旗影会2011年度(巻頭)版面修正8/9.indd

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あおいりゅうとう
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1 食品加工器具表面での病原菌残存性に対するタマゴ残渣の影響東京海洋大学海洋科学部食品生産科学科准教授久田孝緒言サルモネラ Saˡmoneˡˡa enterica subsp. enterica serovar Enteritidis および Typhimurium は食中毒の原因菌としてよく知られている 1) これまでタマゴによるサルモネラ症の多くの原因菌として S. Enteritidis が報告されてきたが近年では他の食品と同様に S. Typhimurium による食中毒も増加している 2) また黄色ブドウ球菌 Stapʰyˡococcus aureus を原因とするタマゴおよびタマゴ加工品による食中毒も散発している 3) (Loir et al., 2003) 食品工場のパイプ内や医療機器のチューブ内の wet な環境で発生するバイオフィルムは様々な物理的化学的ストレスに対して耐性を持つことが知られており 4) 院内感染の原因となることも考えられるため S. Typhimurium S. aureus を含め様々な病原菌に関する多くの報告がある 5, 6) 一方食品残渣とともに器具表面に付着乾燥した菌体もバイオフィルムと同様に様々なストレスに耐性を持つと考えられるそのため食品成分の消毒殺菌剤や抗菌剤の効果に対する影響について詳細なデータが蓄積されているもののこれらは試験管内における結果が多く 7) 器具表面の dry な環境とは異なるものと考えられるわれわれは以前ステンレス表面に付着乾燥した病原菌に対する陽イオン系界面活性剤の塩化ベンザルコニウム (BAC) の殺菌作用が牛乳残渣の存在によって顕著に阻害されることを報告した 8) しかしながら器具表面に付着している状態や殺菌効果への影響の詳細なメカニズムなどの検討はまだ少ない本研究においてはタマゴ残渣の殺菌効果に及ぼす影響と殺菌前の洗浄の重要性について検討するためにタマゴ残渣 ( 卵白卵黄全卵 ) の器具表面に付着乾燥した S. Typhimurium および S. aureus の生残性に対する影響および界面活性剤 (BAC) アルキルジアミノエチルグリシン塩酸塩 (AGH) の殺菌効果に及ぼす影響を残存生菌数位相差顕微鏡および原子間力顕微鏡 (AFM) を用いて調べた方法器具表面付着乾燥に対するタマゴ残渣の影響本研究では病原菌としてグラム陰性桿菌の S. Typhimurium NBRC およびグラム陽性球菌の S. aureus NBRC をトリプチケースソイブロス (TSB) で 37 20h 前培養後生理食塩水 (PBS) で洗浄した菌体を以下の実験に供した 50mmφ sus304 ステンレスシャーレ 47mmφ ガラスシャーレおよび 50mmφ ポリスチレンシャーレに 0.1ml の S. Typhimurium 懸濁液 (10 7 cfu/ 水 25% 卵白 25% 卵黄あるいは 50% 全卵 ) を置き安全キャビネット内で送風しながら 3h 付着乾燥させたその後 TSB 5ml をシャーレに加え細胞用セルスクレーパーを用いて 60s こすり浮遊させすみやかに段階希釈しトリプチケースソイ寒天培地 (TSA) に塗沫培養し生残菌数を計数した界面活性剤の殺菌効果に及ぼすタマゴ成分の影響タマゴ残渣とともに付着乾燥した S. Typhimurium および S. aureus に対する界面活性剤の殺菌効果はガラスシャーレを用いて検討した菌体の付着乾燥した部分 ( 約 10mmφ) を 2.0mg/ml の BAC あるいは AGH (0.1ml) で覆い 10min 放置後上記と同様に生残菌数を測定した顕微鏡観察ガラスに付着乾燥した菌体およびタマゴ残渣の表面の状態を光学顕微鏡 ( ) で観察した菌体タマゴ残渣の懸濁液に対する界面活性剤の影響は位相差顕微鏡で観察したまたカバーガラス表面に乾燥付着した菌体への界面活性剤の影響を原子間力顕微鏡 (AFM, Shimadzu SPM 1000 コンタクトモード ) を用いて観察した洗浄効果上記と同様に付着乾燥した菌体タマゴ残渣を通常の水洗いおよび中性洗剤 ( アルキルエチル硫酸エステル AES) 処理を行った後の生残菌数を測定した 43

2 結果器具表面上で 3h 付着乾燥させた S. Typhimurium の生残菌数は Fig. 1A のとおりステンレスの場合 1/10 5 ガラスの場合 1/10 3 まで減少したがタマゴ残渣と同時に乾燥した場合菌数の大きな減少は認められなかったポリスチレン上では 3h でも乾燥しきれずに菌数の減少も認められなかった以後の実験ではステンレス表面と同様に乾燥時に菌数減少が認められ顕微鏡観察の行いやすいガラス表面を用いた低倍率の光学顕微鏡で観察した場合卵白では透明シート状で卵黄はざらついた状態が観察された (Fig. 2) 高倍率での観察で卵白では菌体が認められたが卵黄全卵では菌体は確認できなかった各界面活性剤は菌懸濁水および菌体のみで乾燥した場合には顕著な殺菌効果が示されたが (Fig. 1B) 卵白の存在で AGH 卵黄の存在で BAC の効果も失われた各殺菌剤を菌懸濁液に加え位相差顕微鏡で観察した結果 (Fig. 3) 界面活性剤とくに AGH により菌体およびタマゴ成分が凝集された凝集作用は S. aureusu において顕著であった AFM を用いた観察ではタマゴ成分があった場合菌体は成分中に潜っており観察できなかったが (Fig. 4) 卵白が AGH および BAC により全卵が BAC により影響されることが観察された一方卵黄では界面活性剤による変化は認められなかった AGH による S. aureus の凝集は AFM 観察でも認められた付着乾燥した菌体タマゴ成分を通常の洗浄のとおりに (Fig. 5A) 水および中性洗剤を用いて洗浄した後の生残菌数について調べた結果 (Fig. 5B) 水洗いのみで 1/10 3 まで減少した卵黄の存在で中性洗剤処理後も生残菌が検出されたがその後の各界面活性剤処理により検出限界未満 (< 2.0 log cfu) になった考察上述したように食品残渣は殺菌消毒剤の効果を阻害する近年バイオフィルムが注目されているが食品加工調理現場および家庭内キッチンにおいても機器器具表面に食品残渣とともに菌体が付着乾燥することは日常的に起こりえる現象と思われる本研究においてはタマゴとくに卵黄が菌体を物理的化学的ストレスから保護することが示された卵黄は脂質だけではなくタンパク質にも富むことが 9) 牛乳と同様 8) にその菌体保護作用と関連するものと考えられる表面上の付着菌体がそのまま次の加工過程に持ち込まれると二次汚染を引き起こすだけではなくバイオフィルムの基礎になり大きな問題ともなりえるよく知られているように一度バイオフィルムが形成されてしまうとその除去は非常に困難なものとなる 10) 現在われわれはひきつづき紫外線殺菌に対するタマゴ残渣の影響を検討しているが本研究でも示されたように様々な殺菌法を用いる以前に通常の適正な洗浄が食品安全に重要であると考えられる要約器具表面に付着乾燥した菌体への殺菌消毒剤の効果に対する食品残渣の影響と洗浄の重要性を検討確認するためにガラス表面にタマゴ残渣とともに付着乾燥させた S. Typhimurium および S. aureus に対する界面活性剤 ( 塩化ベンザルコニウムおよびアルキルジアミノエチルグリシン塩酸塩 ) の殺菌効果を調べたタマゴ残渣とくに卵黄によって菌体は乾燥および殺菌剤から保護された位相差顕微鏡および AFM 観察より菌体保護作用は凝集および共凝集作用と関連する可能性が示唆されたこれらの菌体保護作用により器具表面で生残する菌体も通常の適正な洗浄作業をすることで除去された様々な殺菌法を用いる以前に通常の適正な洗浄が食品安全に重要であることが再確認された文献 1.Rivoal, K., Protais, J., Quéguiner, S., Boscher, E., Chidaine, B., Rose, V., Gautier, N., Ermel, G., Salvat, G. (2009)Use of pulsed field gel electrophoresis to characterize the heterogeneity and clonality of Saˡmoneˡˡa serotype Enteritidis, Typhimurium and infantis isolates obtained from whole liquid eggs. ɪnt. J. Food Microbioˡ., 129, Weill, F.X. and Grimont, P. (2005)Les salmonelloses en France: données du Centre National de Référence. Surveillance nationale des maladies infectieuses, Loir, Y.V., Baron, F. and Gautier, M. (2003)Stapʰyˡococcus aureus and food poisoning. ɢen. Moˡ. ʀes., 2, Kubota, H., Senda, S., Tokuda, H., Uchiyama, H. and Nomura, N. (2009)Stress resistance of biofilm 44

3 and planktonic ʟactobaciˡˡus pˡantarum subsp. pˡantarum JCM Food Microbioˡ., 26, Kwon, A.S., Park, G.C., Ryu, S.Y., Lim, D.H., Lim, D.Y., Park, Y. and Lim, Y. (2008)Higher biofilm formation in multidrug resistant clinical isolates of Stapʰyˡococcus aureus. ɪnt. J. Antimicrob. Aɡents, 32, Zaklkhany, K., Harrington, C.R., Nimtz, M., Hinton, J.C.D. and Römling, U. (2010)Unphosphorylated CsgD controls biofilm formation in Saˡmoneˡˡa enterica serovar Typhimurium. Moˡ. Microbioˡ., 77, Simões, M., Simões, L.C. and Vieirab, M.J. (2010)A review of current and emergent biofilm control strategies. ʟWT Food Sci. Tecʰnoˡ., 43, Kuda, T., Yano, T. and Kuda, M.T. (2008)Resistances to benzalkonium chloride of bacteria dried with food elements on stainless steel surface. ʟWT Food Sci. Tecʰnoˡ., 41, 五訂増補日本食品標準成分表. 文部科学省, 10.Stewart, P.S. (2002)Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms. ɪnt. J. Med. Microbioˡ., 292, Fig. 1. Survival cell numbers before and after 3 h drying with distilled water (D.W.), 25% w/v albumen (Alb), 25% w/v yolk or 50% w/v whole egg. A: Cell viability of Salmonella Typhimurium on stainless steel, glass and polystyrene-culture dishes. B: Effect of egg compounds on the disinfectant activity against S.Typhimurium and Staphylococcus aureus. Bacterial cells were treated with either alkyldiaminoethylglycine hydrochloride (AGH: semi-closed column)or benzalkonium chloride (BAC: closed column)at 0.2% (w/v)for 10 min before and after the drying. Values are expressed as mean and SD (n = 3). a -d Different letters indicate significant differences (p < 0.05)between groups. 45

4 Fig. 2. Light microscopy images of adhered S Typhimurium and egg compounds on glass dishes. Cells 7 log cfu in either 0.1 ml of distilled water, 25% w/v albumen, 25% w/v yolk or 50% w/v whole egg were put on the dishes and dried in a biological safety cabinet. Arrows indicate cracks. Fig. 3. Images of the effect of disinfectants on S Typhimurium and S.aureus cell suspensions in the presence and absence of egg compounds. Bacterial cell suspensions were treated with either AGH or BAC at 0.2% w/v concentration for 10 min with water, 25% w/v albumen, 25% w/v yolk or 50% w/v whole egg W. Phasecontrast microscope was used. 46

Fig. 4. Atomic force microscopy images of the effect of disinfectants on S Typhimurium and S.aureus cells and egg compounds dried on glass. ST, S Typhimurium; SA, S.aureus. Contact mode by Shimadzu SPM-1000.

5 Fig. 4. Atomic force microscopy images of the effect of disinfectants on S Typhimurium and S.aureus cells and egg compounds dried on glass. ST, S Typhimurium; SA, S.aureus. Contact mode by Shimadzu SPM Fig. 5. Effect of washing process on disinfectant efficiency. A: Washing and disinfectant treatment method. AES, alkyl ether sulfuric acid ester sodium. B: Survival cells on the dishes before open coloumn and after rubbing with water striped column, rinsing with water semi-closed column or AES closed column and the disinfectant treatment with AGH or BAC. These treatments were carried out on cells before and after 3 h drying with distilled water, 25% w/v albumen, 25% w/v yolk or 50% w/v whole egg. Values are expressed as mean. After the disinfectant treatment, viable cells were not detected ND < 2.0. and SD n = 3 47

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320 Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi Vol. /., No.1, -,* -,/ (,**1) 8 * ** *** * ** *** E#ect of Superheated Steam Treatment on the Preservation and Sensory Characteristics of Buckwheat Noodles Kazuhiro