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よいかずはやしもと
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1 チトクロム酸化酵素の配位子結合構造に基づく反応機構兵庫県立大学大学院生命理学研究科村本和優チトクロム酸化酵素 (Cc) は原核生物から真核生物まで普遍的に保持され呼吸鎖電子伝達系の末端酵素 ( 複合体 IV) として細胞におけるエネルギー生産機能を担っている呼吸鎖電子伝達系は真核生物ではミトコンドリア内膜中に存在し複合体 I, II, III, IV と呼ばれる 4 つの膜タンパク質超分子複合体によって構成される ( 図 1) 電子はミトコンドリアマトリックスのクエン酸回路で生成された AD またはコハク酸の酸化によって供与され電子伝達系の酸化還元中心の還元電位の勾配に従って AD 複合体 I III IV またはコハク酸複合体 II III IV の順に最終の電子受容体である酸素 ( ) まで伝達される電子伝達に伴い放出されるエネルギーは膜を介したプロトンの電気化学ポテンシャルエネルギーに変換されこのエネルギーは複合体 V による ATP 合成膜タンパク質による物質輸送細胞運動など様々な生命活動に利用される Cc はの還元反応を触媒するとともにそれと共役したプロトン能動輸送を行うことによってプロトンの電気化学ポテンシャル差を形成している Cc における還元反応とプロトン電気化学ポテンシャル差形成のエネルギー変換効率は 70% に達すると推定され高効率なエネルギー変換機構の物理化学的解明は長年にわたって生体エネルギー学分野における中心的な研究課題である複合体 I 複合体 III 複合体 IV チトクロム bc 1 チトクロム酸化酵素 (4) 4 (2) チトクロム c 2e - 2e - 複合体 V ATP 合成酵素膜間腔 2e - 2e - ½ UQ UQ 2 マトリックス 2 AD AD ADP + Pi ATP (3) ミトコンドリア図 1 ミトコンドリア呼吸鎖の模式図電子伝達経路は青プロトン移動方向は赤で表している複合体 I と III 間の電子伝達は膜内在性の低分子化合物ユビキノン (UQ) が複合体 III と IV 間の電子伝達は膜表在性のタンパク質チトクロム c が担っている

我々の研究グループではウシ心筋ミトコンドリアの Cc を研究対象に用いて X 線結晶構造解析を主な方法として反応機構の解明を目指している図 2A は X 線構造解析によって決定されたウシ Cc のペプチド α 炭素骨格構造である (1, 2) ウシ Cc は 13 種類の異なるサブユニット ( ポリペプチド ) で構成されるそれらが集合して機能単位である分子量約 210 kda 28

(Fe a ) は軸配位子として 61 と 378 が結合した 6 配位構造をとっている eme a 3 の鉄原子 ( ) には 376 が配位しから 5 Å 程度離れたところにある Cu には 90, 91, 240 が配位している eme a 3 の第 6 配位座と Cu の第 4 配位座は外部配位子を結合する性質を持ちの還元反応の触媒部位として機能する

2 我々の研究グループではウシ心筋ミトコンドリアの Cc を研究対象に用いて X 線結晶構造解析を主な方法として反応機構の解明を目指している図 2A は X 線構造解析によって決定されたウシ Cc のペプチド α 炭素骨格構造である (1, 2) ウシ Cc は 13 種類の異なるサブユニット ( ポリペプチド ) で構成されるそれらが集合して機能単位である分子量約 210 kda 28 本の膜貫通 α ヘリックスを持つ超分子複合体を形成しそれがさらに 2 量体を形成しているサブユニット I, II, III は機能上必須の膜貫通ドメインで構造的な保存性も高いサブユニット I は補因子としてヘム分子 (heme a と heme a 3 ) と銅原子 (Cu ) を結合し ( 図 2) サブユニット II は銅原子 (Cu A ) を結合している eme a の鉄原子 (Fe a ) は軸配位子として 61 と 378 が結合した 6 配位構造をとっている eme a 3 の鉄原子 ( ) には 376 が配位しから 5 Å 程度離れたところにある Cu には 90, 91, 240 が配位している eme a 3 の第 6 配位座と Cu の第 4 配位座は外部配位子を結合する性質を持ちの還元反応の触媒部位として機能するを還元するための電子は還元型チトクロム c から Cu A heme a, heme a 3, Cu の順に伝達される eme a 3 -Cu サイトが還元されるとの結合が可能になり heme a 3 -Cu サイトからへ電子が移動することにより - 結合の解裂が起こる生成した酸素種はプロトンと反応することにより最終的に 2 分子の水 () となるをに還元する反応には 4 電子と 4 プロトンが必要である膜間腔 A heme a heme a ミトコンドリア内膜 Cu 240 マトリックス + 4e 図 2 (A) ウシ心筋チトクロム酸化酵素 2 量体の全体構造サブユニット I は黄色サブユニット II は水色で表しているサブユニット I 内部にあるヘム分子は赤で表している () 還元部位付近の構造 eme a と heme a 3 は赤 Cu は水色で表しているアミノ酸の炭素原子は黄色窒素原子は水色酸素原子は赤で表している

3 Cc におけるの 4 電子還元反応では中間生成物としてスーパーオキシドやペルオキシドといった反応性が高く細胞に危害を与える酸素種を遊離させることなく反応を進行させなければならないこれまでの分光学的研究から Cc の還元反応サイクルにおける中間体が同定されている ( 図 3) 還元型(R) の heme a 3 -Cu サイトは外部配位子を結合しておらずは 2 価 5 配位 Cu は 1 価 3 配位の状態にあるが Fe a3 に結合すると酸素化型 ( A ) が生成する酸素化型の次に観測される中間体は P 型と呼ばれ P 型ではの - 結合は既に切れた状態にあることが時間分解共鳴ラマン分光法により示されている (3) つまりが結合した後の 4 電子還元反応は一気に進行する 4 つの電子のうち 3 つはと Cu から供与され 4 つ目の電子は heme a 3 または 240 側鎖と共有結合した 244 側鎖から供与されると考えられる P 型が 1 電子還元されると F 型更に 1 電子還元されると酸化型 () になる酸化型が 1 電子還元されると E 型更に 1 電子還元されると還元型に戻る 2 分子のを生成するために必要な 4 つのプロトンは反応過程の各ステップにおいて heme a 3 -Cu サイトに取り込まれると考えられるまた生成したは酸化型から還元型への還元過程で Cc から放出されると考えられるの生成とは別に能動輸送されるプロトンは P 型から還元型への反応過程の各ステップにおいて電子移動と共役して Cc から放出されると考えられるこれらの反応中間体以外に単離精製された後の酵素は休止酸化型 ( R ) と呼ばれる状態で存在することが知られている Cu I Fe III Cu I e - E R Fe II 4e - A Fe II Cu I e - R Cu II () Fe III e - F Cu II () P e - Cu II () Fe V Fe IV 図 3 Cc の反応サイクルモデル eme a 3 -Cu サイトへの電子の移動を緑色プロトンの移動を茶色で表しているプロトン能動輸送 ( プロトンポンプ ) を赤で表している各反応中間体において存在が推測される Cu 配位子の酸素種を括弧で表している休止酸化型 ( R ) は Cc が過剰のに長時間曝されることで生成する

4 Cc の反応機構を解明するためには各反応中間体構造や反応過程における構造変化の詳細な情報が必要である我々はこれまでの研究において Cc 結晶の反応中間体を作製し加えて heme a 3 -Cu サイトに結合する呼吸阻害剤をプローブとして用い X 線構造解析により還元反応とプロトンポンプ機構に関与する構造情報を得てきた (4, 5) 以下に heme a 3 -Cu サイトの配位子結合構造に基づいて得られた還元反応機構に関する知見を紹介する休止酸化型構造 ( 図 4A) Cc を単離精製し X 線構造解析を行った結果 Fe 3+ a3 と Cu の間を架橋する peroxide の電子密度が観測された酸化型の 1 電子還元によってプロトンポンプが誘起されるのに対し休止酸化型では 1 電子還元と共役したプロトンポンプ機能が認められないよって heme a 3 -Cu サイトへの peroxide の結合はプロトンポンプ機能を阻害することが示唆される (6, 7) 還元型構造 ( 図 4) 休止酸化型 Cc 結晶に還元剤を作用させると Fe a3, Cu 1+ の還元型が生成するは 5 配位構造でポルフィリン面から 0.3 Å 程度 376 側へ出た位置にある Cu は 3 配位構造で配位子である側鎖の 3 つの窒素が作る平面内に位置している (6, 8) Cu 1+ C 結合構造 ( 図 4C) 還元型 Cc と一酸化炭素 (C) を反応させると C はに結合する Fe a3 C 結合型 Cc に低温状態で光を照射すると C がから解離して Cu 1+ C 結合構造をとることが分かった C は Cu に対して side-on 型の結合をしておりこの構造はが還元型に結合する過程で一時的に Cu に結合する状態に対応すると考えられる Cu は還元型の構造と比べて C 寄りに位置する A C D E Cu - - Cu 1+ Cu 1+ C Cu 1+ Cu 1+ C - 3+ 図 4 eme a 3 -Cu サイトの配位子結合構造 (A) 休止酸化型 () 還元型 (C)C 結合還元型 ( 光解離後 ) (D) 結合還元型 (E)C 結合還元型いずれの構造も温度 100 K での X 線構造解析により決定した

5 Fe a3 結合構造 ( 図 4D) 還元型 Cc と亜硝酸イオン ( 2 ) を反応させるとにが結合する解析の結果はに対し bent end-on 型の結合をしており - 軸は Cu の第 4 配位座の方向を向いていることが分かったこの構造は Fe a3 のモデルと考えられるが結合したはポルフィリン面内に位置する Cu は配位子が作る面近くに位置することからと Cu との相互作用は弱いと考えられる Fe a3 中間体の Fe 伸縮振動の共鳴ラマンスペクトルがヘモグロビンやミオグロビンのそれらと酷似していることからと Cu との相互作用は弱いと推定されていた (3) この X 線構造解析結果は共鳴ラマン分光解析結果を導く構造要因を示すものと考えられる Fe a3 C 1+ Cu 結合構造 ( 図 4E) 陰イオンである C は一般に酸化型の heme(fe 3+ ) に強く結合するが Cc においては C は還元型の heme a 3 -Cu サイトにも結合する解析の結果 C が Fe a3 に配位すると heme a 3 のポルフィリン面が僅かにスライドし 244 と C を水素結合で架橋する位置に水分子が取り込まれることが分かったこの結果は Fe a3 に結合した (Fe Fe 3+ 2 ) も同様に水分子を取り込むことを示唆しているこの水分子が配置されることはに結合しているへの 4 電子還元の引き金になると考えられる以上の知見をもとに我々は次の還元機構を提唱している ( 図 5) は還元型 heme a 3 -Cu サイトの Cu 1+ に一時的に結合した後に bent end-on 型の配位をする Cu との相互作用は弱く (Fe a3 Fe 3+ a3 2 ) 構造は安定化されると 244 の間にが取り込まれて水素結合が形成されるとそれが引き金となっての 4 電子還元が起きる 244 はと呼ばれるプロトン輸送経路の末端に位置しておりの還元に伴いプロトンがから heme a 3 -Cu サイトに取り込まれて P 型中間体が形成される Cu 1+ Cu 1+ Cu 1+ Cu - 5+ R state + A state Transition state P state 図 5 還元反応過程 ( 還元型から P 型中間体まで ) のスキーム

6 謝辞本研究は兵庫県立大学大学院生命理学研究科の吉川信也教授の研究室において伊藤新澤恭子助教前田友子研究員小倉尚志教授 ( 兵庫県立大学 ) 月原冨武教授( 兵庫県立大学 ) 山下栄樹助教( 大阪大学 ) 青山浩准教授( 大阪大学 ) らとの共同研究で行われたものですこの場をお借りして深く感謝いたします文献 1. Tsukihara T, Aoyama, Yamashita E, Tomizaki T, Yamaguchi, Shinzawa-Itoh K, akashima R, Yaono R, Yoshikawa S. (1995) Structures of metal sites of oxidized bovine heart cytochrome c oxidase at 2.8 A. Science 269, Tsukihara, T., Aoyama,., Yamashita, E., Tomizaki, T., Yamaguchi,., Shinzawa-Itoh, K., akashima, R., Yaono, R. and Yoshikawa, S. (1996) The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2.8 A. Science 272, Kitagawa T., gura T. (1997) xygen activation mechanism at the binuclear site of heme-copper oxidase superfamily as revealed by time-resolved resonance Raman spectroscopy. Prog. Inorg. Chem. 45, Yoshikawa S, Muramoto K, Shinzawa-Itoh K, Aoyama, Tsukihara T, gura T, Shimokata K, Katayama Y, Shimada. (2006) Reaction mechanism of bovine heart cytochrome c oxidase. iochim iophys Acta. 1757, Yoshikawa S, Muramoto K, Shinzawa-Itoh K, Aoyama, Tsukihara T, Shimokata K, Katayama Y, Shimada. (2006) Proton pumping mechanism of bovine heart cytochrome c oxidase. iochim iophys Acta. 1757, Yoshikawa S, Shinzawa-Itoh K, akashima R, Yaono R, Yamashita E, Inoue, Yao M, Fei MJ, Libeu CP, Mizushima T, Yamaguchi, Tomizaki T, Tsukihara T. (1998) Redox-coupled crystal structural changes in bovine heart cytochrome c oxidase. Science 280, Aoyama, Muramoto K, Shinzawa-Itoh K, irata K, Yamashita E, Tsukihara T, gura T, Yoshikawa S. (2009) A peroxide bridge between Fe and Cu ions in the reduction site of fully oxidized cytochrome c oxidase could suppress the proton pump. Proc. atl. Acad. Sci. USA (in press) 8. Tsukihara T, Shimokata K, Katayama Y, Shimada, Muramoto K, Aoyama, Mochizuki M, Shinzawa-Itoh K, Yamashita E, Yao M, Ishimura Y, Yoshikawa S. (2003) The low-spin heme of cytochrome c oxidase as the driving element of the proton-pumping process. Proc. atl. Acad. Sci. USA 100,

実験解析方法実験は全て BL41XU で行った初めに波長 0.5A 1.0A の条件化で適切な露光時間をそれぞれ決定した ( 表 1) 続いて同一の結晶を用いてそれぞれの波長を用いてデータを収集しそのデータの統計値を比較した ( 表 2) データの解析は HKL2000/Scalepack と

実験解析方法実験は全て BL41XU で行った初めに波長 0.5A 1.0A の条件化で適切な露光時間をそれぞれ決定した ( 表 1) 続いて同一の結晶を用いてそれぞれの波長を用いてデータを収集しそのデータの統計値を比較した ( 表 2) データの解析は HKL2000/Scalepack と課題名生体超分子チトクロム酸化酵素の高分解能 X 線構造解析課題番号 2006B1683 利用ビームライン BL41XU 大阪大学蛋白質研究所所属博士後期過程 2 年菅倫寛目的および背景生物は好気的条件下では呼吸によってエネルギーを得ているミトコンドリア内では ATP の合成が 40% 以上という極めて高いエネルギー変換効率で行われているチトクロム酸化酵素はミトコンドリア内の呼吸鎖末端に位置する巨大膜蛋白質で