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せせらいさやま
4 years ago
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1 KPSL セミナー総合支援型研究検査ラボ九州プロサーチ LLP(KPSL) 高感度マルチイムノアッセイ技術のご紹介高感度マルチイムノアッセイ / ELISA 1

2 高感度マルチイムノアッセイ電気化学発光法 (ECL) を利用した多項目を同時に定量できる技術バイオマーカー測定や免疫原性アッセイなどに活用 1 最大 10 項目まで同時測定 2 必要な検体量が ELISA 法よりも少量 3 夾雑物の影響が少なく非特異反応が低減 4 広いダイナミックレンジで高感度に測定可能という特徴を持った測定法メソスケール社 MESO QuickPlex SQ つのウェル内には最大 10 のスポットがあり各スポットに異なる抗体が固相化複数のバイオマーカーを同時に測定可能 2

3 高感度マルチイムノアッセイ基本的な原理はELISA法と同様であり検出にECLを使用 ①プレートに固相化したCapture 抗体と分析試料を反応 ②SULFO-TAG標識抗体ルテニウム錯体を添加し2次反応 ③プレート底面に電気を流すことで化学発光強度を測定ルテニウム錯体が還元することにより発光高感度ＣＣＤカメラにて検出底面の反応する電極表面の検出抗体のみ発光するためバックグラウンドノイズが少ない 3

4 高感度マルチイムノアッセイヒト血清血漿尿にてサイトカイン10項目を同時定量ダイナミックレンジが広く健常者レベルの低濃度領域まで定量マルチ測定とシングル測定の比較両者の差ほとんどないマルチで測定しても他項目と競合なく測定可能 4

5 高感度マルチイムノアッセイ測定パネル Panel Human Cytokines 30-plex Human Proinflammatory Panel Analytes Eotaxin, Eotaxin-3, GM-CSF, INF-γ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-8(HA*), IL-10, IL12p70, IL-12/IL-23p40, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IP-10, MCP-1, MCP-4, MDC, MIP-1α, MIP-1β, TARC, TNF-α, TNF-β, VEGF-A INF-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p70, IL-13, TNF-α *HA:high abundance Human Cytokine panel Human Chemokine panel Human TH17 Panel Human Angiogenesis Panel Aβ Peptide Panel GM-CSF, IL-5, IL-1α, IL-7, IL-12/IL-23p40, IL-15, IL-16, IL-17A, TNF-β, VEGF-A Eotaxin, IP-10, MIP-1β, MDC, Eotaxin-3, TARC, MIP-1α, MCP-1, MCP-4, IL- 8(HA*) IL-17A, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, MIP-3α VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, Flt-1/VEGFR-1, PlGF, FGF(basic), Tie-2 Aβ38, Aβ40, Aβ42 上記以外にも様々なパネル測定技術をご用意しておりますお問い合わせください 5

6 アナリティカルデータの例-1 感度一般的なR&D社製 ELISA KitのLLOQ pg/ml 一般的なELISA法よりもより高感度に測定が可能

7 正確性 ( 再現性 ) アナリティカルデータの例 -2 日内再現性日間再現性ほぼCV=10% 以内ロット間正確性の評価

アナリティカルデータの例-3 Luminex法とECL法の比較 IL-1B IL-6 Intra-assay Inter Laboratory Intermatrix Intra-assay Inter Laboratory Intermatrix Luminex① 1.54 1.84 5.76 1.54 6.5 20.

8 アナリティカルデータの例-3 Luminex法とECL法の比較 IL-1B IL-6 Intra-assay Inter Laboratory Intermatrix Intra-assay Inter Laboratory Intermatrix Luminex① Luminex② ECL 引用文献 Anal.Chem.2008,80, Luminex法での測定ラボ内ラボ間再現性及びサンプルマトリクスの影響あり MSD社のECL法優位性のある結果 8

9 アナリティカルデータの例 -4 実検体での低濃度域サイトカイン検出感度比較 Luminex MSD 引用文献 CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, Aug. 2011, p 検出感度検出感度各種 Luminex ベースの測定法に比べ MSD 社システムで低濃度域の各種サイトカインを検出できている 9

10 その他の多項目同時測定高感度測定機器サスペンションアレイシステム Bio-Plex(BIO-RAD 製 ) Luminex (ThermoFisher Scientific 製 ) Merck Millipore 製 Affymetrix 製など最大 100 種類の生体分子を定量検出可能デジタルELSIA Simoa (Quanterix 社 ) fmレベルの超高感度最大 4 種類マルチプレックス測定 10

11 Bio-Plex の測定原理バイオラッド社資料より 11

12 高感度マルチイムノアッセイを用いた網羅的探索 Published: February 21, 2018 クローン病 (CD) マーカーである Calprotectin に代わるマーカーを ECL 法を用いて探索 CD 患者 39 名糞便中カルプロテクチン 200 mg/kg 以上未満でグループ分け血清中の 37 種のサイトカインついて 2 群で比較した 12

13 測定結果一覧カルプロテクチン 200 mg/kg 以上において有意差のあったサイトカイン IFN γ CRP(p<0.05) IL-6 TNF β SAA IL-17A(p<0.01) 13

14 測定結果考察カルプロテクチン 200 mg/kg以上において有意差のあったサイトカイン IFN γ CRP p<0.05 IL-6 TNF β SAA IL-17A p<0.01 クローン病では Th1 Th17 反応の亢進がみられる Th1 細胞からの産生 IFN γ Th17 細胞からの産生 IL-6 IL17A CRPの上昇 SAAはCRPとオーバーラップし感度もより高い IL-6やTNFなどの作用により産生カルプロテクチンレベルとECL測定結果相関があるカルプロテクチンに代わるマーカーとして活用できないか 14

15 高感度マルチイムノアッセイを用いると全37サイトカイン 5回のAssayで測定終了できる網羅的に調べることで着目する分子の候補選びができる 15

ELISA 測定 ELISA( 単項目 ) 比色蛍光発光など多様な検出器に対応ラボ開設 (2014 年 7 月 ) から 200 項目以上の測定実績糖尿病 GLP-1(Active,Total) GIP(Active,Total) DPP-Ⅳ activity, scd26, 膵 glucagon 酸化ストレス 8-OHdG, AGE, CML, α-klotho, HO-1,

16 ELISA 測定 ELISA( 単項目 ) 比色蛍光発光など多様な検出器に対応ラボ開設 (2014 年 7 月 ) から 200 項目以上の測定実績糖尿病 GLP-1(Active,Total) GIP(Active,Total) DPP-Ⅳ activity, scd26, 膵 glucagon 酸化ストレス 8-OHdG, AGE, CML, α-klotho, HO-1, HTLA4, methyglyoxal, MDA(TBARS), srage 唾液測定マーカー α-amylase, chromogranin A, cortisol, melatonin, siga, oxytocin, 代謝 adiponectin(hmw,total), ghrelin, L-carnitine, leptin, NPY, PCSK9, PYY, RBP4, resistin 増殖因子サイトカイン chemerin, FABP4, FGF-21,23, G-CSF, GM-CSF, INF-γ, IL- 1α,1β,1ra,2,4,5,6,7,8,10,12,13,15,16,17A IP-10, L-FABP, MCP-1,4, MDC, MIP-1α, TFPI, TGF-β1, TNF-α, vaspin, VEGF 血管新生接着因子 ACEⅡ, angiopoietin-1,2, angiotensin(1-7), angiotensinⅡ, ICAM-1, VCAM-1 16

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