Welcome to the Office 2010 PowerPoint template

Transcription

1 Dharmacon 製品検索 WEB 注文マニュアル 製品検索 WEB 注文の流れ STEP 1: 製品検索 注文ページへのアクセスからユーザー認証まで ホームページ (dharmacon.horizondiscovery.com) へアクセス (2 ページ ) ユーザー認証 (2-3 ページ ) アドレスおよびパスワードを入力 STEP 2: 製品の検索 選択からカートへの移動まで 製品を検索 選択しカートへ移動 (4-46 ページ ) STEP 3: カートページから注文完了まで カートページで注文を確定 (47-48 ページ ) 注文製品ならびに Terms and conditions を確認して注文を確定 注文完了 (48 ページ ) 2018 年 10 月 1 日 ver 1

2 STEP1: 製品検索 注文ページへのアクセスからユーザー認証まで 1-1) ホームページ (dharmacon. horizondiscovery.com) にアクセスしてください ページ上部の ログイン ( 赤実線枠 ) をクリックし ログインページに進んでください 1-2) ご登録のメールアドレスとパスワードを入力し ログインボタン ( 青点線枠 ) をクリックしてユーザー認証してください 注 1) ユーザー認証後に右上に日の丸マーク ( 赤実線枠 ) が出ていることを確認してください 注 2) パスワードを忘れた場合には パスワードをお忘れですか を押して新しいパスワードを発行してください 新しいパスワードはご登録のメールアドレスに届きます 2

3 1-3) ログインすると ログイン の表示が 登録メールアドレス ( 赤実線枠 ) になり ユーザー登録情報のページが表示されます プロファイル ( 青点線枠 ) をクリックするとユーザー登録情報が表示されます ichiro.suzuki@horizon.com Horizon 大学医学部 Suzuki Ichiro 様 ichiro.suzuki@horizon.com ichiro.suzuki@horizon.com XXX-XXXX-XXXX 3

4 STEP2: 製品の検索 選択からカートへの移動まで お求めの製品により 以下のページをご覧ください <RNA 干渉 > A. デザイン済みsiRNA 5-7 ページ B. カスタムsiRNA 8-9 ページ C. デザイン済みshRNA 発現ベクター 10 ページ D. デザイン済みmicroRNA 研究用試薬 11 ページ E. RNAi コントロール試薬 ページ F. トランスフェクション試薬 ページ G. ウイルスパッケージング試薬 15 ページ H. その他の試薬 (5 x sirna Buffer 等 ) 15 ページ < ゲノム編集 (CRISPR-Cas9)> Edit-R CRISPR-Cas9 ゲノム編集アプリケーション概要 ページ I. デザイン済みcrRNA/sgRNA ページ J. Cas9 ヌクレアーゼ ページ K. dcas9-vpr ページ L. 遺伝子ノックアウト用のカスタムガイドRNA ページ M. DNA 配列挿入 欠失 置換用のカスタムガイドRNA&ssDNAドナー ページ N. 蛍光レポーター遺伝子 / カスタム配列導入用のカスタムガイドRNA&PCRプライマー ページ < 遺伝子過剰発現 > O. cdna/orfクローン 41 ページ P. 酵母クローン ( ノックアウト株等 ) 42 ページ < カスタム Cherry-pick ライブラリー > Q. sirna/microrna/crrna カスタムライブラリー ページ 4

5 A. デザイン済み sirna 2-A-1) ヒト マウス ラット用 (Lincodeはヒト マウスのみ) のデザイン済みsiRNA(siGENOME ON-TARGETplus Accell Lincode) をご注文いただくには ページ上部にあるウィンドウ ( 赤実線枠 ) に 以下の項目のいずれか一つを入力し 検索ボタン ( ) をクリックしてください Ref Seq Accession ( 例 :NM_ NR_002802) Gene ID ( 例 : ) Gene Symbol ( 例 :MAPK12 NEAT1) Catalog No. ( 例 :L R ) 下の画面は MAPK12 と入力して検索した結果が表示された状態です 製品ならびに関連する学術情報が 遺伝子 のフィールドに表示されます sirna のリンク ( 青点線枠 ) から各製品リストのページに移動してください デザイン済み sirna 製品ラインアップあらかじめ配列がデザインされた sirna は sigenome ON-TARGETplus Accell Lincode の 4 種類の製品タイプがあります いずれの製品も NCBI RefSeq データベースに登録されているヒト マウス ラットの遺伝子をほぼ完全に網羅しています (Lincode はヒト マウスのみ ) sigenome sirna: スタンダードな sirna です ON-TARGETplus sirna: センス鎖 アンチセンス鎖の両鎖に対して化学修飾 (ON-TARGETplus 修飾 ) を行うことにより オフターゲット効果をさらに低減し ターゲット遺伝子のノックダウン特異性をより高めた sirna です Accell sirna: 独自の化学修飾により トランスフェクション試薬を使わずに細胞へ導入できる sirna です リポフェクション法では sirna 導入が難しい細胞や トランスフェクション試薬への感受性が高い細胞における sirna 実験に適しています Lincode sirna: 長鎖 Non-coding RNA のノックダウン用の sirna です ON-TARGETplus 修飾により sirna の特異性を高めると同時にオフターゲット効果を低減します 5

6 2-A-2) 下の画面はヒト MAPK12 遺伝子に対する sirna を検索した結果が表示された状態です +( 赤実線枠 ) をクリックすると 詳細な製品リストが表示されます (sirna 製品ラインアップについては 5 ページを 製品フォーマットについては 7 ページをご参照ください ) 2-A-3) タブ ( 赤実線枠 ) をクリックすることで 各容量を選択できます 希望の容量を選択後 ショッピングカートに入れる ボタン ( 青点線枠 ) をクリックすると製品がショッピングカートに入ります 6

7 2-A-4) ショッピングカートに製品が入ると ショッピングカート内のカッコ内の数字が変わります 数字はアイテム数を示しています ショッピングカートの上をマウスオーバーすると ショッピングカートの中味 ( 赤実線枠 ) が表示されます また ショッピングカートに入れる ボタンが 追加する ( 青点線枠 ) に変わります デザイン済み sirna 製品フォーマット SMARTpool 1 つの遺伝子に対して配列デザインの異なる 4 種類の sirna を Pool ( 混合物 ) として 1 本のチューブに入れた製品です 個々の sirna が変異遺伝子や未知 SNP 部分をターゲットとした場合には 他の sirna がそれを補うため 1 アッセイで確実なノックダウンを実現できます また Pool することにより sirna あたりの実濃度を低くできるため オフターゲット効果の低減にも効果的です Set of 4 Set of 4 upgrade Individual 1 つの遺伝子に対して配列デザインの異なる 4 種類の sirna をそれぞれ個別のチューブに入れ チューブ 4 本で 1 セットとした製品です 同一のターゲット遺伝子に対する SMARTpool を購入した方のために 価格を抑えたアップグレード用製品です 内容は Set of 4 と同じです ( 以前に SMARTpool 製品をご購入のお客様に限り 同一遺伝子の Set of 4 upgrade 製品を購入できます 同一遺伝子の SMARTpool 製品を以前にご購入でない場合 通常の Set of 4 製品をご購入ください Set of 4 upgrade をカートに入れられたお客様は チェックアウトの際 以前にご購入された SMARTpool 製品の注文番号が必要です 同一遺伝子の SMARTpool 製品 Set of 4 upgrade 製品を同時にご注文することも可能です ) Set of 4 フォーマットの 4 種類の sirna を 1 種類 ( チューブ 1 本 ) ごとの個別とした製品です注 ) 7

8 B. カスタム sirna 2-B-1) カスタム sirna 製品をご注文いただくには ホームページ ( ) のトップページのカスタム RNA 合成 ( 赤実線枠 ) にアクセスしてください 2-B-2) カスタム sirna 製品をご注文いただくには Product タブ ( 緑実践枠 ) から Order sirna( 赤実線枠 ) をクリックして進んでください 8

9 2-B-4) Step One ではオリゴの名前 タイプ Processing オプション 合成スケール Step Two ではターゲット配列などを入力します オーバーハングはデフォルトの状態では UU が選択されています dtdt など他のオーバーハングを選択する場合には オーバーハングの項目で選択してください 下の図は sirna の名前を test タイプを Accell Processing オプションを Standars(A4) 合成スケールを 0.05 µmol Scale ターゲット配列を UGGUUUACAUGUUCCAAUA オーバーハングを UU として入力した場合です 入力確認後 Populate ボタン ( 赤実線枠 ) をクリックすると Step Three に価格が表示されます ( 緑実線枠 ) ショッピングカートに入れる ボタン ( 青点線枠 ) を押すと製品がショッピングカートに入ります 9

10 C. デザイン済み shrna 発現ベクター 2-C-1) ヒト マウス ラット用のデザイン済みshRNA 発現ベクターを検索いただくには ページ上部にあるウィンドウ ( 赤実線枠 ) に 以下の項目のいずれか一つを入力し 検索ボタン ( ) をクリックしてください Ref Seq Accession ( 例 :NM_007299) Gene ID ( 例 :672) Gene Symbol ( 例 :BRCA1) Catalog No. ( 例 :SK ) 下の画面は NM_ と入力して検索した結果が表示された状態です 製品ならびに関連する学術情報が 遺伝子 のフィールドに表示されます shrna のリンク ( 青点線枠 ) から各製品リストのページに移動してください 2-C-2) 各種デザイン済み shrna 発現ベクターの +( 赤実線枠 ) をクリックすると さらに詳細な製品リストが表示されます 希望の製品を選択後 ショッピングカートに入れる ボタンをクリックすると製品がショッピングカートに入ります 注 ) SMARTvector Lentiviral shrna の購入に際しては SMARTchoice Promoter Selection Plate( 製品コード SP ) を SMARTvector Inducible Lentiviral shrna の購入に際しては SMARTchoice Inducible Non-targeting Control 4-Pack( 製品コード VSC6847) 用いて 使用する細胞に最適なプロモーターを事前に検討 選択することをおすすめします 10

11 D. デザイン済み microrna 研究用試薬 2-D-1) ヒト マウス ラット用のデザイン済みmicroRNA 研究用試薬 (miridian microrna Mimicおよび Hairpin Inhibitor) をご注文いただくには ページ上部にあるウィンドウ ( 赤実線枠 ) に 以下の項目のいずれか一つを入力し 検索ボタン ( ) をクリックしてください mirbase Mature Accession ( 例 :MIMAT MIMAT ) mirbase Precursor Accession ( 例 :MI MI ) mirbase ID ( 例 :hsa-let-7d mmu-mir-122) Catalog No. ( 例 :C C IH ) 下の画面は MIMAT と入力して検索した結果が表示された状態です 製品ならびに関連する学術情報が 遺伝子 のフィールドに表示されます microrna のリンク ( 青点線枠 ) から各製品リストのページに移動してください 2-D-2) 下の画面は has-let-7d-5p に対する microrna 試薬を検索した結果が表示された状態です +( 赤実線枠 ) をクリックすると 詳細な製品リストが表示されます 希望の製品を選択後 ショッピングカートに入れる ボタンをクリックすると製品がショッピングカートに入ります 11

12 E. RNAi コントロール試薬 2-E-1) RNAi コントロール試薬をご注文いただくには ホームページ ( のトップページの RNA 干渉 ( 赤実線枠 ) にアクセスしてください 2-E-2) RNAi Controls( 赤実線枠 ) をクリックしてください 12

13 2-E-3) ご希望の RNAi コントロール試薬にアクセスしてください 以下に ON-TARGETplus Controls ( 赤実線枠 ) を例に説明します 2-E-4) 下の図は 各種 ON-TARGETplus コントロール試薬を表示した画面です ご希望の ON-TARGETplus コントロールにアクセスし ショッピングカートに入れてください ターゲット遺伝子に対する sirna として ON-TARGETplus をご使用の場合は ネガティブコントロールとして ON-TARGETplus Non-targeting コントロールを必ずご選択ください 13

14 F. トランスフェクション試薬 2-F-1) トランスフェクション試薬 (DharmaFECT 等 ) をご注文いただくには 2-E-1) と同様に Dharmacon 本社 Web サイト ( のトップページから RNA 干渉に進み Transfection ( 赤実線枠 ) にアクセスしてください 2-F-2) 下の図は Products タブ ( 赤実線枠 ) をクリックして各種トランスフェクション試薬 (DharmaFECT 等 ) を表示した画面です ご希望のトランスフェクション試薬にアクセスし ショッピングカートに入れてください Cell Line Data( 緑実線枠 ) をクリックすると 細胞株ごとに最適な DharmaFECT 試薬を検討した例が表示されますので 製品選択のご参考にしてください (15 ページ参照 ) 14

15 細胞株ごとに最適な DharmaFECT 試薬を検討した例 ( 抜粋 ) G. ウイルスパッケージング試薬 2-G-1) ウイルスパッケージング試薬 (Trans-Lentiviral shrna Packaging Kit 等 ) をご注文いただくには 2-E-1) と同様にホームページ ( のトップページから RNA 干渉に進み Viral Packaging ( 赤実線枠 ) にアクセスしてください H. その他の試薬 (5 x sirna Buffer 等 ) 2-H-1) その他の試薬 (5X sirna Buffer Accell sirna Delivery Media RNase-free Water 等 ) をご注文いただくには 2-E-1) と同様にホームページ ( のトップページから RNA 干渉に進み Ancillary Reagents ( 赤実線枠 ) にアクセスし ご希望の試薬を選択してショッピングカートに入れてください 15

16 Edit-R CRISPR-Cas9 ゲノム編集アプリケーション概要 Horizon Discovery 社では 下記 3 つのアプリケーションに合わせて CRISPR-Cas9 システムによるゲノム編集に必要なコンポーネントであるガイド RNA(guide RNA) Cas9 ヌクレアーゼ ドナー DNA(donor DNA) をご用意しています 遺伝子ノックアウトガイド RNA と Cas9 ヌクレアーゼを使用して ターゲット遺伝子の機能をゲノム DNA レベルで欠損させる手法です (A) この手法は 塩基配列は既知だが機能のよくわかっていない遺伝子を研究する際に用いられます RNA 干渉による mrna レベルでの遺伝子ノックダウンでは表現型の違いが検出されない遺伝子の機能研究に有効です 遺伝子ノックイン & 塩基配列の挿入 欠失 置換ガイド RNA Cas9 ヌクレアーゼ ドナー DNA を使用して ゲノム上のターゲット部位に タンパク質をコードする遺伝子を導入したり 塩基配列の挿入 欠失 置換を行う手法です (B) 遺伝子の転写活性化ガイド RNA と改変 Cas9 ヌクレアーゼを使用して ターゲット遺伝子の転写を活性化させる手法です (C) この手法では 遺伝子過剰発現用プラスミドの使用を回避しつつ 内在性の遺伝子の転写活性化を実現します RNA 干渉による遺伝子ノックダウンや 遺伝子ノックアウトによる機能欠損では表現型の違いが検出されない遺伝子の機能研究に有効です A. CRISPR-Cas9 システムによる遺伝子ノックアウトのメカニズム Cas9 ヌクレアーゼが ターゲット配列に相補的なガイド RNA と複合体を形成してゲノム DNA のターゲット配列を認識し PAM 配列より上流の二本鎖 DNA を切断します 切断されたゲノムは修復機構が働いて再結合しますが 切断されたゲノムの末端は高頻度で欠損あるいは変異します したがって再結合しても DNA のフレームがシフトし 切断個所の遺伝子がノックアウトされます ガイド RNA として CRISPR RNA (crrna) : trans-activating CRISPR RNA (tracrrna) ハイブリッドを用いる方法と シングルガイド RNA(single guide RNA sgrna) を用いる方法があります A. crrna : tracrrna ハイブリッドを用いる方法 B. sgrna を用いる方法 16

17 B. CRISPR-Cas9 システムによる遺伝子ノックインや塩基配列の挿入 欠失 置換 CRISPR-Cas9 による二本鎖切断に続いて起こる相同組み換え修復 (homology-directed repair: HDR) は 特定のゲノム改変位置に隣接した配列に相同性を持つドナー DNA(donor DNA) を必要とする修復経路です 適切に設計されたドナー DNA を使用することで 遺伝子ノックインや塩基配列の挿入 欠失 置換を正確に行うことができます Dharmacon Web サイト (dharmacon.horizondiscovery.com) の Web ツールである Edit-R HDR Donor Designer (dharmacon.horizondiscovery.com/gene-editing/crispr-cas9/edit-r-hdr-donor-designer/) の使用により ヒト マウス ラットの遺伝子について ドナー DNA の設計を直感的で簡便に行うことができます ドナー DNA 設計ワークフロー 1 ガイド RNA 配列の決定 2 切断したいゲノム配列位置の決定 3 ドナー DNA の設計 CRISPR Design Tool でカスタム設計 あるいは デザイン済みガイド RNA (knockout 用 ) から選択 一本鎖 DNA ドナーオリゴを使用して塩基配列 ( 長さ 50 nt 以下 ) を挿入 欠失 置換する場合 Edit-R HDR Donor Designer oligo に ステップ 1 で決定したガイド RNA 配列を入力し 切断位置および挿入 欠失 置換する配列を設計 ドナープラスミドを使用して 蛍光レポーター遺伝子あるいは塩基配列 ( 長さ 50 nt 以上 ) を挿入する場合 Edit-R HDR Donor Designer plasmid に ステップ 1 で決定したガイド RNA 配列を入力し 挿入位置を決定 一本鎖 DNA ドナーオリゴを使用して塩基配列 ( 長さ 50 nt 以下 ) を挿入 欠失 置換する場合ステップ 2 で設計した一本鎖 DNA ドナーオリゴの配列が自動で設計されるので注文へ ドナープラスミドを使用して 蛍光レポーター遺伝子あるいは塩基配列 ( 長さ 50 nt 以上 ) を挿入する場合ステップ 2 で決定した遺伝子挿入位置を反映した ドナープラスミド作製時に必要なホモロジーアーム PCR プライマーの配列が自動で設計されるので注文へ C. CRISPR-Cas9 システムによる遺伝子の転写活性化のメカニズム Edit-R CRISPR-Cas9 システムを使用した遺伝子の転写活性化 (CRISPR activation, CRISPRa) は 野生型の Cas9 ヌクレアーゼの持つ DNA 切断活性を欠失させた dead Cas9 (dcas9) に 3 種類の転写活性化因子 (VP64 p65 Rta) を融合させた改変 Cas9 ヌクレアーゼ (dcas9-vpr) と ターゲット遺伝子のプロモーターあるいは転写開始点 (TSS) に近接した領域に配列設計したガイド RNA (guide RNA) を細胞内に導入し ターゲット遺伝子の転写を活性化する手法です dcas9-vpr は ターゲット配列に相補的な CRISPR RNA (crrna) : trans-activating CRISPR RNA (tracrrna) ハイブリッドあるいは シングルガイド RNA(single guide RNA sgrna) と複合体を形成してゲノム DNA のターゲット配列に結合します そして ターゲット遺伝子の転写開始点に転写活性化因子が作用することで転写を活性化します A; crrna : tracrrna ハイブリッドを用いる方法 B; sgrna を用いる方法 17

18 I. デザイン済み crrna/sgrna 2-I-1) ヒト マウス ラット用のデザイン済みcrRNAおよびsgRNAをご注文いただくには ページ上部にあるウィンドウ ( 赤実線枠 ) に 以下の項目のいずれか一つを入力し 検索ボタン ( ) をクリックしてください Ref Seq Accession ( 例 :NM_ ) Gene ID ( 例 :3845) Gene Symbol ( 例 :KRAS) Catalog No. ( 例 :CR ) 下の画面は NM_ と入力して検索した結果が表示された状態です 製品ならびに関連する学術情報が 遺伝子 のフィールドに表示されます crrna/sgrna のリンク ( 青点線枠 ) から各製品リストのページに移動してください 2-I-2) 下の画面はヒト KRAS 遺伝子に対する crrna/sgrna を検索した結果が表示された状態です 遺伝子ノックアウトには Edit-R CRISPR (knockout) crrna/sgrna を 遺伝子の転写活性化には Edit-R CRISPR (activation) crrna/sgrna を選択してください +( 赤実線枠 ) をクリックすると 詳細な製品リストが表示されます 18

19 2-I-3) タブ ( 赤実線枠 ) をクリックすることで 各容量を選択できます 希望の容量を選択後 ショッピングカートに入れる ボタン ( 青点線枠 ) をクリックすると製品がショッピングカートに入ります 2-I-4) ショッピングカートに製品が入ると ショッピングカート内のカッコ内の数字が変わります 数字はアイテム数を示しています ショッピングカートの上にマウスオーバーすると ショッピングカートの中味 ( 赤実線枠 ) が表示されます また ショッピングカートに入れる ボタンが 追加する ( 青点線枠 ) に変わります crrna の使用に際しては tracrrna が必須となります 次ページを参照いただき お忘れなくご用意ください 19

20 crrna:tracrrna の修飾によるヌクレアーゼ耐性 Edit-R crrna の 5 末端と Edit-R tracrrna の 3 末端に修飾 ヌクレアーゼ耐性をもつガイド RNA として機能 Cas9 へのリクルートは問題なし RNA 分解が遅延 - 特に Electroporation による導入で編集効率 UP 20

21 J. Cas9 ヌクレアーゼ 2-J-1) Cas9 ヌクレアーゼ試薬をご注文いただくには Dharmacon 本社 Web サイト ( のトップページの ゲノム編集 ( 赤実線枠 ) にアクセスしてください 2-J-2) Cas9 Nuclease( 赤実線枠 ) をクリックしてください 21

22 2-J-3) Products タブ ( 赤実線枠 ) から ご希望の製品にアクセスしてください 2-J-4) 下の画面は 2-J-3) において Edit-R Cas9 Nuclease Expression reagents を選択した結果が表示された状態です Edit-R Cas9 Expression Plasmids についてはプロモーター ( 赤実線枠 ) と選択マーカーを選択することができます ショッピングカートに入れる ボタン ( 青点線枠 ) をクリックすると製品がショッピングカートに入ります 22

23 K. dcas9-vpr 2-K-1) dcas9-vpr をご注文いただくには Dharmacon 本社 Web サイト ( のトップページ上部バナーの アプリケーション から CRISPR Activation ( 赤実線枠 ) にアクセスしてください 2-K-2) dcas9-vpr lentiviral plasmid ( 赤実線枠 ) をクリックしてください 23

24 2-K-3) ショッピングカートに入れる ボタン ( 青点線枠 ) をクリックすると製品がショッピングカートに入ります 24

25 L. 遺伝子ノックアウト用のカスタムガイド RNA 2-L-1) Dharmacon 本社 Web サイト ( の各ページの下にあるツールバーから CRISPR デザインツール ( 赤実線枠 ) にアクセスしてください 2-L-2) CRISPR Design Tool Get started now! ( 赤実線枠 ) をクリックしてください 2-L-3) ターゲット遺伝子全体を対象としてノックアウト用のガイド RNA を設計するには Input gene ID or gene symbol: design anywhere within gene ( 赤実線枠 ) を選択して下さい Next ( 青点線枠 ) をクリックしてください 25

26 2-L-4) ガイド RNA を設計するターゲット遺伝子情報 (Gene ID や生物種 ) を入力し ( 赤実線枠 ) ターゲット領域を選択します ( 緑実線枠 ) 下図は ウシの BRCA1 遺伝子のタンパク質コード領域に対してガイド RNA を設計する場合です Next ( 青点線枠 ) をクリックしてください 2-L-5) Next ( 青点線枠 ) をクリックしてください 26

27 2-L-6) 設計したガイド RNA のターゲット配列候補がエクソン順に表示されます ( 本デザインオプションでは タンパク質の機能的なノックアウト能力の順位付けはされません ) 使用したガイド RNA 設計アルゴリズム (Edit-R algorithm) で予測した各ガイド RNA の特異性は Specificity ( 緑実線枠 ) に表示されます 希望するガイド RNA のターゲット配列の ( 例えば 赤実線枠 ) に を入れた後 Next ( 青点線枠 ) をクリックしてください 27

28 2-L-7) タブ ( 赤実線枠 ) をクリックすることで 各容量を選択できます 希望の容量を選択後 ショッピングカートに入れる ボタン ( 青点線枠 ) をクリックすると製品がショッピングカートに入ります ( 赤点線枠のタブから sgrna をご注文いただけます ) 28

29 M. DNA 配列挿入 欠失 置換用のカスタムガイド RNA&ssDNA ドナー 2-M-1) Dharmacon 本社 Web サイト ( の各ページの下にあるツールバーから CRISPR デザインツール ( 赤実線枠 ) にアクセスしてください 2-M-2) CRISPR Design Tool Get started now! ( 赤実線枠 ) をクリックしてください 2-M-3) 一本鎖 DNA(ssDNA) ドナーを用いた DNA 配列挿入 欠失 置換用のガイド RNA を設計するには Input gene ID or gene symbol: precise cleavage for HDR ( 赤実線枠 ) を選択して下さい Next ( 青点線枠 ) をクリックしてください 29

30 2-M-4) ガイド RNA を設計するターゲット遺伝子情報 (Gene ID 等 ) を入力し ( 赤実線枠 ) 生物種を選択します ( 緑実線枠 ) 下図には ヒトの EGFR 遺伝子に対してガイド RNA を設計する場合を例として示しました 設定後 Next ( 青点線枠 ) をクリックしてください 2-M-5) 転写産物を選択します ( 緑実線枠 )( デフォルト設定では主要な転写産物が表示されます ) 拡大 ( 小 ) 鏡とカーソル ( 緑点線枠 ) を用いて 編集したいゲノム領域付近を表示させクリックします ( 例えば 青点線枠 ) 表示される赤枠内のゲノム領域が下のパネルに表示されます 下図はヒトの EGFR 遺伝子内のエクソン 21 付近が例として表示された状態です ゲノム編集したい塩基配列付近 ( 例えば 赤点線枠 ) をクリックします 赤枠 30

31 2-M-6) 下図はヒトの EGFR 遺伝子について エクソン 21 にコードされる 858 番めのアミノ酸であるロイシンをコードする塩基配列をクリックした結果が表示された状態です 候補となるガイド RNA のターゲット配列が下のパネルに表示されます 希望するガイド RNA のターゲット配列 ( 例えば緑実線枠 ) をクリックして選択し NEXT( 青点線枠 ) をクリックします 注 ) 各ガイド RNA のターゲット配列には 数字 (1 2 3 ) と英字 (High Medium Low) が記載されています 数字は 各ガイド RNA のターゲット配列について タンパク質の機能的なノックアウト能力および特異性の両方を総合的に評価したランキングを示します ここで 1 がランキングが一番高いことを示唆します なお 英字 (High, Medium, Low) は特異性を示します 31

32 2-M-7) ガイド RNA のターゲット配列が表示されます ( 赤実線枠 ) タブ ( 緑実線枠 ) をクリックすることで 各容量を選択できます 希望の容量を選択後 ショッピングカートに入れる ( 青点線枠 ) をクリックすると製品がカートに入り crrna をご注文いただけます ( 赤点線枠のタブから sgrna をご注文いただけます ) 引き続き DNA 配列の挿入 欠失 置換用の ssdna ドナーをデザインするにはガイド RNA のターゲット配列をメモ ( あるいはコピー ) した後 Edit-R HDR Donor Designer( 緑点線枠 ) をクリックしてください 2-M-8)DNA 配列の挿入 欠失 置換用の ssdna ドナー (150 ヌクレオチド以下の長さ ) を設計する場合は Edit-R HDR Donor Designer - oligo( 赤実線枠 ) をクリックしてください 32

33 2-M-9) ガイド RNA を設計するターゲット遺伝子情報 ( 生物種 Gene ID 転写産物等 ) を 2-M-4) および 2-M-5) と同様に設定し ( 赤実線枠 ) 2-M-7) でメモ ( あるいはコピー ) したガイド RNA のターゲット配列を入力します ( 緑実線枠 ) 設定後 Display target region ( 青点線枠 ) をクリックしてください 2-M-10) 1 DNA 配列を挿入する場合は オレンジのスライド ( 赤実線枠 ) を DNA 配列を挿入したい箇所までドラッグして移動させます 挿入したい塩基 ( 緑実線枠 : 下図では例として AGG) を入力後 Get sequence( 青点線枠 ) をクリックします 2 DNA 配列を欠失 置換させる場合は オレンジのスライド ( 赤実線枠 ) のカギをクリックして外した後 DNA 配列を欠失 置換させたい箇所まで左右のオレンジのスライドをドラッグして移動させます 置換したい塩基 ( 緑実線枠 : 下図では例として T G へ置換する場合です ) を入力後 ( 配列を欠失させる場合はブランクとしてください ) Get sequence( 青点線枠 ) をクリックします 以降は 2 の場合を例として説明します 1 DNA 配列を挿入する場合 2 DNA 配列を欠失 置換させる場合 カギ 33

34 2-M-11) 候補となる ssdna ドナーの配列が下のパネルに表示されます 推奨される ssdna ドナー配列が赤実線枠内に表示されます 青色でハイライトされている塩基は ガイド RNA による切断を回避するために導入したサイレント変異です 希望の ssdna ドナーの に を入れ ssdna ドナーの名称や合成スケール 合成後の精製の有無 安定化修飾の有無を入力 選択します ( 緑実線枠 ) Add to cart ボタン ( 青点線枠 ) をクリックすると製品がショッピングカートに入ります 34

35 N. 蛍光レポーター遺伝子 / カスタム配列導入用のカスタムガイド RNA&PCR プライマー 2-N-1) Dharmacon 本社 Web サイト ( の各ページの下にあるツールバーから CRISPR デザインツール ( 赤実線枠 ) にアクセスしてください 2-N-2) CRISPR Design Tool Get started now! ( 赤実線枠 ) をクリックしてください 2-N-3) Edit-R HDR Plasmid Donor Kit システム (40 ページ ) を用いた蛍光レポーター (EGFP mkate2) 遺伝子あるいはお客様の希望するカスタム配列導入用のガイド RNA を設計するには Input gene ID or gene symbol: precise cleavage for HDR ( 赤実線枠 ) を選択して下さい Next ( 青点線枠 ) をクリックしてください 35

36 2-N-4) ガイド RNA を設計するターゲット遺伝子情報 (Gene ID 等 ) を入力し ( 赤実線枠 ) 生物種を選択します ( 緑実線枠 ) 下図は ヒトの SEC61B 遺伝子に対してガイド RNA を設計する場合です 設定後 Next ( 青点線枠 ) をクリックしてください 2-N-5) 転写産物を選択します ( 緑実線枠 )( デフォルト設定では主要な転写産物が表示されます ) 拡大 ( 小 ) 鏡とカーソル ( 緑点線枠 ) を用いて 編集したいゲノム領域付近を表示させクリックします ( 例えば 青点線枠 ) 表示される赤枠内のゲノム領域が下のパネルに表示されます 下図はヒトの SEC61B 遺伝子内のエクソン 1 付近が例として表示された状態です ゲノム編集したい塩基配列付近 ( 例えば 赤点線枠 ) をクリックします 赤枠 36

37 2-N-6) 下図はヒトの SEC61B 遺伝子について エクソン 1 にコードされる開始コドンをコードする塩基配列をクリックした結果が表示された状態です 候補となるガイド RNA のターゲット配列が下のパネルに表示されます 希望するガイド RNA のターゲット配列 ( 例えば緑実線枠 ) をクリックして選択し NEXT( 青点線枠 ) をクリックします 注 ) 各ガイド RNA のターゲット配列には 数字 (1 2 3 ) と英字 (High Medium Low) が記載されています 数字は 各ガイド RNA のターゲット配列について タンパク質の機能的なノックアウト能力および特異性の両方を総合的に評価したランキングを示します ここで 1 がランキングが一番高いことを示唆します なお 英字 (High, Medium, Low) は特異性を示します 37

38 2-N-7) ガイド RNA のターゲット配列が表示されます ( 赤実線枠 ) タブ ( 緑実線枠 ) をクリックすることで 各容量を選択できます 希望の容量を選択後 ショッピングカートに入れる ( 青点線枠 ) をクリックすると製品がカートに入り crrna をご注文いただけます ( 赤点線枠のタブから sgrna をご注文いただけます ) 引き続き mkate2 蛍光レポーター遺伝子を導入するために使用するドナープラスミド構築用のカスタムホモロジーアーム PCR プライマーをデザインするには ガイド RNA のターゲット配列をメモ ( あるいはコピー ) した後 Edit-R HDR Donor Designer( 緑点線枠 ) をクリックしてください 2-N-8) mkate2 蛍光マーカー遺伝子を導入するために使用するドナープラスミド構築用のカスタムホモロジーアーム PCR プライマーを設計する場合は Edit-R HDR Donor Designer - plasmid( 赤実線枠 ) をクリックしてください 38

39 2-N-9) ガイド RNA を設計するターゲット遺伝子情報 ( 生物種 Gene ID 転写産物等 ) を 2-N-4) および 2-N-5) と同様に設定し ( 赤実線枠 ) 2-N-7) でメモ ( あるいはコピー ) したガイド RNA のターゲット配列を入力します ( 緑実線枠 ) 挿入する遺伝子を選択します ( 緑点線枠 ) 設定後 Show Insert Region ( 青点線枠 ) をクリックしてください 以下は mkate2 蛍光レポーター遺伝子を挿入する場合の例です 2-N-10) 赤色のスライド ( 赤実線枠 ) を mkate2 蛍光レポーター遺伝子を挿入したい箇所までドラッグして移動させます 下図にはヒトの SEC61B 遺伝子の N 末端に mkate2 蛍光レポーター遺伝子を導入する場合を例として示しました 開始コドン直後に読み枠をあわせて挿入しています Get primers( 青点線枠 ) をクリックします 注 ) 弊社の Edit-R HDR Plasmid Donor Kit システム (40 ページ下 ) は 内在性遺伝子の転写産物上の開始および終止コドンを利用するようにデザインされています ( すなわち 蛍光レポータータンパク質は ターゲット遺伝子のコードするタンパク質との融合タンパク質として発現させます ) そのため カスタムホモロジーアーム PCR プライマーは 内在性遺伝子の転写産物領域内に蛍光レポーター遺伝子挿入部位が位置するように設計する必要があります 理想的には 蛍光レポーター遺伝子の挿入部位は ターゲット遺伝子の N 末端に挿入する場合には開始コドンの直後 C 末端に挿入するには終止コドンの直前に設定します 蛍光レポーター DNA 配列の直前には 4 アミノ酸残基 直後には 3 アミノ酸残基のリンカーが挿入されています 39

40 2-N-11) mkate2 蛍光レポーター遺伝子を導入するために使用するドナープラスミド構築用のカスタムホモロジーアーム PCR プライマーの候補が表示されます 青色でハイライトされている塩基は ガイド RNA による切断を回避するために導入したサイレント変異です 希望のプライマーの ( 例えば 赤実線枠 ) に を入れ プライマーセットの名称を入力します ( 緑点線枠 ) Edit-R HDR Plasmid Donor Kit mkate2( 本製品の概要については本ページ下の説明をご覧ください ) も同時に注文する場合は緑実線枠にチェックを入れてください Add to cart ボタン ( 青点線枠 ) をクリックすると製品がショッピングカートに入ります カスタムホモロジーアームプライマーを用いたゲノム DNA からのホモロジーアームの PCR 増幅 Edit-R HDR plasmid donor kit の概要 蛍光レポーター (EGFP mkate2) 遺伝子 あるいは お客様の希望するカスタム配列 *1 をゲノムのターゲット部位に導入するために用いるドナープラスミドを 迅速かつ高効率で構築するために必要な試薬をキット化した製品です ドナープラスミドのバックボーン 蛍光レポーター配列 (EGFP および mkate2 キットの場合 ) ドナープラスミド構築を確認するために用いるコロニー PCR 用プライマーを含みます 製品形態は凍結乾燥品です ドナープラスミドの構築には 本キットの他に カスタムホモロジーアーム PCR プライマーや DNA Assembly cloning Kit 等々が別途必要です 詳しくは本キットのテクニカルマニュアルをご覧ください *1 カスタム配列はお客様自身で別途ご用意ください 40

41 O. cdna/orf クローン 2-O-1) cdna/orfクローンを検索いただくには ページ上部にあるウィンドウ ( 赤実線枠 ) に 以下の項目のいずれか一つを入力して検索ボタン ( ) をクリックしてください Ref Seq Accession ( 例 :NM_007299) Gene ID ( 例 :672) Gene Symbol ( 例 :BRCA1) Catalog No. ( 例 :MHS ) 画面は NM_ と入力して検索した結果が表示された状態です 製品ならびに関連する学術情報が 遺伝子 のフィールドに表示されます cdna/orf のリンク ( 青点線枠 ) から各製品リストのページに移動してください 2-O-2) 各種 cdna/orf クローンの +( 赤実線枠 ) をクリックすると さらに詳細な製品リストが表示されます 希望の製品を選択後 ショッピングカートに入れる ボタンをクリックすると製品がショッピングカートに入ります 41

42 P. 酵母クローン ( ノックアウト株等 ) 2-P-1) 酵母クローンを検索いただくには ページ上部にあるウィンドウ ( 赤実線枠 ) に ORF 名を入力して検索ボタン ( ) をクリックしてください 下の画面は YAL067C と入力して検索した結果が表示された状態です 製品ならびに関連する学術情報が 遺伝子 のフィールドに表示されます Non Mammalian のリンク ( 青点線枠 ) から各製品リストのページに移動してください 2-P-2) 各種酵母クローンの +( 赤実線枠 ) をクリックすると さらに詳細な製品リストが表示されます 希望の製品を選択後 ショッピングカートに入れる ボタンをクリックすると製品がショッピングカートに入ります 42

43 Q. sirna/microrna/crrna カスタムライブラリー 2-Q-1) sirna/microrna/crrna カスタムライブラリーは 興味のある遺伝子を標的とするデザイン済み sirna や microrna 研究用試薬 crrna をプレートに自在にレイアウトできる製品です 最少 20 ウェルからプレートにレイアウトできます 小容量包装のため コストを抑えた RNAi 実験が可能です sirna/microrna/crrna カスタムライブラリーをご注文いただくには Dharmacon 本社 Web サイト ( の各ページの下にあるツールバーから Cherry-pick ライブラリープレーター ( 赤実線枠 ) にアクセスしてください 2-Q-2) Get started now( 赤実線枠 ) をクリックして新たなページに進んでください 43

44 2-Q-3) Product から製品のタイプを選択します 2-Q-4) 検索キーワードの種類を選択します 2-Q-5) 検索キーワードを入力します 検索方法は 以下の 1 あるいは 2 から選択ください 1 検索キーワードをウィンドウに入力します 検索キーワードは 1 行に 1 つずつ入力します 2 検索キーワードを収めたファイルをアップロードする場合は Upload File タブ ( 赤線実線枠 ) からファイルを選択してアップロードしてください アップロードできるファイル形式は csv 形式です 44

45 2-Q-6) タブ ( 赤実線枠 ) から生物種を選択し Next ( 青点線枠 ) をクリックします 2-Q-7) 遺伝子を確認して ( 赤実線枠 ) に を入れた後 Next ( 青点線枠 ) をクリックします 2-Q-8) +( 赤実線枠 ) からご希望に製品タイプおよびフォーマットを選択後 Next ( 青点線枠 ) をクリックします 以下に遺伝子あたり 4 つの individual: sigenome sirna Reagent を選択した場合の例を示します 45

46 2-Q-9) ご希望の容量 ( 赤実線枠 ) 等のライブラリー仕様を設定後 ショッピングカード ( 青点線枠 ) をクリックします 46

47 STEP3: カートページから注文完了まで 3-1) ページ右上の ショッピングカート ( 赤実線枠 ) をクリックすると カートのページに移動します このページで注文した製品の製品番号 注文個数を確認できます - 製品の注文個数を変更したい場合には 直接数字を入力して ショッピングカートを更新する ボタンを押してください 製品を削除する場合は カートを空にする ボタンをクリックしてください 注文をこのまま進めるには 注文する ( 青枠点線 ) をクリックしてください Ichiro.suzuki@horizon.com 注 1) 注 2) 複数の製品をご注文いただく場合 一番納期の遅い製品にあわせてまとめて出荷されます 早めに納品を希望される場合は 別々にご注文ください 表示される納期に 日本への輸入 通関 輸送の時間が追加されます 実際の予定納期は販売店様にご連絡ください 3-2) 製品を購入する代理店を選択後 ( 赤実線枠 ) Terms and conditions に同意される場合はボックスにチェックを入れ ( 緑実線枠 ) 注文する ボタン ( 青枠点線 ) をクリックすると注文が完了します * 特に代理店を複数登録されているお客様は 代理店選択項目にご注意ください Horizon 大学東京都 XX 区 XXX A 株式会社東京営業所 A 株式会社東京営業所 47

48 3-3) 注文が完了すると以下のページが表示されます お客さまには受注のお知らせメールを 販売店様には注文受領のご案内メールが届きます 注文完了後 ご注文に関するご連絡 お問い合わせは 販売店様にお願いいたします ご連絡 お問い合わせには受付番号が必要となりますので 表示された番号 ( 赤実線枠 ) を記録していただきますよう よろしくお願いいたします Horizon 大学医学部 Suzuki Ichiro 様 48 問合せ先フナコシ株式会社 東京都文京区本郷 2 丁目 9 番 7 号 ユーザー登録 注文 / 納期に関するお問合せ 受託推進部 TEL: FAX: dharmacon@funakoshi.co.jp 試薬について技術的内容のお問合せ テクニカルサポート部 TEL: FAX: reagent@funakoshi.co.jp