Microsoft PowerPoint - No7_Pap染色の基本原理.ppt

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft PowerPoint - No7_Pap染色の基本原理.ppt"

よしじろうなかきむら
4 years ago
Views:

1 パパニコロウ染色の理論精度管理時の質問疑問事項を中心に各種アルコール類の違い / 固定脱色素の溶解アルカリ色出しの OG 染色への影響リンタングステン酸の役割や効果染色液使用開始後の注意点と染色液の継ぎ足し他千葉県臨床衛生検査技師会第 3 回病理細胞診検査研究班合同研修会平成 22 年 1 月 30 日渡辺明朗

2 蛋白質の三次構造 H3N + イオン結合エタノール固定 / 各種アルコール類の違い NH3 + COO - CH3 親油性官能基同士の親和疎結合エタノールアルコール固定蛋白質 H2N NH2 COOH CH3 親油性ジスルフィド結合 S S OH NH2 素結合 COO - S S 親性 -OH -NH2 COOH 各種アルコール類 ( メタノール CH3OH エタノールイソプロピルアルコール (CH3)2CHOH) の固定原理は同じで蛋白とは反応しなく主に脱作用により蛋白質の三次構造を変化させて固定する

3 固定力細胞の収縮 ( 親油性 ) イソプロピル変性アルコールエタノール 95% エタノールメタノールサコマノ液アルコールエタノール 88.5% エタノール 49% (CH3)2CHOH 各種アルコール類の特性と用途イソプロピルアルコール 11% メタノール約 0.5% CH3OH 49% PEG1540 約 2% (>) 大小 ( 細胞収縮度 :95% エタノールとメタノールはほぼ同じ ) ( 浸透速度 : エタノール<メタノール ( 小分子で粘性が小 ) Pap 染色標本 :95% エタノール湿固定塗抹を基本エタノール濃度: 約 95% で可但し分が多くなると固定力低下 ( 繰り返し使用分混入注意 ) 95% エタノールと95% 変性アルコールで固定力ほぼ同じ 95% エタノールとエタノール / エーテル (1/1) 固定力 95% エタノール > エタノール / エーテルエーテルはエタノールの浸透性を向上さ浸透力 95% エタノール < エタノール / エーテルせる効果はあるが固定効果は小さい固定時間( 湿固定では細胞内分と固定液の置換ないし脱に時間がかかる ) 固定時間固定 ( スプレー式固定剤の主成分 ) 短い ( 例 3 分 ) 適切 (10~30 分 ) 長い固定不十分 (1~2 日位なら染色にほぼ影響なし ) 問題点: 核の染まり淡い ( ホルマリンは固定時間により蛋白の架橋度が高くなり染色に影響 )

4 Orange G Na+ 各種アルコール類への酸性色素の溶解性と洗浄力酸性色素 ( オレンジ G, エオシンライトグリーン ) の溶解性イソプロピルアルコール < 変性アルコール < エタノール < メタノール O H H OG 2- Orange G O H H Na+ O H H OG 2- H OG 2- O H Na+ H Na + イオン化することにより分子間にイオン化したオレンジ G が入り込み溶解 - H H δ+ δ- H H O δ+ δ- H O δ- O 素結合アルコール類に難溶色素同士の静電気性親和が強いのでアルコール類に難溶 OG-EA 間とEA 染色後の洗浄 100% エタノールより95% エタノールor95% 変性アルコールがベター (100% エタノールor100% 変性アルコールだと洗浄が不十分になるリスクあり ) 洗浄力 : 変性アルコール< エタノール δ+ Na + -

5 エタノールと変性アルコールの違い ( 染色への影響 )/ 再生エタノール /ph 1) エタノールと変性アルコールの違い ( 染色への影響 ) エタノールと変性アルコールは染色液用溶媒としてほぼ同じように使用可が溶媒の色素の溶解性や細胞組織成分溶出のリスクの違いを考慮する必要あり変性アルコールエタノール 88.5% イソプロピルアルコール 11% メタノール約 0.5% 2) 再生エタノールと再生変性アルコール混入の可能性大蒸留による再生の場合とエタノールが共沸するのでアルコールにが少量混入することが多い分が混入したエタノールで脱退色の原因スダン Ⅲ 脂肪染色スダン Ⅲ 溶解 : 70% エタノール <70% 変性アルコール脂質溶出リスク : 70% エタノール <70% 変性アルコール封入剤 + キシレン細胞色素カバーカラス 3) 有機溶媒 ( キシレンエタノール ) の ph ph は溶媒中素イオン H + 濃度の指標であり有機溶媒は正確な ph 測定は困難基本的にキシレンとエタノールそのものは中性と考えて可 OG EA 後のエタノールと再生エタノールは基本的に中性と考えて可スライトカラスエタノール Eosin Yの溶解性約 30-40% エタノール約 1% キシレンポリマーカバーガラスの縁の部分のキシレンが蒸発し封入剤が固化するが細胞の存在する中心部分には透徹及び封入剤由来のキシレンが長期間蒸発することなく残留する

025% 低強 0.5% 0.015% 0.5% 0.010% 高弱色出しにアルカリを使用すると ph 上昇に伴いオレンジ G の染まりが抑制される Br O Br COONa O Br ph 7.

6 染色強度染色強度染色強度pH 値と 3 種類の酸性色素の染色強度 / リンタングステン酸の効果オレンジGオレンジ OG-5 G ph エオシンYエオジンY OG の目的扁平上皮癌細胞細胞質の染色 OG-6 OG OG リンタン NaO Br ph 染色力 0.5% 0.025% 低強 0.5% 0.015% 0.5% 0.010% 高弱色出しにアルカリを使用すると ph 上昇に伴いオレンジ G の染まりが抑制される Br O Br COONa O Br ph 7.0 ライトグリーンイエロ - ライトグリーン OG-EA 間のリンタン / 酢酸の効果 7.0 ph [P(W3O10)4] 1% 3- リンタングステン酸のpH 約 2.4 染色の透明感とpH 低下によるエオジンの染色が抑制されオレンジGとライトグリーンの染まりが優勢

7 核小体の主要成分と親和する色素細胞部位成分結合する色素核クロマチン DNA リン酸基 =PO4 - ヘマトキシリンヒストン塩基性蛋白質 -NH3 + エオジンライトグリーン細胞質核小体 DNA リン酸基 =PO4 - RNA リン酸基 =PO4 - 塩基性蛋白質 -NH3 + 蛋白質 COO - -NH3 + RNA リン酸基 =PO4 - 糖脂質ヘマトキシリンヘマトキシリンエオジンライトグリーンエオジンライトグリーンオレンジG ヘマトキシリンヘマトキシリン核小体の染まり塩酸分別不十分十分ヘマトキシリンにより青紫色エオジン or ライトグリーンどちらをとるかは右に依存エオジンに染まりやすい状況ライトグリーンに染まりやすい状況 1EA 染色時間短め 2EA 染色液 ph 高め 3 核小体の構築が密 1EA 染色時間長め 2EA 染色液 ph 低め 3 リンタン酢酸処理入り 4 核小体の構築が疎

8 染色液使用開始後の注意点と染色液の継ぎ足し 1) 染色液使用開始後の注意点 ( 経時的問題 ) 染色力の低下 ( 色素の消費 & 液の持込 ) 液の持込による染色液の特性の変化ギルヘマトキシリン (Half-oxidized hematoxylin) アルコールの蒸発ヘマトキシリン OG EA ph 上昇共染のリスク ( 色出し用アルカリの持込 ) phの上昇 OG 染色の抑制 (OG 後のリンタンの持込 ) ph 低下エオジン染色抑制経時的にヘマテイン濃度が増大し染色強度が増大する使用時点でヘマトキシリンの染色強度異なることあり ( 濃縮 ) ( 濃縮 ) 2) 染色液の継ぎ足し原則的に一定期間染色液継ぎ足し可但し継ぎ足しにより染色液中の試薬成分 ( 媒染剤リンタングステン剤他 ) の分量比が変化し ph の変化や染色強度が変化例ヘマトキシリン 1~4 週間 OG,EA 1~3 週間定期的に染色液の全交換がベターヘマトキシリン液の継ぎ足し媒染剤のヘマトキシリンに対する濃度比が上昇染色強度抑制 EA 液の継ぎ足し OG 後にリンタン使用の場合 EA 液の ph が低下エオジンの染色抑制

9 染色可能枚数と染色操作過程の染色カゴの上下 1. 染色可能枚数 ( 推定 : 約 800~1500 枚 / 各 Pap 染色液 500ml) 色素濃度低下による染色力の低下の原因 1 染色による色素濃度の消費 2 液の持込サクラ自動染色装置 DRS-2000( 染色槽 :650ml 染色カゴ :40 枚 ) における HE 染色標本枚数とサクラヘマトキシリン 3G とサクラエオジンの吸光度変化吸光度サクラヘマトキシリン 3G 吸光度サクラエオジン 1000 染色標本累計枚数染色可能枚数 : 約 /650mlヘマトキシリン3G 2. 染色カゴの上下がベター 1 色素が細胞成分とより速く接触しより速くかつ均一な染色 2 脱透徹においても溶媒と細胞内溶媒がより速く交換但し染色カゴ上下は細胞剥離のリスク高くなる 1000 染色標本累計枚数染色可能枚数 : 約 /650mlエオジン色素細胞上下スライドグラス

10 ヘマトキシリン染色液の種類と染色強度 / 切片と塗抹細胞の違い染色液マイヤー 2 倍カラッチギル Ⅳ Ⅴ ハリスヘマトキシリン 1 g/l 2 g/l 4g, 5g/L 5 g/l 2. 切片と塗抹細胞の違い切片 4μm 切片 2μm 塗抹細胞 DNA DNA 色素 DNA 色素色素染色力強1. ヘマトキシリンの種類と染色強度 ( 染色力 ) 弱サクラ染色液シリーズミクロトームで薄切され組織成分がむき出しになり染まりやすくヘマトキシリン濃度低くて可 ( マイヤーヘマトキシリン ) 薄い切片ではヘマトキシリンが親和すべき核 DNA 量が少なくなるので濃く染めるにはヘマトキシリン濃度の高く染色力の強い染色液が適す ( 例 2 倍カラッチ ) 重積細胞の一つ一つに色素が入り込むためには色素濃度の高く染色力が強い染色液が適す ( 例ギル Ⅳ Ⅴ ハリス ) 但し色素濃度が高いと共染や過染のリスクが高くなる

Alcian blue染色 Elastica Van Gieson染色

Alcian blue染色 Elastica Van Gieson染色 Alcian blue 染色平成 19 年度基礎講座目的 Alcian blue 染色生体に存在する酸性ムコ物質を検出する方法として広く用いられている酸性ムコ物質はカルボキシル基を有するヒアルロン酸硫酸基を有するコンドロイチン硫酸ムコイチン硫酸ケラト硫酸ヘパリンなどの 2 つのグループに分類される Alcian blue 染色液の ph 値を調節することによりその 2 種類の酸性ムコ物質を染め分けることができる