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1 山形大学医学部 1 年次講義 ゲノム解析学 資料 遺伝子実験施設 中島修

2 遺伝子発現解析の実験方法 ハイブリダイゼーション特定の塩基配列の検出

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4 核酸ハイブリダイゼーション 1 本鎖の核酸同士が 2 本鎖を形成する現象を利用 ハイブリダイズするには互いの塩基配列が, かなりの程度, 相補的である必要がある 標識核酸プローブを用いて, 非標的核酸分子混合物の中から, 類似配列をもつ DNA や RNA 分子 ( 配列類似性が十分高い分子 ) を検出

5 未知または混合物 既知 均一 ヘテロ二本鎖

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7 核酸ハイブリダイゼーションの原理 一本鎖の核酸, すなわち, プローブと標的 DNA を混合して, 行う プローブは, 一般的に 1 種類の既知の核酸分子からなる均一の集団で, クローニングされた DNA や化学合成されたオリゴヌクレオチドの場合が多い 標的 DNA は, ゲノムの制限酵素消化物や細胞から抽出された RNA などの雑多な核酸分子群 プローブや標的 DNA が二本鎖である場合は, 一本鎖とするために, 熱やアルカリで変性させる プローブや標的 DNA の再相補対形成が起こるが, 同時に, プローブ DNA 鎖とそれに相補的な標的 DNA 鎖対形成して, ヘテロ二本鎖を形成する これにより, 既知プローブを用いて, 複雑な標的 DNA 中から, プローブ DNA と配列が類似した DNA 断片を同定できる 図 6-8

8 融解温度とハイブリダイゼーションの厳密性 相補的な 2 本の DNA 鎖を分離するのに必要なエネルギーは 鎖の長さ, 塩基組成, 化学的条件 に依存 鎖の長さ : 標識反応によって DNA プローブの長さが短くなることが多いが, 標識前の長さが 500bp 以上ならばこの影響は無視できる 塩基組成 : プローブの GC 対の割合が高いと二本鎖は分離しにくい 化学的条件 : 一価の陽イオンの存在下では, 二本鎖の安定性が増す ホルムアミドや尿素など化学的に水素結合を壊す変性剤は, 二本鎖を不安定化する 融解温度 (Tm): 二本鎖から一本鎖へ遷移が観察される中間点での温度 核酸塩基由来の 260nm の紫外線吸収を測定することで, 遷移を観察可能 二本鎖 DNA はヌクレオチド単独に比べ, 紫外吸収が少ない ( 淡色効果 )

9 融解温度とハイブリダイゼーションの厳密性 哺乳類のゲノムは, 塩基組成が 40%GC で, 生理的条件付近では 87 の Tm で変性する ハイブリダイゼーションの条件は, ヘテロ二本鎖が形成されやすい条件とするため,Tm より 25 低い温度に設定する 過剰プローブを洗浄する際は, 相同性の高い配列間で形成された二本鎖以外を破壊するため, より厳しい条件で行う DNA プローブの場合,1% ミスマッチで Tm は約 1 低下する ただし, 塩基の相補的な領域が 100bp 以上ならば, かなりの程度ミスマッチが許容される 図 6-10 多重遺伝子や反復配列ファミリー遺伝子を同定する場合は,NaCl 濃度を上げたり, 温度を下げたりすることで, ハイブリダイゼーションの厳密性 (hybridization stringency) を低下させる 図 6-10 ハイブリダイゼーションの厳密性を上昇 ( 低 NaCl 濃度または高温 ) させると, ミスマッチのあるヘテロ二本鎖の解離を促進することが出来, オリゴヌクレオチドプローブを用いる場合では,1 つのミスマッチを区別することも可能

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13 核酸プローブの調製 一本鎖あるいは二本鎖で調製し, 使用時には一本鎖にして使用 従来型二本鎖 DNA プローブは, 細胞又は PCR を用いたクローニングにより単離後,in vitrodna 合成反応過程で標識 dntp を取り込ませ標識する 図 6-2 RNA プローブはプラスミドベクターにクローニングした DNA を鋳型として, ファージプロモーター ファージ RNA ポリメラーゼを用いて, 標識 rntp を取り込ませ合成する 図 6-3 オリゴヌクレオチドプローブは, 化学合成された, 短い一本鎖 DNA 断片で, 既知の標的 DNA 中の特異的塩基配列に基づいて設計する 縮重配列をもつプライマーを作製する場合がある 5 末端に標識することが多い

14 ニックトランスレーション ( 図 6-2(A)): 膵臓デオキシリボヌクレアーゼ (DNaseI) などのエンドヌクレアーゼにより, 一方の鎖に切れ目 ( ニック ) を入れ, 大腸菌 DNA ポリメラーゼにより, ニックを起点として, 合成と分解を 5 3 方向へ同時に行うことで, 標識ヌクレオチドを取り込ませながら, 一方の鎖を入れ替えていく

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16 ランダムプライマー ( 図 6-2(B)): 変性して一本鎖にした鋳型 DNA へ, ランダムヘキサマーをハイブリダイゼーションさせ,DNA ポリメラーゼ I のクレノウフラグメント ( エキソヌクレアーゼ活性を欠くが, ポリメラーゼ活性はある ) により, 標識ヌクレオチドを取り込ませながら, 新たな DNA 合成を行う 高比活性の標識 DNA が合成可能 鋳型 DNA 全長にわたって均一に標識可能

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18 一本鎖オリゴヌクレオチドの末端標識 ( 図 6-4(A)): γ- リン酸位に 32 P をもつ ATP 存在下で, ポリヌクレオチドキナーゼを用いて一本鎖 DNA の 5 末端のリン酸基を交換する 二本鎖 DNA でも適用可

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20 RNA 標識 ( 図 7-6): マルチクローニングサイトに隣接したファージプロモーター配列を利用して, 挿入 DNA の in vitro 転写して,RNA プローブを調製 ( ランオフ転写 ) ファージ RNA ポリメラーゼ SP7/T3/T7 のプロモーターとポリメラーゼが利用可能 組織 in situ ハイブリダイゼーションのために広く用いられる

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22 同位体を使った核酸標識法 放射性標識プローブは, 放射性同位体 ( 32 P, 33 P, 35 S, 3 H) をもつヌクレオチドを含み, 溶液中や固体標本中でも検出が可能 32 P は, サザンブロットハイブリダイゼーション, ドットブロットハイブリダイゼーション, コロニー又はプラークハイブリダイゼーションに利用 32 P は高エネルギーの β 粒子を放射し感度がいいが, 高い解像度が求められる画像解析には不利であり, 半減期 (14.3 日 ) が比較的短い DNA 鎖合成に基づく標識では放射性同位体が α- リン酸部位にある 32 P 標識ヌクレオチドを, キナーゼによる末端標識では,[γ- 32 P]ATP を用いる 3 H 標識ヌクレオチドは染色体

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24 non-ri 標識法 直接非放射性標識 : 特定の波長の光を当てて蛍光を発する蛍光色素 ( フルオレセイン, ローダミンなど ) を含んだ修飾ヌクレオチドを用いる 間接非放射性標識 : 修飾されたレポーター分子がヌクレオチド前駆体にスペーサーを介して化学的に結合している DNA に取り込まれたレポーター分子は親和性の高いタンパク質やリガンドと特異的に結合し, 検出される 実際は, 親和性分子に, 蛍光色素やアルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼがカップルされている

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30 様々な核酸ハイブリダイゼーション反応 (BOX 6.4) プローブと標的 DNA の違いは, 標識の有無ではなく, 標的 DNA は, たくさんの異なる配列を含んだ未知のサンプルであり, プローブの解析対象を指す 標的核酸 プローブ サザンハイブリダイゼーション DNA 制限酵素消化物 DNA ノーザンハイブリダイゼーション total RNA, mrna DNA in situ ハイブリダイゼーション 組織切片中のRNA RNA

31 ドットブロットハイブリダイゼーション

32 平面ゲル

33 サザンブロットハイブリダイゼーション 06_12.jpg

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35 ノーザンブロットハイブリダイゼーション : 標的核酸を DNA の代わりに RNA を用いる, サザンブロットハイブリダイゼーションの変法 DNA プローブを用いる 特定の遺伝子発現パターンの情報を得る 図 6-13

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37 in situ ハイブリダイゼーション 染色体 in situ ハイブリダイゼーション ( 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション,FISH): ある DNA 配列や遺伝子が染色体上のどこに位置するかを決定する方法 最近はゲノム配列情報が十分利用可能なため,FISH をしなくても, 染色体情報が得られることが多い 組織 in situ ハイブリダイゼーション : 組織切片中の RNA に対して, 標識した一本鎖の相補的 RNA プローブ ( アンチセンスリボプローブ ) をハイブリダイゼーションさせる プローブ標識には, 35 S のような放射性同位体を用いて, オートラジオグラフィを用いてシグナルを検出する方法と, 蛍光標識などの非放射性標識を用いて, 蛍光顕微鏡で検出する方法とがある

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39 格子状に高密度で並べた DNA クローンに対する核酸ハイブリダイゼーション ( 図 6-17) 専用ロボットの開発で, 高密度フィルターの作製が容易 効率的なライブラリースクリーニング (YAC クローンなど ) が実現

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41 DNA マイクロアレイ DNA クローンの微小スポットを並べるマイクロアレイ : 予め準備した DNA クローンを顕微鏡用スライド硝子の表面に刻みつける オリゴヌクレオチドを in situ で合成するマイクロアレイ (Affymetrix 社 ): 個体支持体に整列固定された未標識 DNA をプローブとし, 標的 DNA を標識して, ハイブリダイゼーション溶液とする

42 マイクロアレイ

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45 遺伝子発現解析

46 遺伝子発現とは一般的に遺伝子から転写される mrna が合成されることまたは その mrna から翻訳されるタンパク質が合成されることを指す最終的な発現はタンパク質レベルである ただし RNA 遺伝子は RNA レベルまで すなわち 遺伝子発現レベルとは一般的に mrna レベルとタンパク質レベルがあり 遺伝子発現はそれぞれのレベルで調節を受ける必ずしも mrna 発現量がタンパク質発現量に 直接, 反映するとは限らない しかし 反映することも多いのも確か

47 なぜ 遺伝子発現解析をするか? 一部例外はあるが 体細胞は全く同じ遺伝子のセットを持っていることから細胞ごとに認められる解剖学上 生理学上 細胞挙動上の差異は遺伝子発現パターンの違いに起因していると考えられるから

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49 遺伝子発現解析のための研究材料 ( 試料 ) RNA/cDNA やタンパク質の粗精製物 (total extract) 組織片や全胚 組織培養された生体細胞 (in vivo での細胞特性の差に注意 ) 蛍光タグ ( 蛍光タンパク ) レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により切り出された組織等からの均一な細胞集団または単一細胞 遺伝子発現の分解能 RNA またはタンパク質抽出物における総発現量の解析 ( 低分解能 ) 発現組織の分布 発現物の大きさ アイソフォームの有無 細胞内での局在や組織特異的発現パターンの解析 ( 高分解能 )

50 レーザーキャプチャーマイクロダイセクション

51 ハイブリダイゼーションによる遺伝子発現解析 ノーザンブロットハイブリダイゼーション 組織 in situ ハイブリダイゼーション :RNA の空間的発現パターンの解析 組織切片 5μm ホールマウント in situ ハイブリダイゼーション : 全胚が対象 プローブの浸透性 単一細胞での RNA プロセシング 輸送 細胞質への局在を解析可能 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISH) は定量的 ガラス表面上にオリゴヌクレオチドや cdna クローンを高密度に固定したマイクロアレイにより high throughput な解析が可能

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53 PCR を用いた遺伝子発現解析 RT-PCR( 低分解能 ):total RNA または mrna を鋳型として逆転写酵素 (Reverse Transcriptase) を用いて cdna を調製し この First Strand DNA( 一本鎖 DNA) を鋳型として PCR( 特定の mrna に含まれる配列を増幅するプライマーを用いる ) を行う もともとの鋳型となった RNA に含まれる標的 mrna 量を反映して PCR 産物が合成される ノーザンブロットに比べて RNA が少量ですむ プライマーセットが認識している部位しか見ていないことに注意

54 Real-time PCR (qpcr, Q-PCR) リアルタイム PCR は, 遺伝子発現の定量し, アレイ技術により検出された遺伝子発現差異の確認に用いられる また, 臨床サンプルにおける特定 DNA 配列のコピー数の解析や突然変異や SNP(single nucleotide polymorphisms) のスクリーニングにも利用される リアルタイム PCR では, 蛍光検出可能なサーマルサイクラーにより, 特定の核酸を増幅すると同時にその濃度を測定する そのため, 反応途中で反応液の一部を取り分ける必要はない 一般的には, リアルタイム PCR における産物の定量には, 二本鎖 DNA に結合した結合した場合のみで蛍光を発する, SYBR Green のようなインターカレートする蛍光色素を用いるか,TaqMan probe のようなラベル化されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて, 標的 DNA とハイブリしたプローブが増幅過程で分解されることで初めて蛍光を発する性質を利用する リアルタイム PCR において高感度を達成するには単一の増幅産物を得る必要がある 融解温度 :PCR 反応の最後に増幅産物 DNA の融解温度 (Tm) を測定することで, 増幅産物が均質であり, 特異的産物かどうかを判定できる プライマーダイマーがコンタミすると,Tm が低下するので, 簡単に区別できる プライマーを設計する場合は, 増幅物が bp になるようにし,Tm は とする また, アニーリング温度で 2 次構造を取らないことを確認する

55 TaqMan probe

56 cdnaライブラリー 遺伝子発現は細胞種や発生段階等で異なるため, 目的に応じた組織からmRNAを調製してcDNAライブラリーを調製する必要がある 一般に, オリゴdTカラムなどを用いて mrnaを精製して, ライブラリー作製に用いる 様々なcDNAライブラリーのmRNA 配列を網羅的に解析してデータベース化しているESTデータベースが利用できる 配列解析に用いられたESTクローンも入手可能である 56

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58 タンパク質発現の解析 特異的抗体を用いる 抗体の標識 直接検出法 : 精製抗体にレポーター分子 (FITC などの蛍光プローブ ビオチン ) 直接結合させる 間接検出法 : レポーター分子が結合している二次試薬を一次抗体 ( 標的タンパク質と結合する ) へ結合させる 二次試薬には 抗一次抗体 (Ig 分子の Fc) として作製した二次抗体を用いることが多い 二次試薬に結合させるレポーター分子としては 蛍光色素 horse raddish peroxidase(hrp) alkaline phosphatase(ap) など 二次抗体は簡単に入手でき 適応範囲が広い

59 免疫ブロット法 ( ウェスタンブロット ): 粗抽出物を SDS-PAGE により分子サイズで画分したゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜へ転写固定して 特異的抗体をハイブリさせて検出 免疫細胞化学 ( 免疫組織化学 免疫染色 ): タンパク質レベルの組織内での発現パターンの解析凍結またはワックス法米した組織切片に特異的抗体を作用させる免疫蛍光顕微鏡法 : 蛍光色素標識した抗体を利用蛍光タンパク質も利用できる超微細構造を解析する場合は電子顕微鏡を利用 金コロイドで標識した抗体を用いる

60 ウェスタンブロット 07_17.jpg

61 07_18.jpg 免疫組織化学 免疫染色

62 抗体の作製 従来法 (polyclonal 抗体 抗血清 ): マウス ラット ウサギ ヤギに免疫原 (immunogen) を繰り返し注射して作製 アミノ酸長の合成ペプチド : 比較的簡単だが 確実に出来るとは限らない融合タンパク質 : 発現ベクターを用いて作製 抗体を得られる可能性は高いモノクローナル抗体を作る場合は B リンパ球由来の単一クローン細胞を分離し 不死化させる必要がある ( 細胞融合によるハイブリドーマの作製 ) エピトープタギング : 人工的に連結させたエピトープに既存の抗体で検出 FLAG ヒト c-myc HA( インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニン ) His タグ (6 10 残基のヒスチジンを含む短いペプチド )

63 自己蛍光タンパク質タグの利用 オワンクラゲ由来の GFP(238AA) は蛍光顕微鏡や共焦点蛍光顕微鏡により簡便に検出可能 動物細胞における遺伝子発現検出に広く利用 GFP との融合タンパク質の利用 ( タグ ) して細胞内局在を解析

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65 DNA マイクロアレイを用いた比較発現解析

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70 データベースを利用した 遺伝子構造解析 遺伝子発現解析

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77 遺伝子発現調節

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85 エンハンサーまたはサイレンサー 転写開始部位から離れた位置 ( 遠位 ) にタンパク質 ( 転写因子 ) が特異的な結合をすることで 転写が影響をうける DNA 配列 すなわち シス因子 活性化する場合をエンハンサー抑制する場合をサイレンサー

86 Human insulin gene promoter

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88 エンハンサーと遺伝子との分断による遺伝子機能異常 無虹彩 転座位置 多指変異 赤長方形は DNase 高感受性部位 ヒト軸前性多指症 この付近に SHH のエンハンサーがあるらしい

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92 Reporter assay

93 Dnase I footprinting

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95 Electrophoretic mobility shift assay

96 Transactivation assay

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101 Model of the enhancesome

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103 Yeast two-hybrid system

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112 1000 種類以上のタンパク質をコードしている可能性

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117 ヒストン修飾

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121 DNA メチル化は遺伝子発現制御に重要な役割

122 DNA メチル化とヒストン脱アセチル化の相互作用

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