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かずひろにいだ
5 years ago
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1 上原記念生命科学財団研究報告集, 22(2008) 148. ヒト腎細胞癌においてマイクロ RNA に制御される標的遺伝子と遺伝子ネットワークの検討川上享弘 Key words: 腎細胞癌, 癌抑制遺伝子, マイクロ RNA 滋賀医科大学臨床検査医学講座緒言腎細胞癌は日本国内では年間約 1 万人の発生をみる悪性腫瘍であるが, 手術以外に根治的治療法がなく化学療法や放射線療法が有効でないため転移を伴う症例のほとんどが2 年以内に死亡する. 転移性腎細胞癌の一部にはインターフェロンやインターロイキンを中心とした免疫療法が効を奏することもあるがその奏効率は 15% 程度と満足すべきものではない. このような観点から腎細胞癌に対する新たな治療の必要性が提唱されて 10 年以上たつが, 依然として治療という観点からは大きな伸展はみられていない. こういった状況を踏まえるとき, 腎細胞癌の発癌メカニズムを今一度分子遺伝学的立場から地道に明らかにすることは, 本悪性腫瘍の発生のみならず発癌予防法, 新たな分子マーカーの樹立といった意味で肝要であると考える. 近年, 発癌過程における microrna (mir) の関与が注目されている. mir は 21 ~ 25 塩基程度の小さい non-coding RNA であり, 動植物に広く保存され, 現在 300 以上の mir がクローニングされている. これらの mir は組織特異的発生段階特異的に発現しており細胞の増殖分化アポトーシスなどに重要な役割を果たしていると考えられている. Calin らは, 186 の mir に関してその染色体上の位置を検索し, 多くの mir が癌と関連のある染色体の欠失増幅部位に位置していることから, mir と発癌の関係を示唆している 1). また, mir の特定クラスターの増幅によってリンパ腫が発生すること 2), mir 発現プロファイリングによって正常細胞と癌細胞には mir 発現の差が存在し, messenger RNA (mrna) の発現プロファイリングよりも正確であったことなどが報告され 3),miR が癌発症にいたる新しいプロセスをもたらすことが立証されている. 腎細胞癌において第 14 番染色体長腕の欠失は第 3 番染色体に次いで頻度の高い染色体欠失部位とされる. とくに high stage, high grade 腫瘍と相関関係が認められることから, 同領域に癌の転移浸潤に関わる分子が存在する可能性があると考えられてきた 4-6). われわれは, すでに腎細胞癌において高頻度に染色体欠失 (LOH) が報告されている第 14 番染色体長腕に注目し 14q32 に存在する刷り込み遺伝子である DLK1 がヒト腎細胞癌の癌抑制遺伝子として機能し, DLK1/GTL2 領域の異常メチル化獲得が DLK1 の発現消失に大きくかかわっていることを報告した 7). しかし Calin らは, 14q32 領域に mir クラスターが存在することを明らかにしており 1), 14q32 領域の mir が癌抑制遺伝子である可能性が示唆されている. mir は複数の遺伝子発現を制御しているため, mir の発現制御機構の解明は重要であるが, どのような因子が mir の発現を調節しているかはいまだ明らかになっていない. しかし, mir が組織特異的発生段階特異的に発現していることから mir も通常の RNA と同様に DNA メチル化やヒストン修飾などの epigenetic な制御を受けていることが予想される. Frigola らは大腸癌細胞を用いた実験で 2q14.2 領域全体 (4Mb) が DNA メチル化とヒストン H3 のヒストンテール第 9 番目の Lys 残基 (H3K9) のメチル化によって遺伝子発現抑制状態であることを示した 8). このことは癌細胞において観察される epigeneic gene silencing が遺伝子単位の限局されたものではなく, 染色体レベルで, しかも同時に起こりうる事象であることを示唆している. われわれは, 腎細胞癌において 14q32 に存在する DLK1 遺伝子がその相補的刷り込み遺伝子 GTL2 の 1.8kb 上流に存在する CpG アイランドの異常メチル化によって不活化されていることを示したが, Frigola らの報告とわれわれの実験結果より 14q32 領域全体が DNA メチル化やヒストン修飾によって不活化状態であることが考えられ, mir の不活化に関与している可能性は非常に高いと予想される. そこで本検討では第 14 番染色体長腕 telomere 側にクローニングされた 5 つの mir (mir-433, mir-127, mir-299, mir-134, mir-154) の腎細胞癌発生における役割を明らかにし, さらに腎癌発生にかかわる癌遺伝子的あるいは癌抑制的な未知の mir をクローニングすること, 加えて従来から腎細胞癌の発生に寄与すると考えられている第 3 番染色体短腕 1

2 上の遺伝子 (VHL, RASSF1A) を含め他の腎癌発症に絡む遺伝子群の発現に mir がどのように関わっているかを明らかにしたい. 方法ヒト腎細胞癌株 Caki-1, Caki-2, ACHN, NC65, SW839, VMRC-RCW および HEK293 細胞を用い各々の DNA, RNA を抽出した. mir の発現は TaqMan microrna assay kit (Applied Biosystems) を用いて解析した. 14q32 領域にクローニングされた mir のうち今回検討したのは mir-433, mir-127, mir-299, mir-134, mir-154 で, DLK1 遺伝子からの距離を図 1 に示す. 図 1. 今回の検討対象にした mir と DLK1 遺伝子からの距離. 14q32 領域の DLK1/GTL2 と mir-433, mir-127, mir-299, mir-134, mir-154 の位置関係を示す. また AZA-C, TSA 存在下で Caki-1 細胞を培養し 48 時間後に RNA を抽出, その一部で DLK1, β アクチンを RT-PCR で検討した後に mirvana mirna Array system (Ambion) を用い AZA-C, TSA 存在下で発現誘導される mir の検討を行った. RT-PCR の primer 配列は DLK1-F: GCAGGTGCCAGCCTGGCTGG, DLK1-R: GAGCCGTTGATCACACAGGG, bactin-f: GGACTTCGAGCAAGAGATGG, bactin-r: AGCACTGTGTTGGCGTACAG.Bisulfite genomic sequence に用いた primer 配列は BIS mir127-f: GAGGGTTTTGATTTAGAAAGATTAT, BIS mir127-r: CCCTACTACCTAAAAAACTACTTCC, BIS mir299-f: GTTATATATATATTTAAAATGTATGTGGGA, BIS mir299-r: CAATACCATTCCATAATACTCAATAAC, BIS mir134-f: GTTGGTTGGTTTTGTTTTTTTT, BIS mir134-r: AAACCCTCTAAAAACTCATTTAAAAC.PCR 条件は,10 GeneAmp reaction buffer II,1.5mM MgCl 2, 800mM dntps, AmpliTaq Gold polymerase (Applied Biosystems) を用いた. そして PCR 産物を TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) を用いてサブクローニングし, コロニーを 8 個選択し BigDye Terminator Kit (Applied Biosystems) にて配列を解析した. 結果 1. 腎細胞癌株における mir の発現腎癌細胞株において 83%(5/6) で各 mir 発現は消失していたが, 腎癌で特異的に発現が抑制されている mir は認めなかった. 2

mir も同様に異常な epigenetic 制御を受けていることが予想される. そこで DNA メチル化ヒストンアセチル化を阻害して再発現してくる mir の中に TSG(tumor suppressor gene) としての機能をもつものがあるかもしれないと考え, 腎癌細胞株を AZA-C, TSA 存在下で培養し 14q32 領域の mirna が再発現するか検討を行った.

3 図 2. 腎細胞癌株における各 mir 発現. 14q32 領域の mir を RT-PCR で検討した. RNU6B は内因性コントロール. 腎癌と正常腎組織についても real-time RT-PCR を用いて検討した. しかし, 再現性がなく腎癌組織で発現が低下しているとは言い切れない結果で, mir の発現量の差を real-time RT-PCR で評価することは困難と考えられた ( 図 2). 2. AZA-C, TSA の mir 発現に与える影響多くの悪性腫瘍において癌関連遺伝子が異常な DNA メチル化やヒストンの脱アセチル化により不活化されていることは広く知られている. mir も同様に異常な epigenetic 制御を受けていることが予想される. そこで DNA メチル化ヒストンアセチル化を阻害して再発現してくる mir の中に TSG(tumor suppressor gene) としての機能をもつものがあるかもしれないと考え, 腎癌細胞株を AZA-C, TSA 存在下で培養し 14q32 領域の mirna が再発現するか検討を行った. まず腎癌細胞株で高頻度に DNA メチル化によって発現消失している DLK1 遺伝子が AZA-C, TSA で再発現することを確認たのちに, 各 mir の再発現についての検討を行った. 図 3 上段に示すように AZA-C, TSA により epigenetics で制御されている DLK1 遺伝子は再発現したが, 各 mir の発現は変化を認めなかった ( 図 3 下段 ). 図 3. AZA-C TSA 処理後の DLK1 再発現と mir の発現. Caki-1 細胞を AZA-C, TSA で処理した後に RT-PCR で DLK1 遺伝子の発現と同一 RNA を用いて mir の発現を検討した. 3

3. mir array さらに, 図 3 で DLK1 遺伝子の再発現を来したサンプルのうち AZA-C 75uM 単独処理, TSA 0.3uM 単独処理, AZA-C 75uM と TSA 0.3uM の併用処理した RNA, それとは別に AZA-C 150uM 単独処理, TSA 0.5uM 単独処理, AZA-C 150uM と TSA 0.

4 3. mir array さらに, 図 3 で DLK1 遺伝子の再発現を来したサンプルのうち AZA-C 75uM 単独処理, TSA 0.3uM 単独処理, AZA-C 75uM と TSA 0.3uM の併用処理した RNA, それとは別に AZA-C 150uM 単独処理, TSA 0.5uM 単独処理, AZA-C 150uM と TSA 0.5uM の併用処理した RNA につき mirvana mirna Array system (Ambion) を用い 14q32 領域以外で AZA- C, TSA により発現量が増加する mirna を検討した. しかしながら Caki-1, VMRC-RCW ともに AZA-C, TSA 処理により発現量が 2 倍以上になる mir は認めなかった. 4. DNA メチル化解析 Bisulfite genomic sequence 法および TA cloning 法を用い mir 領域の DNA メチル化解析を行った. mir 配列に CpG island を含む mir-127, mir-299, mir-134 について解析を行ったところ, mir の発現とは関係なくメチル化状態であった. 一方,NC65 では比較的非メチル化 CpG が多く認められた ( 図 4). 図 4. mir 領域の DNA メチル化解析. mir 領域に CpG island が存在する mir-127, mir-299, mir-134 について bisulfite genomic sequence 法を用い DNA メチル化を検討した. ピンク色の四角は mir 配列, 黒丸はメチル化 CpG, 白丸は非メチル化 CpG を指す. 考察 14q32 領域の 5 つの mir の発現が腎癌細胞株で高頻度に消失している (83%) ことは明らかとなったが, 腎癌発生に寄与する mir とその標的遺伝子の同定にまでは至っておらず今後の検討が必要とされる. また, mir 発現を制御する機構についても DNA メチル化だけではなくヒストンのメチル化アセチル化の検討が必要と考えられた. 本研究の共同研究者は滋賀医科大学泌尿器科の岡本圭生, 同臨床検査部の岡部英俊, 茶野徳宏, および南佳ほりである. 文献 1) Calin, G.A., Sevignani, C., Dumitru, C.D., Hyslop, T., Noch, E., Yendamuri, S., Shimizu, M., Rattan, S., Bullrich, F., Negrini, M. & Croce, C.M.: Human microrna genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 101: , ) He, L., Thomson, J.M., Hemann, M.T., Hernando-Monge, E., Mu, D., Goodson, S., Powers, S., Cordon- Cardo, C., Lowe, S.W., Hannon, G.J. & Hammond, S.M.: A microrna polycistron as a potential human oncogene. Nature, 435: , ) Lu, J., Getz, G., Miska, E.A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., Sweet-Cordero, A., Ebert, B.L., Mak, R.H., Ferrando, A.A., Downing, J.R., Jacks, T., Horvitz, H.R. & Golub, T.R.: MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature, 435: , ) Herbers, J., Schullerus, D., Muller, H., Kenck, C., Chudek, J., Weimer, J., Bugert, P. & Kovacs, G.: Significance of chromosome arm 14q loss in nonpapillary renal cell carcinomas. Genes Chromosomes Cancer, 19: 29-35, ) Schullerus, D., Herbers, J., Chudek, J., Kanamaru, H. & Kovacs, G.: Loss of heterozygosity at chromosomes 8p, 9p, and 14q is associated with stage and grade of non-papillary renal cell carcinomas. J. Pathol., 183: ,

5 6) Mitsumori, K., Kittleson, J.M., Itoh, N., Delahunt, B., Heathcott, R.W., Stewart, J.H., McCredie, M.R. & Reeve, A.E.: Chromosome 14q LOH in localized clear cell renal cell carcinoma. J. Pathol., 198: , ) Kawakami, T., Chano, T., Minami, K., Okabe, H., Okada, Y. & Okamoto, K.: Imprinted DLK1 is a putative tumor suppressor gene and inactivated by epimutation at the region upstream of GTL2 in human renal cell carcinoma. Hum. Mol. Genet., 15: , ) Frigola, J., Song, J., Stirzaker, C., Hinshelwood, R.A., Peinado, M.A. & Clark, S.J.: Epigenetic remodeling in colorectal cancer results in coordinate gene suppression across an entire chromosome band. Nat. Genet., 38: ,

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Untitled 上原記念生命科学財団研究報告集, 24(2010) 164. 消化器癌におけるエピジェネティックな microrna 異常の解析鈴木拓 Key words: 胃癌, 大腸癌,microRNA, DNA メチル化, 癌抑制遺伝子札幌医科大学医学部内科学第一講座緒言 microrna( 以下 mirna) は 18 ~ 22 塩基程度の短い non-coding RNA であり, 分化増殖アポトーシスなど細胞内の様々なプロセスに重要な役割を担っている