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1 学位論文の内容の要旨 論文提出者氏名 上園将慶 論文審査担当者 主査塙隆夫副査春日井昇平 田畑純 論文題目 Hydroxyapatite/collagen nanocomposite-coated titanium rod for achieving rapid osseointegration onto bone surface ( 論文内容の要旨 ) 要旨 インプラントデバイスの開発と進歩を背景に, 矯正歯科治療においてもミニプレートや歯科矯正用アンカースクリュー等の骨に固定源を求めたアンカレッジデバイスが臨床応用されつつある. これらのデバイスは骨内に埋入することによって固定を得るため, 歯根や歯胚を損傷する危険性が問題となっている. 一方, 上記の問題を回避するために骨表面とオッセオインテグレーションする骨膜下デバイスも開発されているが, 骨膜下に設置後, デバイスと骨表面がオッセオインテグレーションするまでに長期間を要するという欠点が挙げられる. そこで本研究では, 迅速に骨表面とオッセオインテグレーションする新規骨膜下デバイスの開発を目的に, コーティングなし (Bare), ハイドロキシアパタイト (HAp) コーティング, ハイドロキシアパタイト / コラーゲンナノ複合体 (HAp/Col) コーティングの3 種類の異なる表面性状を有する円型断面形状のチタンロッド試料を作製し, 雄性 SD 系ラットの頭蓋骨骨膜下にそれぞれ設置して骨表面への迅速なオッセオインテグレーションを実現するための最適条件の検索を行った. 試料埋入後 4 週で組織学的観察, 力学試験,µCT による観察を行った結果,HAp/Col コーティングを行ったチタンロッドでのみ線維組織の介在を伴わない金属と骨表面の直接接合が認められ, 最も高い骨接合強度を示した. 本実験結果より,HAp/Col コーティングされた円型断面形状のチタンロッドは, 迅速に骨表面とオッセオインテグレーションする骨膜下デバイスに適している可能性が示唆された. 緒言 近年, 矯正歯科治療においては, チタン製スクリュー ( 歯科矯正用アンカースクリュー : 以下アンカースクリューと呼ぶ ) を骨内に埋入し, 歯を移動させるためのアンカレッジとして用いる技術が臨床応用されている. この技術により, 従来の方法では治療が困難と考えられていた重度の不正咬合や幅広い年齢層の患者においても, 比較的簡便な手技によって良好な治療結果を得ることが可能となっている. しかし, 本デバイスは常に歯根や歯胚の損傷リスクが存在し, 特に混合歯列期の患者への適応においては慎重な配慮を要する. 一方, より安全なデバイスとしてオンプラントが開発されている. オンプラントは底面がハイ - 1 -

2 ドロキシアパタイト (HAp) でコーティングされた厚さ2.0 mm, 直径 7.0 mmの純チタン製の円盤型デバイスであリ, 骨膜下に設置するとデバイス底面と骨表面がオッセオインテグレーションし維持力が発揮される. オンプラントは骨内への埋入を必要としないため, 従来のデバイスと比較して安全であると考えられる. しかし, 骨内に埋入するアンカースクリューは術後約 1ヶ月から荷重付加が可能となるのに対し, オンプラントではデバイスと骨表面がオッセオインテグレーションするまで約 3-4ヶ月を要するという欠点がある. もしこの待機期間を短縮することができれば, 混合歯列期にも適用することができる安全なデバイスが実現できると考えられる. そこで, 骨表面との迅速なオッセオインテグレーションを実現するために必要なデバイスの表面性状について, 骨補填材として開発されたハイドロキシアパタイト / コラーゲンナノ複合体 (HAp/Col) をコーティングに応用すれば, より迅速なオッセオインテグレーションが実現できるという仮説を設定した.HAp/Colは生体骨と同様にアパタイトナノ結晶がコラーゲン線維にそってナノレベルで配向 結合し, 骨に近いアパタイト / コラーゲン重量比を持った複合体である. オンプラントではオッセオインテグレーションを早めるためにHApがコーティングされているが,HAp/Colには生体骨と同様に吸収, 置換されるというHApにはない特性があることから,HAp/Colでデバイスをコーティングすれば, 早期に貪食細胞が引き寄せられ, デバイス表面への骨形成を誘導する可能性がある. 以上の仮説を検証するために動物実験を行った. 方法 本研究で動物実験を行うにあたり, 申請者は本学生命倫理研究センターが主催する研究倫理講習会を受講し, 同動物実験委員会より実験許可番号を発行された. また動物実験の計画は本学動物実験倫理審査委員会に実験計画書を提出し, 所定の審査を経て承認された. 試料の形状は直径 0.5 mm, 長さ 12 mm, 円型断面の純チタン製ロッドとした. 表面性状はコーティングなし (Bare 群 ), 疑似体液中での析出による HAp コーティング (HAp 群 ) およびコーティング溶液への浸漬による HAp/Col コーティング (HAp/Col 群 ) とし, 各 13 本用意した. ロッドの表面を #800 エメリー紙で処理した後, 中性洗剤アセトンエタノール純水の順に超音波洗浄を各 20 分間行い乾燥し, これをコーティングなし (Bare) とした.HAp コーティングは Li らの報告を参考にした疑似体液浸漬による析出によって行った.HAp/Col コーティングには菊池らの方法を用いて作製した HAp/Col スポンジを用いた. この HAp/Col スポンジ 100mg をホモジナイザーで注射用蒸留水 800µl に分散させコーティング用懸濁液を調製し, 浸漬法によるコーティングを行った. 各 3 本の試料は走査型電子顕微鏡による表面観察を行った. その際,1 本のロッドを 1/3 に分割して撮影し画像解析ソフトウェアを用いて幅の計測を行い, コーティングの厚さを算出した. また, 各 10 本の試料はエチレンオキサイドガスで滅菌した後, 動物実験に用いた. 動物実験には 12 週齢, 雄性の SD 系ラット ( 体重 g) を用いた. ラットの頭部正中に 3 cm 程度の皮膚切開を加え頭蓋骨の皮下組織を露出した. 頭蓋骨左右の骨膜を専用の剥離子でポケット状に剥離し, 骨膜下にロッドを設置した. ロッドを設置する際, 周囲組織との摩擦でコーティングが剥離するのを防ぐため,19G 留置針の外筒をアプリケーターとして用いた. ロッドは左右が同じ群にならないように設置した. 初期固定としてロッドを骨膜下に設置後, ロッド両端を

3 ナイロン糸で皮下組織と縫合し, 単縫合で皮膚を閉創した. 術後 4 週にて採材し, 組織学的観察, 組織形態計測, 力学試験,µCT による力学試験前後の観察によって評価を行った. 組織形態計測では, 得られた組織像から新生骨高さ (New Bone Height; NBH) とロッドと骨の接触率 (Bone Contact Ratio; BCR) を算出した.NBH は頭蓋骨基底部と平行なロッド下部に設定した接線と左右の新生骨の上端に設定した接線の間の距離を計測し, 左右の平均値を求めた.BCR はロッドが骨と接触している部位の長さをロッド全周の長さで除して求めた. 組織形態計測と力学試験の結果は Holm 法によって有意水準を調整した Wilcoxon の多重比較検定による統計学的解析を行った. 結果 SEM によるロッド表面の観察結果では,Bare 群ではエメリー紙によって粗造になった表面が認められた.HAp 群ではロッド表面を覆う直径約 20 µm の HAp 粒子と多くの亀裂を認めた.HAp/Col 群では HAp に由来すると思われる直径約 10 µm の粒子とその間に Col に由来すると思われる膜状の構造をもつ密度の低い被膜を認めた. さらに強拡大では, 粒子構造にナノサイズの小孔が認められた. また,SEM 像で計測を行った結果,HAp コーティング,HAp/Col コーティングのコーティング層の厚さはそれぞれ約 20 µm であった. 実験期間中に死亡したラットはなく, 採材時に明らかな試料の偏位や脱離, 血腫などの異常所見は認められなかった. 組織学所見ではすべての群でロッド辺縁部に新生骨を認めた.Bare 群ではすべての検体でロッド全周が線維組織に被覆されるカプセル化が認められた.HAp 群では Bare 群と同様のカプセル化が認められたが線維組織の厚さは Bare 群より薄かった. またロッド表面の一部に新生骨の付着や HAp コーティングの残遺を認めた.HAp/Col 群では試料がカプセル化されることなく, 骨と直接接合している所見が得られた.HAp/Col コーティングの残遺は骨とロッドの間では認められず, ロッド上面のみで認められた. 組織形態計測に関して,NBH では Bare 群と HAp 群,Bare 群と HAp/Col 群で有意差を認めた (p<0.05). また BCR では,Bare 群と HAp/Col 群,HAp 群と HAp/Col 群で有意差を認めた (p<0.05). せん断力による力学試験の結果では, 各群間で有意差を認めた (p<0.05). また力学試験後における µct による観察結果では,HAp 群,HAp/Col 群で牽引方向の新生骨で骨折所見が認められた. HAp/Col 群では HAp 群より大きい骨折片が観察された. 考察 本実験では円型断面形状のチタンロッドを試料として用いた. これは円盤型であるオンプラントを骨膜下に設置した場合, 新生骨形成はデバイス辺縁部から底面の順に起こるため, デバイスの断面形状を側面が広い円型にすれば, 早期に形成される辺縁の新生骨でデバイスが維持される可能性があると考えたためである. 円型断面形状のチタンロッドを骨膜下に設置した結果, 表面性状に関わらず術後 4 週間で辺縁部に新生骨の形成が認められた. さらにBare 群,HAp 群ではロッドがカプセル化されていたが,HAp/Col 群ではロッドはカプセル化されず, 新生骨と直接接合していたことから, 円型断面形状の採用とHAp/Colコーティングの組み合わせによって, 術後 4 週間で - 3 -

4 ロッドが骨表面に強い維持力で固定できることが明らかとなった. この時, 骨と直接接合しているロッドの側面及び下部ではコーティングしたHAp/Colが残存しておらず, 線維組織と接している上部ではHAp/Colが残存したことから, コーティング材の吸収過程がロッド周囲の新生骨形成や線維組織形成に影響を及ぼす可能性が示唆されたが詳細に関しては更なる検討を要すると考えられた. Bare 群および HAp 群で観察されたカプセル化の原因に関しては, オンプラントでもカプセル化に関する報告がされており, その原因は不十分な初期固定であると考えられている. オンプラントは骨膜弁の張力によって初期固定を行っているが, 本実験では骨膜弁の張力に加え, 試料を骨膜に縫合して初期固定を行い, 採材時の所見ではすべての検体で試料の大きな偏位や初期固定を行った縫合糸の脱落を認めなかったことから, 本実験では初期固定は十分でありカプセル化の原因にはなり得ないと考えられる. カプセル化が惹起された原因を追求するため, 骨膜剥離直後の骨膜を組織学的に観察したところ, 骨膜の骨形成細胞の減少を認めた. 今後, 剥離方法を改良し骨形成細胞をより温存することができれば, さらに迅速な新生骨の誘導とカプセル化の抑制を図ることが可能と考えられた. 一般的にデバイスの開発では, デバイスにとって不利な条件を想定し評価を行うべきである. 本研究において 骨膜下デバイスにおいて骨膜の骨形成細胞が減少しているにも関わらず HAp/Col コーティングによってチタン試料と骨の直接接合が認められたことは, 今後臨床応用可能なデバイスを開発するにあたり重要な所見であると考えられた. 力学試験後の µct 観察では, 頭蓋骨に半円状の陥凹部が認められ, 特に HAp/Col 群ではロッド上面を覆う新生骨が骨折片として観察されたことから, ロッドを被覆する新生骨量を増加させることが骨接合強度の増加に重要であると考えられた. 結論 円型断面形状の純チタン製ロッドに HAp/Col コーティングを行うことによって, 術後 4 週間という短期間でロッドと骨表面の直接接合が確認された. これは,HAp/Col の高い生体活性によるものと考えられるが, 詳細に関しては更なる検討を要する. また,HAp/Col コーティングによってロッド周囲の新生骨高さとロッドと骨の接触率が増加し,HAp/Col コーティングロッドが最も強い接合強度を有していたことから,HAp/Col コーティングされた円型断面形状のチタンロッドは迅速に骨表面とオッセオインテグレーションする骨膜下デバイスに適している可能性が示唆された

5 論文審査の要旨および担当者 報告番号甲第 4608 号上園将慶 論文審査担当者 主査塙隆夫副査春日井昇平 田畑純 論文題目 Hydroxyapatite/collagen nanocomposite-coated titanium rod for achieving rapid osseointegration onto bone surface ( 論文審査の要旨 ) 要旨 インプラントデバイスの開発と進歩を背景に, 矯正歯科治療においてもミニプレートや歯科矯正用アンカースクリュー等の骨に固定源を求めたアンカレッジデバイスが臨床応用されつつある. これらのデバイスは骨内に埋入することによって固定を得るため, 歯根や歯胚を損傷する危険性が問題となっている. 一方, 上記の問題を回避するために骨表面とオッセオインテグレーションする骨膜下デバイスも開発されているが, 骨膜下に設置後, デバイスと骨表面がオッセオインテグレーションするまでに長期間を要するという欠点が挙げられる. そこで本研究では, 迅速に骨表面とオッセオインテグレーションする新規骨膜下デバイスの開発を目的に, コーティングなし (Bare), ハイドロキシアパタイト (HAp) コーティング, ハイドロキシアパタイト / コラーゲンナノ複合体 (HAp/Col) コーティングの3 種類の異なる表面性状を有する円型断面形状のチタンロッド試料を作製し, 雄性 SD 系ラットの頭蓋骨骨膜下にそれぞれ設置して骨表面への迅速なオッセオインテグレーションを実現するための最適条件の検索を行った. 試料埋入後 4 週で組織学的観察, 力学試験,µCT による観察を行った結果,HAp/Col コーティングを行ったチタンロッドでのみ線維組織の介在を伴わない金属と骨表面の直接接合が認められ, 最も高い骨接合強度を示した. 本実験結果より,HAp/Col コーティングされた円型断面形状のチタンロッドは, 迅速に骨表面とオッセオインテグレーションする骨膜下デバイスに適している可能性が示唆された. 本論文で得られた結果は以下の通りである 1. ラット頭蓋骨の骨膜下に試料を設置後 4 週間の組織学的観察では,Bare 群ではすべての検体でロッド全周が線維組織に被覆されるカプセル化が認められた.HAp 群では Bare 群と同様のカプセル化が認められたが線維組織の厚さは Bare 群より薄かった. またロッド表面の一部に新生骨の付着や HAp コーティングの残遺を認めた.HAp/Col 群では試料がカプセル化されることなく, 骨と直接接合している所見が得られた. HAp/Col コーティングの残遺は骨とロッドの間では認められず, ロッド上面のみで認められた. 2. ロッド周囲の新生骨高さおよびロッドと骨の接合率について組織形態計測を行ったところ, ロッド周囲の新生骨高さでは Bare 群と HAp 群,Bare 群と HAp/Col 群で有意差 ( 1 )

6 を認めた (p<0.05). またロッドと骨の接合率では,Bare 群と HAp/Col 群,HAp 群と HAp/Col 群で有意差を認めた (p<0.05). 3. せん断力試験によってロッドと骨の接合強度を計測した結果では, 各群間で有意差を認めた (p<0.05). また力学試験後における µct による観察結果では,HAp 群,HAp/Col 群で牽引方向の新生骨で骨折所見が認められた.HAp/Col 群では HAp 群より大きい骨折片が観察された. 以上の結果から上園将慶は本研究において, 円型断面形状の純チタン製ロッドに HAp/Col コーティングを行うことによって, 術後 4 週間という短期間でロッドと骨表面が直接接合することを明らかにした. また,HAp/Col コーティングによってロッド周囲の新生骨高さとロッドと骨の接触率が増加し,HAp/Col コーティングロッドが最も強い接合強度を有していたことから,HAp/Col コーティングされた円型断面形状のチタンロッドは迅速に骨表面とオッセオインテグレーションする骨膜下デバイスに適していることを明らかにした. この成果によって, 骨に支持を求める新しい骨膜下デバイスが実現すれば, より安全性, 有効性の高い歯科矯正治療を実現することが出来るだけでなく, 欠損歯補綴やセンサーの固定等に応用できる可能性を秘めており, 重要な学術的基盤となりうると判断された. よって本論文は博士 ( 歯学 ) の学位を請求するに十分価値あるものと認められた. ( 2 )

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