 造腫瘍性試験 現在の製造工程で製造された RPE を網膜下に移植する限り 腫瘍形成する可能性は ほぼない ( 無視できる ) と判断した

21 で 我々は何を学んだか?

22 臨床試験実施の流れ 前臨床安全性試験 毒性試験 造腫瘍性試験 有効性 POC 試験 生体内動態検査 臨床試験申請 特性解析 臨床試験実施 製造 検査手順書 品質規格 細胞製剤の製造工程と品質試験

23 動物を使った前臨床安全性試験 造腫瘍性試験が多能性幹細胞由来細胞では特に重要 何故か?

24 動物を使った前臨床安全性試験 造腫瘍性試験が多能性幹細胞由来細胞では特に重要 1 未分化状態では 無限の増殖能があるため 培養継代が進むと 染色体構造の変異の蓄積が進み それによる癌化の可能性が増大する (ES/iPS 細胞 ) 2 未分化状態では 無限の増殖能があるため 分化誘導時分化細胞中に分化抵抗性未分化細胞が残留し そこから奇形種発生の可能性あり (ES/iPS 細胞 ) 3 不完全な初期化や初期化時に導入された初期化因子の残存による分化抵抗性の獲得や癌化の可能性がある (ips 細胞 ) 4 自己 ips 細胞由来分化細胞の移植では 免疫障壁がないので 上記の要因による癌発生の危険性がさらに増大する ( 自家 ips 細胞 )

25 多能性幹細胞 (ES/iPS 細胞 ) の遺伝子の不安定性 552 samples of 219 ipscs & 1,163 samples of 40 hescs Nat Rev Gen 2012:13, abnormality 12.9% of ESCs 12.5% of ipscs Difference by medium or by on feeder or feeder-less was trivial bp CNV 14.5% of ESCs and ipscs (normal ) sites variation. Chr 8 amplification 20.2% of ipscs, <10% ESCs Chr 12, 12 pc amplification <20% of ESCs and ipscs

26 動物を使った前臨床安全性試験 造腫瘍性試験が多能性幹細胞由来細胞では特に重要 何故か? 1 未分化状態では 無限の増殖能があるため 培養継代が進むと 染色体構造の変異の蓄積が進み それによる癌化の可能性が増大する (ES/iPS 細胞 ) 2 未分化状態では 無限の増殖能があるため 分化誘導時分化細胞中に分化抵抗性未分化細胞が残留し そこから奇形種発生の可能性あり (ES/iPS 細胞 ) 3 不完全な初期化や初期化時に導入された初期化因子の残存による分化抵抗性の獲得や癌化の可能性がある (ips 細胞 ) 4 自己 ips 細胞由来分化細胞の移植では 免疫障壁がないので 上記の要因による癌発生の危険性がさらに増大する ( 自家 ips 細胞 )

27 培養条件による多能性幹細胞の分化抵抗性の獲得 未分化維持増殖 多能性幹細胞 ( 機能正常 ) EB 形成 EB 接着後分化 分化誘導 培養条件 A 未分化維持増殖 分化抵抗性獲得多能性幹細胞 培養条件 B 分化誘導 EB 形成不可分化不可

28 動物を使った前臨床安全性試験 造腫瘍性試験が多能性幹細胞由来細胞では特に重要 何故か? 1 未分化状態では 無限の増殖能があるため 培養継代が進むと 染色体構造の変異の蓄積が進み それによる癌化の可能性が増大する (ES/iPS 細胞 ) 2 未分化状態では 無限の増殖能があるため 分化誘導時分化細胞中に分化抵抗性未分化細胞が残留し そこから奇形種発生の可能性あり (ES/iPS 細胞 ) 3 不完全な初期化や初期化時に導入された初期化因子の残存による分化抵抗性の獲得や癌化の可能性がある (ips 細胞 ) 4 自己 ips 細胞由来分化細胞の移植では 免疫障壁がないので 上記の要因による癌発生の危険性がさらに増大する ( 自家 ips 細胞 )

29 細胞の初期化が不全であれば分化抵抗性が出現 分化細胞 A 分化細胞 B 分化細胞 C 分化細胞 D 分化誘導 初期化法 A 樹立株の選択 分化誘導 分化誘導 樹立株の選択 初期化法 B ips 細胞 A ES 細胞 ips 細胞 B

30 動物を使った前臨床安全性試験 造腫瘍性試験が多能性幹細胞由来細胞では特に重要 何故か? 1 未分化状態では 無限の増殖能があるため 培養継代が進むと 染色体構造の変異の蓄積が進み それによる癌化の可能性が増大する (ES/iPS 細胞 ) 2 未分化状態では 無限の増殖能があるため 分化誘導時分化細胞中に分化抵抗性未分化細胞が残留し そこから奇形種発生の可能性あり (ES/iPS 細胞 ) 3 不完全な初期化や初期化時に導入された初期化因子の残存による分化抵抗性の獲得や癌化の可能性がある (ips 細胞 ) 4 自己 ips 細胞由来分化細胞の移植では 免疫障壁がないので 上記の要因による癌発生の危険性がさらに増大する ( 自家 ips 細胞 )

31 自家移植では免疫拒絶がないため移植細胞は生着し腫瘍形成能は他家より高くなる 自家移植 自分の細胞を自分の臓器に移植 生着し増殖する 他家移植 HLA 不適合他家移植 移植細胞を免疫拒絶する

32 動物を使った前臨床安全性試験 造腫瘍性試験が多能性幹細胞由来細胞では特に重要 しかし造腫瘍性試験のガイドラインは存在していない FDA Science Translational Medicine. 2012, 4, 147fs28 Geron: GRNOPC1, ACT: RPE case by case ES/iPS 細胞を段階的希釈で最終細胞産物に混入 (0:100,10:90,20:80 ) して臨床移植予定部位に移植 6 カ月以上観察する 皮下試験無意味 RPE の網膜下移植では この試験の実施自体無意味 ヒトとマウスは違うので 皮下試験の品質試験の方が意味がある

33 そもそも動物での造腫瘍性試験がどの程度ヒトに有効か ( ヒトに外挿できるか ヒトでの結果を予測出来るか )? 単に試験をするだけでは無理 では外挿できる試験とはどんなもの? 試験結論が有効であることを示す評価系をまず構築し その評価系の下で動物試験を実施すれば 試験結果の有効性が証明 (validate) される そこで初めて ヒトでの試験結果が予測可能となる では試験結果の有効性が担保できる評価系を構築するには? 予備試験を実施し risk assessment の観点から有害事象を見逃すリスクのある事象をまず同定する そのうえで試験結果が無意味にならない試験デザインを統計学的手法で構築し その試験デザインに基づいて本試験を実施する

34 ヒトに外挿できる造腫瘍性試験にするには ヒトの細胞の投与? 腫瘍が出来ませんでした?

35 ヒトに外挿できる造腫瘍性試験にするには ヒトの細胞の投与 ヒトの細胞の投与 In vivo 予備試験 腫瘍が出来ませんでした? 試験物遺伝子検査 In vitro 評価試験 腫瘍が出来ませんでした

36 そもそも動物での造腫瘍性試験がどの程度ヒトに有効か ( ヒトに外挿できるか ヒトでの結果を予測出来るか )? 単に試験をするだけでは無理 では外挿できる試験とはどんなもの? 試験結論が有効であることを示す評価系をまず構築し その評価系の下で動物試験を実施すれば 試験結果の有効性が証明 (validate) される そこで初めて ヒトでの試験結果が予測可能となる では試験結果の有効性が担保できる評価系を構築するには? 予備試験を実施し risk assessment の観点から有害事象を見逃すリスクのある事象をまず同定する そのうえで試験結果が無意味にならない試験デザインを統計学的手法で構築し その試験デザインに基づいて本試験を実施する

37 Risk Management の観点から有害事象を見逃すリスクのある造腫瘍性試験とは? 1 免疫不全動物を十分に検討せず選択した 偽陰性 造腫瘍感度が悪く 試験細胞が造腫瘍能を持っているのに検出できない 見落とした 2 試験 protocolが不適切で腫瘍形成を十分検出できない 偽陰性 観察期間が不十分で ( 短すぎて ) 腫瘍発生を検出できなかった 投与量が少なすぎて 腫瘍発生を検出できなかった 投与方法が不適切であった 移植部位の微細環境の評価をしていなかった 3 移植自体が失敗して偽陰性に気付かなかった 偽陰性 移植操作が失敗していて そもそも移植部位に細胞が移植できていなかった 移植後移植細胞が死滅していて 生細胞がいなかったので腫瘍が出来なかった 4 移植細胞の移植後の動態を十分に検出できない 遠隔転移を評価出来ず 見落としていた 偽陰性 5 試験細胞の性状や遺伝子情報も知らずに 造腫瘍性試験を行った 試験細胞の細胞規格が造腫瘍性試験結果に影響するため これはリスクというより無謀

38 ヒトに外挿できる 造腫瘍性試験を実施するには 有害事象を見逃すリスクのある造腫瘍性試験とは? 1 免疫不全動物の選定 : 感度テスト 陽性対照でTPD50 算定偽陰性予備試験を各免疫不全動物に対して実施し 最適動物種を選定する 1 免疫不全動物を十分に検討せず選択した 造腫瘍感度が悪く 試験細胞が造腫瘍能を持っているのに検出できない 見落とした 2 動物試験の条件の設定 : 観察期間 投与量 投与 route 投与法 偽陰性移植部位の微細環境の評価など 陽性対照でTPD50 算定検出限界を査定 2 試験 protocolが不適切で腫瘍形成を十分検出できない 観察期間が不十分で ( 短すぎて ) 腫瘍発生を検出できなかった する予備試験を実施 投与量が少なすぎて 腫瘍発生を検出できなかった 投与方法が不適切であった 移植部位の微細環境の評価をしていなかった 3 移植細胞の同定 : 核染色 ヒト特異抗体 (STEM121, Lamin 偽陰性 A+C, HNA 3E1.3), 3 移植自体が失敗して偽陰性に気付かなかった ヒト分化抗体 移植操作が失敗していて そもそも移植部位に細胞が移植できていなかった Ki67 陽性率選定 染色予備試験を陽性対照で実施 移植後移植細胞が死滅していて 生細胞がいなかったので腫瘍が出来なかった 4 移植細胞の体内追跡試験 :label 法 / 検出系の予備試験を実施 偽陰性 4 移植細胞の移植後の動態を十分に検出できない 遠隔転移を評価出来ず 見落としていた 5 試験細胞の細胞規格 : QC/ 製造記録, exon seq.,mband, FISH CGH array 等で染色体の評価実施のうえで移植試験を開始 5 試験細胞の性状や遺伝子情報も知らずに 造腫瘍性試験を行った 試験細胞の細胞規格が造腫瘍性試験結果に影響するため これはリスクというより無謀

39 ヒトに外挿できる造腫瘍性試験にするには ヒトの細胞の投与 予備試験 組織染色試験 試験物遺伝子検査移植部位微小環境評価 腫瘍が出来ませんでした

40 有効な造腫瘍性試験実施に向けて 実際に臨床で用いる細胞数や投与経路および一連の pilot study の結果を勘案し 試験の合理性とその結果の妥当性を担保できる一連の試験デザインを組み試験を実施する 造腫瘍性試験皮下移植造腫瘍性試験陽性対照移植でのPilot study 種選択 皮下移植試験 dose, period 造腫瘍性試験臨床ルートで移植試験を実施 造腫瘍性試験臨床ルート陽性対照移植でのPilot study dose, period mband, exon seq. mfish, G-Band qrt-pcr 未分化細胞検出 動物組織でのヒト試験細胞同定 ICH pilot study In vitro 微小環境評価試験

41 謝辞 ( 敬称略 ) 理研 CDB 国立衛生研究所 先端医療振興財団 高橋正代万代道子鎌尾浩行森永千桂子坂井徳子秋丸裕司 佐藤陽治安田智黒田拓也草川森士中嶋啓行 郷正博金村星余山本貴子鹿村真之西下直希 実験動物中央研究所伊藤守 近畿大学早川堯夫 医薬基盤研究所松山晃文

42 ご清聴ありがとうございました 前臨床試験の科学的な立案と確実な実施が 被験者の健康被害を未然に防ぎ 臨床試験実施のスピードを加速します

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