650 Fluorophore 690 Fluorophore DMSO ( 1 x 500 μl) 1 x 1.5 ml) Opal polymer HRP Ms+Rb ( 2 x 50mL) Blocking/Ab Diluent (1 x 100 ml) 4 x 250ml) * 数量は Op

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よしじろうやすこ
6 years ago
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1 Manual Multiplex IHC For laboratory use only. A research method for research purposes only. Opal TM 4-7-color Manual IHC Kit 製品情報保存条件 : 遮光冷蔵保存 (4 ) 製品受領後 Opal 色素のみ DMSO 溶解前は -20 保存安定性 : 上記保存条件で 3 ヶ月間は安定適用用途 : Opal 4-7-color Manual IHC kit はパラフィン切片における蛍光多重染色試薬です製品取扱上の注意 : 製品は危険物毒劇物の人体に有害な物質は含有しませんが作業者の安全のために使い捨て手袋安全ゴーグルの着用をお勧めします試薬の使用後は手洗いの実施をお勧めします品質管理 : 製品製造上の品質管理基準を満たしています Opal 染色について Opal 染色は単一の組織切片において複数のタンパク質分子を抗体染色する蛍光染色手法です本方法はホルマリン固定パラフィン包埋組織 (FFPE) における 4-7 重蛍光免疫染色法として記述します Opal 染色では同一動物種由来の 1 次抗体を複数用いた多重染色が可能です Opal 染色は蛍光 TSA 試薬と電子レンジ処理 (microwave treatment, MWT) により 1 次抗体 2 次抗体を除去すると共に組織切片の内在性ペルオキシダーゼの除去による非特異シグナルと切片が持つ自家蛍光を低減します MWT 処理後は抗体の交叉反応性に関わらずさらに免疫組織化学染色を繰り返し複数種の分子を染色することが可能です Opal 染色とマルチスペクトルイメージング装置を組み合わせることで最大 6 種類のマーカー分子を同時に検出し共局在解析も可能です凍結切片微細針吸引生検標本などの染色についてはパーキンエルマーまでお問い合わせください Opal 4-7-plex キット構成 1 数量 ( スライド )* 製品番号構成内容 Opal 4-color Kit, 50 slides NEL810001KT 50 ml) Opal 520 Fluorophore Fluorophore 90 Fluorophore DMSO ( 1 x 500 μl) 1 x 1.5 ml) Opal polymer HRP Ms+Rb ( 1 x 50mL) Blocking/Ab Diluent (1 x 100 ml) 2 x 250ml) Opal 7-Color Kit 50 slides NEL811001KT 1X Plus Amplification Diluent (2 x 50 ml) Opal 520 Fluorophore 40 Fluorophore 570 Fluorophore 620 Fluorophore

2 650 Fluorophore 690 Fluorophore DMSO ( 1 x 500 μl) 1 x 1.5 ml) Opal polymer HRP Ms+Rb ( 2 x 50mL) Blocking/Ab Diluent (1 x 100 ml) 4 x 250ml) * 数量は Opal Working Solution ( 本ページ参照 ) を 1 スライドあたり ~150 μl 使用した場合ですキット付属品以外に必要なものマテリアル電子レンジ 1000W ( 出力調整可能なもの ) 耐熱染色バット (Opal Slide Processing Jars 製品番号 : STJAR4) 染色バットモイストチャンバー疎水性バリアペン (PAP ペン Vector Labs, 製品番号 H-4000 など ) オービタルシェイカーパラフィン切片スライド作成備品一式免疫染色用スライドグラスアスピレーターキムワイプピンセット試薬 TBST 緩衝液 ( 洗浄液 ) (TBS (ph7.5), 0.025%(w/v) Tween 20) 1 次抗体封入剤 (ProLong Diamond, Life Technologies など ) キシレンエタノール蒸留水過酸化水素メタノール溶液調整 TBST 緩衝液 M TRIS-HCl, ph M NaCl 0.05% Tween % 過酸化水素 / メタノール溶液 30% 過酸化水素をメタノールで 100 倍に希釈してください AR6 Buffer Working Solution ペルオキシダーゼフリー水で 10 倍に希釈してください Primary Antibody Working Solution 1 次抗体を適切な抗体希釈液で希釈してください Secondary Antibody Working Solution Ready-to-Use で使用できますマウスラビット由来 1 次抗体に反応します Opal Fluorophore Working Solution はじめて Opal Fluorophore を使用する場合キット付属の DMSO 75 μl で溶解します溶解後は 4 暗所で保管してください各々の Opal Fluorophore をキット付属の 1X Amplification Diluent により 100 倍希釈し各蛍光色素の Opal Working Solution とします 1 スライドあたり μl の Opal Working Solution が必要です希釈済みの Opal Working Solution は保存できません 2

3 DAPI working solution DAPI solution 2 滴を 1ml の TBST で希釈してください希釈済みの DAPI working solution は保存できません使用上の注意シグナルが強すぎるときには 1 次抗体 2 次抗体または Opal Working Solution をさらに希釈して条件検討を実施してください多重染色をする前に各 1 次抗体を単染色にて染色性の確認をしてくださいキット付属の 2 次抗体 (Opal polymer HRP Ms+Rb) はマウスおよびラビット 1 次抗体に反応しますその他の 1 次抗体の場合には適切な HRP 標識 2 次抗体をご使用ください電子レンジ処理は抗原賦活内在性ペルオキシダーゼの失活および抗体を除去する作用があることが報告されています FFPE 切片の脱パラフィンにはキシレンを使用し各染色プロセスではスライドを乾燥させないようにご注意ください各インキュベーションステップではモイストチャンバーを使用し乾燥に注意してください ( 湿らせたペーパータオルを入れた遮光容器などをご使用ください ) 各ステップでの溶液の持ち込みが最小になるようにしてくださいキムワイプなどで適宜ブロッティングにより溶液を吸着除去します切片が十分に覆われるだけの十分な試薬をご使用ください Opal 染色手順の概要 3

4 染色手順 1. 切片が貼付されたスライドを 65 で 2 時間 ~ オーバーナイトでベーキングしスライドグラスへの接着性を高めます 2. 脱パラフィンスライド切片を以下の順で溶媒に浸漬し脱パラフィンします 1) キシレン 10 分 2) キシレン 10 分 3) キシレン 10 分 4) 100% エタノール 5 分 5) 95% エタノール 5 分 6) 70% エタノール 5 分 3. 内因性ペルオキシダーゼのブロッキング 1) 0.3% 過酸化水素 / メタノールで 20~30 分間反応させます 2) 蒸留水で洗浄します注 : 当社実績では MilliQ 水を使用するとバックグラウンド上昇の原因になります蒸留水の使用を強く推奨します 4. 以下手順により電子レンジ処理します 1) スライドグラスを耐熱性染色バット中の 100 ml の Antigen retrieval solution (Citric acid solution, ph6.0) に浸漬します 2) 耐熱性染色バットにフタをし電子レンジの出力を 100% で 45 秒間煮沸します 3) 電子レンジの出力を 20% にしさらに 15 分間煮沸しますフタは外しません 4) レンジから染色バットを取り出しベンチ上で 20 分以上放置し空冷します Note: この段階で終夜放置することも可能です 5) TBST で洗浄します 5. 余分な TBST を切片周囲からキムワイプを用いて拭き取ります 6. PAP ペンを用いて切片周囲を縁取ります 7. 切片に Blocking/Ab Diluent を滴下し室温のモイストチャンバー中で 10 分間インキュベートします注 : PerkinElmer Antibody Diluent / Block を使用した場合の代表的なプロトコールです時間は適宜調整してください 8. Blocking/Ab Diluent を吸引除去し希釈済みの 1 次抗体を滴下 (100 ~ 300 μl /tissue) します注 : 抗体濃度反応時間は 1 次抗体の至適条件に従います 9. モイストチャンバー中でインキュベートします 10. TBST で 3 分間 3 回洗浄します次抗体 Opal polymer HRP Ms+Rb を滴下 (100 ~ 300 μl /tissue) し室温で 10 分間インキュベートします 12. TBST で 3 分間 3 回洗浄します 13. 希釈済み Opal Fluorophore Working Solution を切片に滴下 (100 ~ 300 μl /tissue) し室温で 3~10 分間インキュベートします 14. TBST で 3 分間 3 回洗浄します 15. ステップ 4 の電子レンジ処理を行います 4

5 16. 2 種目の 1 次抗体で上記 7-12 の手順を繰り返します 17. ステップ 13 の Opal Fluorophore Working Solution とは異なる蛍光色素の Opal Fluorophore Working Solution を切片に滴下 (100 ~ 300 μl /tissue) し常温で 3~10 分間インキュベートします 18. TBST で 3 分間 3 回洗浄します 19. ステップ 4 の電子レンジ処理を行います種目の 1 次抗体で上記 7-12 の手順を繰り返します 21. ステップ 17 の Opal Fluorophore Working Solution とは異なる蛍光色素の Opal Fluorophore Working Solution を切片に滴下 (100 ~ 300 μl /tissue) し常温で 3~10 分間インキュベートします 22. TBST で 3 分間 3 回洗浄します Opal-7-color kit の場合にはステップ 4 の電子レンジ処理および上記 7-12 の手順を繰り返し 4 種目 ~6 種目の染色を行います 23. 希釈済みの DAPI 溶液を切片に滴下し 5 分間インキュベートします 24. TBST で 3 分間 1 回蒸留水で 1 回洗浄します 25. 退色防止剤入りの適切な封入剤を用いて封入します参考文献 Toth, Zsuzsanna E., and Eva Mezey. "Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species." Journal of Histochemistry & Cytochemistry 55.6 (2007): Stack, E.C., Wang, C., Roman, K., and Hoyt, C.C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods: (2014) doi: /j.ymeth Opal 蛍光色素の励起蛍光波長 Excitation Emission Cap color Spectral DAPI 358 nm 461 nm Blue Opal nm 525 nm Green Opal nm 536 nm Yellow Opal nm 570 nm Red Opal nm 616 nm Amber Opal nm 650 nm Orange Opal nm 694 nm Clear 5

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免疫組織染色用試薬免疫染色用抗体免疫組織染色は抗体を用いて組織細胞内の抗原を可視化する手法で現在幅広く用いられています当社では免疫組織染色に使用できる抗体を数多く取扱っています Fas 抗マウス Fas, ウサギマウス肝臓 ( パラフィン切片 ) 概要免疫組織染色においてマウス肝臓の肝細胞細胞質及び卵巣の顆粒層細胞卵細胞に発現している Fas と反応交差性マウスラット使用濃度