【記入例】　　　　　マイタケ由来アミノペプチダーゼの精製と性質

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かずひろひのと
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1 秋田応用生命科学研究会第 18 回講演会要旨集平成 23 年 5 月 27 日 ( 金 ) 13:00- 秋田県総合食品研究センター研修室

2 プログラム講演 15(25) 分討論 5 分 13:00-13:05 会長あいさつ秋田応用生命科学研究会会長杉山俊博 ( 秋田大医 ) 座長小林正之 ( 秋田県大生資 ) 13:05-13:25 バキュロウイルス感染 Sf9 昆虫細胞によるヒトインターロイキン -2 の生産進藤祐宜 1 菊地賢一 2 後藤猛 2 ( 1 秋田大工資 2 秋田大院工資 ) 13:25-13:45 アフリカツメガエル卵減数分裂におけるヒストンデアセチラーゼの影響岩下淳小玉歩阿部達也 ( 秋田県大生資 ) 13:45-14:05 フィブリン分解を促進する糸状菌由来マルホルミンの構造活性相関小泉幸央 1 長井賢一郎 2 蓮見惠司 3 小代田宗一 1 1 杉山俊博秋田大院医 2 北里大薬 3 東農工大農応生科 ) ( 1 座長畠恵司 ( 秋田県総食研セ ) 14:05-14:25 マウス ES 細胞における Egam1 ホメオタンパク質群の細胞内分布部位に関する解析佐藤匠伊波百恵森祐貴春日和小嶋郁夫小林正之 ( 秋田県大生資 ) 14:25-14:45 ヒト胚性癌細胞株 NT2 細胞の未分化状態および分化過程における Tetra-peptide repeat homeobox 1 (TPRX1) 遺伝子の発現解析森祐貴伊波百恵佐藤匠春日和小嶋郁夫小林正之 ( 秋田県大生資 ) 14:45-15:00 休憩座長水野幸一 ( 秋田県立大生資 ) 15:00-15:30 ( 特別講演 ) 秋田での研究展開と抱負 " 内分泌細胞の分泌顆粒形成機序 " の解析を中心に穂坂正博 ( 秋田県立大生資 ) 座長小笠原博信 ( 秋田県総食研セ ) 15:30-15:50 異種放線菌を宿主としたカスガマイシンの恒常的生産春日和松尾高志山本知佳湊由衣子桑原直哉飯野訓昌小林正之上松仁 1 池田治生 2 小嶋郁夫 ( 秋田県大 1 秋田高専 2 北里大北里生命研 ) 15:50-16:10 D-アスパラギン酸特異的エンドペプチダーゼ生産菌 Paenibacillus sp. B38 由来セロビオース 2-エピメラーゼのクローニングと大腸菌における発現韮澤悟 1 高橋砂織 2 ( 1 JIRCAS 2 秋田県総食研セ ) 16:10-16:30 次世代シークエンサを利用した大規模塩基配列解析の試み福島淳志村洋一郎原光二郎小西智一鈴木英治岡野桂樹稲元民夫 ( 秋田県立大生資 ) 16:30-16:35 閉会の挨拶事務連絡 ( 次回講演会開催について交流会について他 )

3 バキュロウイルス感染 Sf9 昆虫細胞によるヒトインターロイキン -2 の生産進藤祐宜 1, 菊地賢一 2, 後藤猛 2 ( 1 秋田大工資, 2 秋田大院工資 ) [ 緒言 ] ヒトインターロイキン-2 (hil-2) は T 細胞の増殖促進や NK 細胞の活性化などの生理機能を有するサイトカインであり, 抗腫瘍剤などに用いられている大腸菌による hil-2 の生産が行われているが, その多くは不活性な封入体として生成することが問題である一方, 昆虫細胞 -バキュロウイルス発現系 (BEVS) は動物タンパク質の大量生産方法として利用されているが, 内在性プロテアーゼによる分解が問題となっているそこで本研究では BEVS による hil-2 の生産を試み, プロテアーゼ分解の抑制方法を検討する [ 実験方法 ] hil-2 cdna をトランスフェクションベクター pfastbac1-pgp64 の gp64 プロモーター下流に挿入し, バキュロウイルスゲノムを組み込んだ Bacmid DNA にトランスポゾンを利用してこの遺伝子を導入して組換えバキュロウイルス (AchIL2) を作成した指数増殖期にある Sf9 細胞を無血清培地 Sf-900 Ⅱに懸濁させて細胞密度 cells/ml とし,AchIL2 を感染多重度 (MOI) 0.1 pfu/ml で接種した 1 時間振盪した後, 新鮮培地をさらに加えて cells/ml とし,28 で振盪培養したウイルス接種 3 日目の培地に 4 種類のプロテアーゼ阻害剤カクテル :Cocktail-A (mock),cocktail-b (0.2 mm E-64,2 mm Leupeptin,0.2 mm Pepstatin A),Cocktail-C (20 mm AEBSF,0.02 mm Aprotinin, 0.2 mm Pepstatin A),Cocktail-D (20 mm AEBSF,0.02 mm Aprotinin,0.2 mm E-64,2 mm Leupeptin), または BSA,Triptone をそれぞれ添加した 6 日目まで培養した後, 培養液と細胞画分に分け, それぞれウエスタンブロットにより hil-2 の生成挙動を分析した培養液を PBS で透析した後,Ni アフィニティー樹脂 (Ni-IMAC Profinity) と混合した 5 mm Imidazole を含むリン酸緩衝液 (ph 8.0) で十分洗浄した後,500 mm Imidazole により hil-2 を溶出させた [ 結果と考察 ] BEVS による hil-2 の生産を試みたところ,hIL-2 はウイルス接種 2 日目から発現して細胞外へ漏出蓄積したが, 同時に部分分解も認められ,4 日目には完全に消失したそこで,4 種類のプロテアーゼ阻害剤カクテル (Cocktail-A,B,C,D) をウイルス接種 3 日目に添加したところ, システインプロテアーゼ阻害剤 (E-64,Leupeptin) を含む Cocktail-B,D の添加によってのみ細胞内外の hil-2 の分解が抑制された以上より hil-2 の分解はシステインプロテアーゼに起因することが分かったまた, プロテアーゼ分解の競争阻害を期待してより安価な BSA または Triptone による hil-2 分解抑制ついて検討したその結果,BSA の効果はほとんど見られなかったが,Triptone は濃度依存的に hil-2 のプロテアーゼ分解を抑制し,10%Triptone 存在下で大量の hil-2 が生成されることが分かったさらに, 高濃度の Triptone を含む培養液上清から Ni アフィニティーカラムによる hil-2 の精製を試みたところ, 一段階のクロマトグラフィーにより単一の hil-2 が得られた

4 アフリカツメガエル卵減数分裂におけるヒストンデアセチラーゼの影響岩下淳小玉歩阿部達也 ( 秋田県立大学応用生物科学科分子細胞機能グループ ) 目的動物の減数分裂から初期発生に至る過程では遺伝子の発現が大きく変化する遺伝子の発現の制御にはゲノム DNA に含まれるヒストンタンパク質のアセチル化が大きく関与するトリコスタチン A (TSA) などのヒストンデアセチラーゼ (HDAC) 阻害剤で処理したツメガエル初期胚はヒストンのアセチル化が蓄積するとともに眼形成などに大きな異常が生じることが 20 年以上前から報告されてきたしかし胚発生や卵減数分裂においてヒストンのアセチル化がどのような役割を果たしているのか詳細な研究は為されていない我々は以前ツメガエル未成熟卵の核質を別の未成熟卵に注入すると第一減数分裂の指標となる GVBD(germinal vesicle breakdown) が早く誘起される現象を見出したこの核質には HDAC が局在している従って核に局在する HDAC が卵減数分裂の進行に関与する可能性がある本研究では減数分裂の進行における HDAC の機能を明らかにするために以下の実験を行った方法ツメガエルの卵巣から摘出したステージ6の未成熟卵にTSAなどの HDAC 阻害剤を添加し以下の点について解析を行った 1 TSA によって HDAC 活性を阻害した場合における減数分裂の進行を解析した 2 ツメガエルの未成熟卵から total RNA を抽出し RT-PCR を用いてツメガエル HDAC cdna を合成したその cdna から HDAC mrna を合成した HDAC mrna をツメガエルの未成熟卵に注入し減数分裂進行の指標となる GVBD の時期までの時間に与える影響を観察した 3 HDAC mrna 注入卵になどにおける細胞周期関連分子 cdc2 の挙動の変化を観察した結果と考察 TSA(HDAC 阻害剤 ) で処理した卵は無処理の卵と比較して TSA の濃度依存的に GVBD が遅くなった逆に HDAC mrna を注入した卵では対照群の卵と比較して GVBD が早く誘起された TSA などによりGVBD 誘起までの進行に影響が観察された卵では cdc2 などの活性も連動して変化している現象を観察したこれらの結果から GV に局在する HDAC に減数分裂の速度を上げる活性があることが示唆された

5 フィブリン分解を促進する糸状菌由来マルホルミンの構造活性相関小泉幸央 1 長井賢一郎 2 蓮見惠司 3 小代田宗一 1 1 杉山俊博 ( 1 秋田大院医 2 北里大薬 3 東農工大農応生科 ) 目的近年脳梗塞や心筋梗塞といった血栓性疾患の発症の増加が認められその治療ならびに予防がきわめて重要である現在抗血栓療法に用いられる血栓溶解剤として血栓の主成分であるフィブリン (Fbn) の分解酵素プラスミンの不活性前駆体プラスミノーゲンを活性化するプラスミノーゲンアクチベーター (PA) が臨床利用されているが血中での短い半減期や全身の出血傾向といった副作用の危険性を有した酵素製剤であるこのような問題点の改善を目的とした遺伝子改変型の PA の開発と同様に低分子型血栓溶解剤の開発が求められているこのような背景から血栓溶解を促進する低分子化合物の開発を目的に In vitro 血栓溶解評価系を用いたスクリーニングを行なった約 2,500 種類の微生物培養抽出液を対照としたスクリーニングの結果糸状菌 Aspergillus niger が生産する分子内ジスルフィド結合を有する環状ペンタペプチドマルホルミン A1(MA1) を見出した 1) MA1 は PA の一種であるウロキナーゼ発現細胞を介したプラスミン活性を増加させるが詳細な作用機序は現在のところ不明である今回 MA1 の血栓溶解促進作用の向上と細胞毒性の低下を目指した構造活性相関を展開した方法 In vitro 血栓溶解試験は [ 125 I] 標識 Fbnをコートしたマイクロプレート上で血漿及び単球様 U937 細胞を反応後反応上清に遊離した [ 125 I]Fbn 分解物のγ-カウンターによる定量により評価した細胞毒性はMTT 試験により評価した構造活性相関に用いる天然型 MA1 同族体は東理大の菅原二三男先生から恵与された非天然型 MA1 誘導体は固相合成法により作成した結果 MA1の構成アミノ酸であるD-Leu L-Ileが異なる疎水性アミノ酸に置換された8 種の天然 MA1 同族体はいずれも [ 125 I]Fbn 分解を促進した次に MA1 分子内ジスルフィド結合を還元した結果促進活性は消失した続いて MA1を構成するL-Val D-Leu L-Ile 内の1 残基をLysに置換した3 種のLys 誘導体の活性評価の結果いずれのLys 誘導体にも促進活性を見出せなかったしかし側鎖 ε-アミノ基をtert-ブトキシカルボニル (Boc) 基で保護したLys 誘導体には促進活性が検出された同様に疎水性アミノ酸をPheに置換した3 種類のPhe 誘導体からも促進活性が検出された以上の結果から MA1の活性発現には分子内ジスルフィド結合および疎水性側鎖の存在が重要なことさらに促進活性を示す誘導体の活性濃度領域はいずれも1 5 µmで変動が見られないことがわかったまた細胞毒性は Phe 誘導体 > BocLys 誘導体 > MA1 >> 還元体 > Lys 誘導体の順番となり [ 125 I]Fbn 分解促進活性と細胞毒性には厳密な相関が観察されなかった 1) Y. Koizumi, K. Hasumi, J. Antibiot., 55,78-82 (2002). マルホルミン天然型同族体および非天然型誘導体 L-Ile D-Cys O H S S O N H NH NH O HN D-Cys HN O O D-Leu マルホルミン A1 L-Val aa1 aa2 aa3 aa4 aa5 天然型 MA1 D-Cys D-Cys L-Val D-Leu L-Ile MA2 D-Cys D-Cys L-Val D-Leu L-Val MA3 D-Cys D-Cys L-Val D-Leu L-Leu MA3 (MB1b, MC) D-Cys D-Cys L-Val D-Ile L-Val MB1a D-Cys D-Cys L-Val D-Leu L-alloIle MB2 D-Cys D-Cys L-Val D-Val L-Leu MB3 D-Cys D-Cys L-Val D-Ile L-Leu MB4 D-Cys D-Cys L-Val D-Ile L-Ile MB5 D-Cys D-Cys L-Val D-Val L-Ile 非天然型 3-LysMA1 D-Cys D-Cys L-Lys D-Leu L-Ile 4-LysMA1 D-Cys D-Cys L-Val D-Lys L-Ile 5-LysMA1 D-Cys D-Cys L-Val D-Leu L-Lys 3-BocLysMA1 D-Cys D-Cys L-BocLys D-Leu L-Ile 4-BocLysMA1 D-Cys D-Cys L-Val D-BocLys L-Ile 5-BocLysMA1 D-Cys D-Cys L-Val D-Leu L-BocLys 3-PheMA1 D-Cys D-Cys L-Phe D-Leu L-Ile 4-PheMA1 D-Cys D-Cys L-Val D-Phe L-Ile 5-PheMA1 D-Cys D-Cys L-Val D-Leu L-Phe

6 マウス ES 細胞における Egam1 ホメオタンパク質群の細胞内分布部位に関する解析佐藤匠, 伊波百恵, 森祐貴, 春日和, 小嶋郁夫, 小林正之 ( 秋田県大生物資源 ) 緒言マウスにおける最初の細胞分化は,8 細胞期から桑実期にかけて開始する内部細胞塊と栄養外胚葉への細胞分化である私たちは, その分子機構を解明するため,8 細胞期から桑実期にかけて発現量が増加する遺伝子を探索したその結果,Egam1 ホメオタンパク質群 (Egam1[29kD],Egam1N[14kD] および Egam1C[17kD]) を発見した 1) 初期胚を構成する未分化細胞のモデルとしてマウス ES 細胞を用いた機能解析により,Egam1 ホメオタンパク質群は未分化状態の維持または細胞分化に関与することが示されているよって,Egam1 ホメオタンパク質群は転写調節因子として遺伝子発現の調節に関与すると推定している 1,2) 転写調節因子の核への移行は核膜孔によって制御されており, その機構は次の通りである 1. アミノ酸配列中に NLS( 核移行シグナル ) を含む場合,NLS 結合タンパク質である Importin ファミリーにより核への移行が促進され, 核へ局在する 2.NLS を含まなくても分子量 40kD 以下である場合, 拡散によって核膜孔を自由に通過することにより, 核と細胞質に分布する Egam1 ホメオタンパク質群が転写調節因子として機能するためには, 核へ分布すると予想されるが不明であるそこで本研究では, これらの細胞内分布部位について検討した材料および方法マウス ES 細胞における Egam1 ホメオタンパク質群の細胞内分布部位を検討するために, 免疫染色法を用いたなお, マウス ES 細胞では Egam1 ホメオタンパク質群 (3 種 ) が発現している免疫染色に用いる抗 Egam1N 抗体と抗 Egam1C 抗体は, 構造上の関連性から Egam1 も認識するそこで,Egam1 ホメオタンパク質群を強制発現させることにより, それぞれのタンパク質を優位に検出できるマウス ES 細胞を作製して, 細胞内分布部位の検討に用いた Egam1 ホメオタンパク質群それぞれを強制発現させた ES 細胞における Egam1,Egam1N または Egam1C (FITC), および Oct4 (DyLight594) を二重免疫染色し, 蛍光顕微鏡により細胞内分布部位を観察したなお, Oct4 は ES 細胞で発現しており, 核に局在することが既知である転写調節因子である結果および考察ウェスタンブロット法により,Egam1 ホメオタンパク質群それぞれを強制発現させた ES 細胞におけるタンパク質発現量を検討したその結果, 強制発現させたタンパク質の発現量は明確に増加していることが判明したよって, 免疫染色においても強制発現させたタンパク質が検出されることが示唆された Egam1 ホメオタンパク質群強制発現 ES 細胞において,Egam1,Egam1N,Egam1C は Oct4 と同様に核に局在することが示されたすなわち,Egam1 ホメオタンパク質群は核内において, 転写調節因子として機能すると考えられるまた,Egam1 ホメオタンパク質群のアミノ酸配列中に NLS が存在することが示唆された今後は,Egam1 ホメオタンパク質群が直接的に転写調節を行う標的遺伝子を同定すること, および Egam1 ホメオタンパク質群のアミノ酸配列中に存在すると推定される NLS を同定することを予定している参考文献 1. Saito et al., Cloning of complementary DNAs encoding structurally related homeoproteins from preimplantation mouse embryos: their involvement in the differentiation of embryonic stem cells., Biology of Reproduction, 82: (2010), 2. Saito et al., Relationships between homeoprotein EGAM1C and the expression of the placental prolactin gene family in mouse placentae and trophoblast stem cells., Reproduction, 141: (2011)

7 ヒト胚性癌細胞株 NT2 細胞の未分化状態および分化過程における Tetra-peptide repeat homeobox 1 (TPRX1) 遺伝子の発現解析森祐貴, 伊波百恵, 佐藤匠, 春日和, 小嶋郁夫, 小林正之 ( 秋田県大生物資源 ) 緒言マウスにおける最初の細胞分化は,8 細胞期から桑実期にかけて開始する内部細胞塊と栄養外胚葉への細胞分化であるしかし, その分子機構は充分には解明されていない私たちは, 最初の細胞分化を制御する分子機構を解明することを目的として, 桑実期に発現量が増加する遺伝子の探索を行った結果, ホメオタンパク質 Egam1 を発見した Egam1 は, 初期胚のモデル細胞である ES 細胞の細胞分化に関与することが示されている 1) また, マウス ES 細胞において Egam1 mrna はレチノイン酸添加 (+RA) 分化誘導により発現が誘導される Egam1 遺伝子はマウス第 7 染色体にコードされているまた TPRX1 遺伝子は, ヒト第 19 染色体にコードされている染色体上における Egam1 と TPRX1 の位置関係は一致しているさらに,Egam1 の N 末端側ホメオドメインと TPRX1 のホメオドメインは paired タイプであることから,TPRX1 は Egam1 のヒトオーソログ遺伝子であると推定される TPRX1 は精巣と目で発現していることが既知であるが, 具体的な機能は報告されていないそこで本研究では, 未分化状態維持および分化誘導処理した細胞における TPRX1 の機能を明らかにすることを目的として, 精巣由来であり, また神経系に分化誘導することができる, ヒト胚性癌細胞株 NT2 細胞の未分化状態と分化過程における TPRX1 mrna の発現について検討した材料及び方法未分化状態維持培養および +RA 分化誘導培養 (14 日間 ) したNT2 細胞からRNA を精製し,cDNA を合成した未分化マーカー (NANOG), 原始内胚葉マーカー (GATA6), 神経外胚葉マーカー (MASH1), 栄養外胚葉マーカー (CDX2), およびTPRX1 mrna 発現量をReal-time RT-PCR により定量した結果 1) +RA 分化誘導したNT2 細胞では, 未分化状態維持培養時とは明らかに異なる形態のコロニーが認められた 2) 未分化マーカーである NANOGの発現量は, 未分化状態維持培養時では高く,+RA 分化誘導培養時では有意 (p<0.05) に減少した逆に, 分化マーカーである GATA6,MASH1,CDX2の発現量は,+RA 分化誘導培養開始後, 有意 (p<0.05) に増加した 3) TPRX1 mrna 発現量は, 未分化状態維持および分化誘導培養時において検出限界以下であった考察 NT2 細胞において,TPRX1 は未分化状態の維持および原始内胚葉, 神経外胚葉, 栄養外胚葉への分化との関連性は低いことが示された TPRX1 は精巣と目で発現していることから, 偽遺伝子ではないことが示されているそこで今後は,TPRX1 と Egam1 強制発現ベクターをそれぞれ構築し, ヒト NT2 細胞とマウス ES 細胞にそれぞれ遺伝子導入し, 細胞分化への影響を比較する予定である参考文献 1. Saito et al., Cloning of complementary DNAs encoding structurally related homeoproteins from preimplantation mouse embryos: their involvement in the differentiation of embryonic stem cells. Biology of Reproduction, 82: (2010)

8 秋田での研究展開と抱負 (" 内分泌細胞の分泌顆粒形成機序 " の解析を中心に ) 穂坂正博 ( 秋田県立大学生物資源科学部応用生物科学科分子細胞機能研究グループ ) 内分泌細胞の分泌顆粒形成機序の解明内分泌細胞ではペプチドホルモンは粗面小胞体上で合成された後ゴルジ装置を経てトランスゴルジネットワーク (TGN) から分泌顆粒に選別輸送されて貯留され細胞外刺激により分泌される ( 調節性分泌経路 ) 一方外部刺激による調節を受けない成長因子膜蛋白質アルブミン等の血清タンパク質等の分泌タンパク質は TGNから細胞表面に移行する経路で輸送される ( 構成性分泌経路 ) 内分泌細胞の分泌顆粒にはペプチドホルモングラニンタンパク質群ペプチドホルモンを活性化するプロセシング酵素群が含まれまた顆粒上には分泌制御タンパク質や顆粒内環境を整えるイオンチャンネルとポンプが存在している私はこれまでペプチドホルモンが分泌顆粒へ選別されるメカニズムを解析し分泌顆粒中でクロモグラニン A(CgA) と結合するタンパク質セクレトグラニン III(SgIII) を同定して解析を行い 1)SgIII は CgA と分泌顆粒内の弱酸性高カルシウム環境で強く結合し CgA の調節性経路への選別受容体として機能する (Mol. Biol. Cell 13, , 02) 2)SgIII は高コレステロール組成をもつ分泌顆粒膜と直接結合して顆粒へ選別輸送される (J. Biol. Chem. 279, , 04) 3)SgIII は CgA と 1:1 のストイキオメトリーで結合するのみならず凝集した多量の CgA と結合できる SgIII は CgA とペプチドホルモンの凝集体を分泌顆粒に輸送する (Mol. Endocrinol. 22, , 08) ことを示した本研究会では高コレステロール顆粒膜を基盤としたペプチドホルモン選別輸送メカニズムを中心に我々の最近のデータを交え分泌顆粒形成について概説する低酸素病態イメージングプローブの開発病気の超早期診断治療の実現に向けて病態を非侵襲的に検出しその分布を画像化して生体情報を得る分子イメージング技術の開発が世界的に推進され分子イメージング技術は臨床医療学においても中心的な役割を果たしている近年我々の研究グループはがん動脈硬化脳梗塞心筋梗塞部位といった低酸素病態に焦点を当てその超早期診断に向けて簡便で安価な分子イメージング技術の確立を目指している現在我々は低酸素環境下でのみ発光するイリジウム錯体 (BTP 分子量 712) を生体に投与しその発光を利用して低酸素病態を検出する全く新しいタイプの分子イメージング法を確立しつつある (Cancer Res. 70, , 10) 本研究についても簡単に紹介する参照 :

9 異種放線菌を宿主としたカスガマイシンの恒常的生産春日和松尾高志山本知佳湊由衣子桑原直哉飯野訓昌小林正之上松仁 1 池田治生 2 小嶋郁夫 ( 秋田県大 1 秋田高専 2 北里大北里生命研 ) 背景と目的放線菌 Streptomyces kasugaensis が生産するアミノグリコシド抗生物質カスガマイシン (KSM) はイネのいもち病用農薬として広く用いられている我々は S. kasugaensis A1R6 株より KSM 生合成に関与する約 20kb の kas 遺伝子クラスターをクローン化して遺伝子解析を行ったまた KSM 生合成系の発現には KSM 生合成酵素遺伝子群に先立ち生合成経路特異的転写活性化遺伝子 kast が発現する必要があることを明らかにしたそこで我々は KSM を生産しない放線菌 Streptomyces lividans TK21 を宿主とし kas 遺伝子群とともに kast を過剰発現させることにより異種放線菌での KSM 生産に成功した現在 KasT に依存せずに発現する KSM 生合成遺伝子カセットを構築しこれを異種放線菌および他の細菌に導入することにより KSM 生産を導く研究を行っている方法と結果 (1) 恒常的 KSM 生産を導く遺伝子カセットの構築 : kas 遺伝子群のうち kast の上流に Streptomyces avermitilis 由来の構成的プロモーター (PrpsJ) を連結した KSM 生合成遺伝子カセット I を構築したまた kas 遺伝子群の各転写単位の上流に種々の細菌で機能するプロモーター (Pneo) を連結して再編成した KSM 生合成遺伝子カセット III を構築したさらにこれら 2 つのカセットにイノシトール生合成関連遺伝子 ino1 を挿入した KSM 生合成遺伝子カセット II および IV を構築した以上の 4 カセットを Streptomyces 属放線菌の染色体組込み型ベクター ptym19 に連結して異種放線菌における KSM 生産プラスミドベクター pksm109 pksm125 pksm81 pksm126 を作製した (2) 放線菌における KSM 生産性 : 4 種のプラスミドを S. lividans JT46 に導入し KSM の生産性を調べた KSM 発酵生産実験を行ったところ pksm109 pksm125 を導入した 2 株は S. kasugaensis の KSM 高生産株 R6S1 と同レベルの KSM を安定して生産した一方 pksm81 または pksm126 の導入株では KSM 生産量がクローン間で安定せず特に pksm81 は宿主内で KSM 生産カセット自体が安定に保持されないことがわかったこれは相同組換えにより KSM 生合成遺伝子カセットが分解したためと考えられる (3) 大腸菌における KSM 生産性 : pksm81 では Pneo の下流に各 kas 遺伝子群を連結しているため大腸菌に導入して kas 遺伝子群を発現させられると期待された pksm81 を導入した大腸菌では耐性遺伝子群や ino1 の発現は確認できたがこの形質転換体での KSM の生産は検出されてなかった現在 Rhodococcus 属細菌など Streptomyces 属放線菌に遺伝学的に近縁の細菌を宿主とした KSM 生産系の確立に取り組んでいる

10 D- アスパラギン酸特異的エンドペプチダーゼ生産菌 Paenibacillus sp. B38 由来セロビオース 2- エピメラーゼのクローニングと大腸菌における発現韮澤悟 ( 独法国際農林水産業研究センター ) 高橋砂織 ( 秋田県総合食品研究センター ) 目的次世代シークエンサーにより解析した Paenibacillus sp. B38 1) ゲノム塩基配列からヒトレニン結合タンパク質 (N-アセチルグルコサミン 2-エピメラーゼ ) 2) と相同性のある酵素を in silico スクリーニングしこれをクローニングするとともに大腸菌で発現させ得られた組換え酵素の性質を解析したので報告する方法ゲノム塩基配列酵素アミノ酸配列の相同性検索には BLAST を用いた酵素遺伝子の取得は Paenibacillus sp. B38 より精製したゲノムを鋳型とした PCR 法により行った大腸菌における酵素生産は pet28a を用いた酵素活性は GlcNAc Lactose 及び Cellobiose を基質に用い DIONEX-HPLC で分析した分子会合の解析には Superdex 200 (10/30) カラムを用いた結果と考察 Paenibacillus sp. B38 ゲノム塩基配列よりヒトレニン結合タンパク質 ( GenBank Acc. No. D ) ) とアミノ酸配列の相同性をもつ配列を検索したところ約 20% の相同性をもつ ORF を得たこの ORF より推定されるアミノ酸配列は種々の微生物ゲノムから推定されるアミノ酸配列と約 40-60% の相同性があったつぎに大腸菌により本酵素を生産しその基質特異性を調べたところ lactose 及び cellobiose はエピメリ化したが GlcNAc はエピメリ化しなかったこのことから本酵素はセロビオース 2-エピメラーゼであることが示唆された既知のセロビオース 2-エピメラーゼと 37-44% のアミノ酸配列の相同性があったまたゲルろ過の解析により活性型酵素は SH 基還元状態で二量体を形成しており酸化状態では単量体で不活性であることが明らかになったまた SH 基修飾剤である N-ethylmaleimide 及び iodoacetic acid により活性が阻害されることから遊離 SH 基が活性発現に必須であることが推定された本酵素においてもほ乳類エピメラーゼにおいて活性発現に必須な 380 番目のシステイン残基 4) が保存されておりこのことは酵素の構造機能相関を考察する上で大変興味深い参考文献 1. Takahashi. S. et al., J. Biochem. 139, (2006) 2. Takahashi, S. et al., J. Biochem. 125, (1999) 3. Inoue, H., Takahashi, S. et al., J. Biochem. 110, (1991) 4. Takahashi, S. et al., J. Biochem. 126, (1999)

11 次世代シークエンサを利用した大規模塩基配列解析の試み福島淳志村洋一郎原光二郎小西智一鈴木英治岡野桂樹稲元民夫 ( 秋田県大生資 ) 2007 年に次世代シークエンサ装置が発売されその後生物の遺伝子研究は部分的に大きく様変わりしたと言えるかもしれないこの機械は今までのサンガー法に元づく DNA シークエンサの最低でも数千倍の能力がある現在の最新機種では 1 回の解析で最大 600 G(6 x ) 塩基の配列を解読できるというヒトのゲノムサイズは 3 G 塩基であるのでその 200 倍という膨大な量であるこのような機械は国内でも既にかなりの数が導入され稼働している受託で解析する企業も現れているが秋田県内では今のところ導入されていないと思われる実際の利用目的は今後さらに拡大すると考えられるが現時点では微生物から高等動植物のゲノム解析に用いられていることはもちろん環境微生物の網羅的メタゲノム解析遺伝子発現の網羅的解析遺伝子変異解析等にも応用されている本機器は急速に改良が進んでいる状態で細菌ではまずゲノム配列を解析してから研究が開始するという時代が到来する可能性が高いまた高等真核生物の研究においても近い将来ゲノム配列を決定してから開始するということも十分考えられるこのようにおそらく今後 5 年の間には生物学全体に大きく影響を与える技術となると考えている県立大学ではこの次世代シークエンサ装置の導入を目指しその解析に必要な環境や知識について県立大学内バイオインフォマティクス研究会が中心となって検討しているまた県立大学バイオテクノロジーセンターでの受託可能性についても検討を行う予定である今回は発売されている装置の特性を知るために二つのメーカーの機種を使用して依頼配列解読を行ったここでは途中経過であるがその解析についての一部と問題点などを報告する解析に供したものは細菌のゲノム3 種真菌ゲノム1 種動物の腸内細菌の網羅的解析 2サンプルであるまた真核生物の組織で発現する RNA についても網羅的に解析を行う予定である

12 事務局連絡先 ( 秋田県総合食品研究センター内 ) appl-mic@arif.pref.akita.jp TEL FAX URL 担当小笠原博信樋渡一之高橋砂織

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Untitled 上原記念生命科学財団研究報告集, 25 (2011) 86. 線虫 C. elegans およびマウスをモデル動物とした体細胞レベルで生じる性差の解析井上英樹 Key words: 性差, ストレス応答,DMRT 立命館大学生命科学部生命医科学科緒言性差は雌雄の性に分かれた動物にみられ, 生殖能力の違いだけでなく形態, 行動などそれぞれの性の間でみられる様々な差異と定義される. 性差は, 形態や行動だけでなく疾患の発症リスクの男女差といった生理的なレベルの差異も含まれる.

【記入例】 マイタケ由来アミノペプチダーゼの精製と性質

【記入例】　　　　　マイタケ由来アミノペプチダーゼの精製と性質