MANUAL TSA Research Reagents Caution: For Laboratory Use. A research chemical for research purposes only. TSA Fluorescence Systems Tyramide Signal Amp

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えりかかんざとばる
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1 MANUAL TSA Research Reagents Caution: For Laboratory Use. A research chemical for research purposes only. TSA Fluorescence Systems Tyramide Signal Amplification For in situ Hybridization and Immunohistochemistry 1/20

2 キットの内容 TSA Fluorescein NEL701A001KT ( スライド分 ) NEL701001KT ( スライド分 ) SAT701001KT ( スライド分 ) SAT701B001KT (500 1,500 スライド分 ) 1x Amplification Diluent (15mL) Fluorescein Tyramide ( 乾燥品 300µL DMSO で溶解 ) Streptavidin-HRP (150µL) ブロッキング試薬 (3g) 1x Amplification Diluent (30mL) Fluorescein Tyramide ( 乾燥品 DMSO 600µL で溶解 ) Streptavidin-HRP (2x 150µL) ブロッキング試薬 (10g) 1x Amplification Diluent (30mL) Fluorescein Tyramide ( 乾燥品 DMSO 600µL で溶解 ) 1x Amplification Diluent (2x 75mL) Fluorescein Tyramide ( 乾燥品 DMSO 600µL で溶解 5 本 ) TSA Tetramethylrhodamine (TMR) NEL702001KT 1x Amplification Diluent (30mL) ( スラ TMR Tyramide ( 乾燥品 DMSO イド分 ) 600µL で溶解 ) Streptavidin-HRP (2x 150µL) ブロッキング試薬 (10g) SAT702001EA ( スライド分 ) TSA Coumarin NEL703001KT ( スライド分 ) TSA Cyanine 3 NEL704A001KT ( スライド分 ) SAT704A001EA ( スライド分 ) SAT704B001EA ( スライド分 ) 1x Amplification Diluent (30mL) TMR Tyramide ( 乾燥品 DMSO 600µL で溶解 ) 1x Amplification Diluent (30mL) Coumarin Tyramide ( 乾燥品 DMSO 600µL で溶解 ) Streptavidin-HRP (2x 150µL) ブロッキング試薬 (10g) 1x Amplification Diluent (15mL) Cyanine 3 Tyramide ( 乾燥品精製水 300µL で溶解 ) Streptavidin-HRP (150µL) ブロッキング試薬 (3g) 1x Amplification Diluent (15mL) Cyanine 3 Tyramide ( 乾燥品精製水 300µL で溶解 ) 1x Amplification Diluent (75mL) Cyanine 3 Tyramide ( 乾燥品精製水 300µL で溶解 5 本 ) TSA Cyanine 5 NEL705A001KT ( スライド分 ) SAT705001EA ( スライド分 ) 製品情報保存条件遮光下 +4 C 1x Amplification Diluent (15mL) Cyanine 5 Tyramide ( 乾燥品精製水 300µL で溶解 ) Streptavidin-HRP (150µL) ブロッキング試薬 (3g) 1x Amplification Diluent (15mL) Cyanine 5 Tyramide ( 乾燥品精製水 300µL で溶解 ) 安定性未開封であれば最低 6 か月間は安定です有効期限は製品ラベルに表示されています目次 TSA テクノロジーとは... 3 必要な試薬... 3 その他の試薬... 3 溶液の調整... 3 蛍光チラミドストック溶液 x TNT バッファー... 3 TNB (TN Blocking) バッファー... 3 蛍光チラミド反応液... 3 蛍光物質の励起及び発光波長... 4 一般的な注意事項など... 4 内因性ペルオキシダーゼの不活化... 4 免疫組織化学染色 (IHC) の検出フロー... 5 IHC プロトコール... 6 in situ ハイブリダイゼーション (ISH) の検出フロー... 8 ISH プロトコール... 9 トラブルシューティング IHC シグナルが弱いバックグラウンドが高い ISH シグナルが弱いバックグラウンドが高い IHC 二重蛍光標識の検出フロー異なる動物種の一次抗体が利用可能な場合同じ動物種の一次抗体の場合 ( ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に限る ) ISH 二重蛍光標識の検出フロー参考文献関連製品 /20

3 TSA テクノロジーとは TSA (Tyramide Signal Amplification) は免疫組織化学染色や in situ Hybridization の検出シグナルを簡便かつ短時間の反応で特異的に増幅し染色蛍光での検出感度を向上させる方法ですキットに含まれる蛍光チラミドは低濃度の過酸化水素の存在下西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) の触媒作用によりラジカル化され反応のごく近傍に存在する芳香族アミノ酸と共有結合を形成します HRP 分子の近傍に大量の蛍光分子が共有結合しシグナルが増幅されることになります必要な試薬どのような検出系を組むのかで異なりますが TSA システムでは次の様な HRP 標識試薬が必要ですビオチン化されたプローブや抗体の検出には HRP 標識ストレプトアビジン (NEL750001EA) ジゴキシゲニン (DIG) 標識されたプローブや抗体を検出する場合には HRP 標識抗 DIG 抗体 (NEF832001EA) フルオレセイン標識プローブや抗体を検出する場合には HRP 標識抗フルオレセイン抗体 ( ヒツジ由来 ) (NEF710001EA) 動物種特異的 HRP 標識二次抗体 HRP 標識抗ウサギ IgG 抗体 ( ヤギ由来 ) (NEF812001EA) HRP 標識抗マウス IgG 抗体 ( ヤギ由来 ) (NEF822001EA) 動物種特異的ビオチン標識二次抗体ビオチン標識抗ウサギ IgG 抗体 ( ヤギ由来 ) (NEF813001EA) ビオチン標識抗マウス IgG 抗体 ( ヤギ由来 ) (NEF823001EA) TSA フルオレセインを発色検出する場合には HRP 標識抗フルオレセイン抗体 (NEL710001EA) あるいは AP 標識抗フルオレセイン抗体 ( ヒツジ由来 ) (NEF709001PK) その他の試薬 DMSO (Molecular biology or HPLC grade) 例えば Sigma-Aldrich # D 8418 注意 : DMSO の蒸気は眼や皮膚に対し刺激性があるため安全ゴーグルを着用してドラフトチャンバー内で取り扱ってくださいまた皮膚への浸透性が非常に高いため DMSO で溶けてしまうニトリル製グローブではなくラテックス性グローブを着用してください製品番号が SAT で始まる製品はブロッキング試薬 (FP1020) が別途必要ですバッファー作成に必要な試薬溶液の調整以下のバッファーや試薬はサンプルスライドの準備やシグナル増幅に必要です蛍光チラミドストック溶液蛍光チラミドは乾燥品として供給されます必要量の DMSO あるいは精製水で再構成してストック溶液を作りますこのストック溶液は +4 C 保存で少なくとも 3 か月間は安定です DMSO は +4 C で凍結しますので使用時に解凍して下さいより低温で保管することで安定性が高まるという知見はありませんチューブ 1 本当たりの添加量は以下の通りですチラミド製品番号溶媒容量 Fluorescein NEL701A001KT DMSO 300µL NEL701001KT DMSO 600µL SAT701001EA TMR NEL702001KT, DMSO 600µL SAT702001EA Coumarin NEL703001KT DMSO 600µL Cyanine 3 NEL704A001KT 精製水 300µL SAT704001EA Cyanine 5 NEL705A001KT SAT705001EA 精製水 300µL 10x TNT バッファー g Trizma Base 87.6g NaCl 800mL の精製水を加え 6M HCl で ph7.5 に調整します 10% Tween 20, 50mL を添加し精製水で 1L に調整します室温で数週間保存可能です精製水で 10 倍希釈して使用します TNT 以外のバッファー例えば PBS に置き換えることも可能ですまた Tween 20 を 0.3% Triton X-100 に置換することも可能ですのでご自分で評価しつつ適切なバッファーをお使い下さい TNB (TN Blocking) バッファー 1.211g Trizma Base 0.876g NaCl 80mL の精製水を加え 6M HCl で ph7.5 に調整し精製水で 100mL とします撹拌しながら徐々に粉末ブロッキング試薬 0.5g を加えます撹拌を続けて 55 C まで加熱して完全に溶かします小分けして -20 C で保存可能です一日以上常温で保存した TNB バッファーは廃棄してください蛍光チラミド反応液 DMSO あるいは精製水で溶解したストック溶液を 1x アンプリフィケーション希釈液 (1x Amplification diluent) で 50 倍に希釈しますスライド 1 枚当たりの使用量は µL が目安です使わなかった反応液は再使用せず廃棄します 3/20

4 蛍光物質の励起及び発光波長蛍光物質励起波長発光波長 Coumarin 402nm 443nm Fluorescein 494nm 517nm Tetramethylrhodamine 550nm 570nm Cyanine 3 550nm 570nm Cyanine 5 648nm 667nm 一般的な注意事項など各ステップの途中でスライドが乾燥しないよう注意して下さいインキュベーションは湿潤箱 ( モイストチャンバー ) 内で行って下さい希釈や不均一な反応を避けるため洗浄から反応に移行する際にはキムワイプなどで切片の周りをぬぐうなどしてできる限りバッファーが残らない様にして下さい切片を充分覆う量の反応液を使って下さいカバースリップを使うことで反応液量を減らすことが可能ですシグナルが高すぎる場合一次抗体やプローブあるいは HRP 標識レポーター分子の希釈を試して下さい 1x アンプリフィケーション希釈液には過酸化水素が含まれていますのでチラミド反応液を水などで更に希釈することは避けて下さい初めて TSA システムを使う際は他の系で検出がうまくいっているサンプルで試して下さい内因性ペルオキシダーゼの不活化 TSA 反応はペルオキシダーゼによって触媒されます内因性ペルオキシダーゼはバックグラウンドを生じますので適切に失活させる必要がありますサンプルに応じた失活条件を決めて下さい一般には以下の処理をお勧めします 0.3% - 3% 過酸化水素を含む PBS で分間インキュベーションする 0.3% - 3% 過酸化水素を含むメタノールで分間インキュベーションするパラフィン包埋切片の場合脱パラフィン再水和の後にペルオキシダーゼ不活化を行うことができます凍結切片あるいは細胞塗沫では固定処理の後プロテアーゼ処理の前に不活化を行えます不活化処理の後は TNT あるいは 1x PBS で 5 分間洗浄します 4/20

5 免疫組織化学染色 (IHC) の検出フロー標準的な免疫染色手法ブロッキング内因性ペルオキシダーゼ不活化 (0.3% H 2 O 2 in PBS for 30min or 3.0% H 2 O 2 in PBS for 5 min) 組織への抗体の浸透性を高める ( 必要に応じて ) TNB バッファー中で室温 30 分間ブロッキングを行う一次抗体反応一次抗体と室温で分間反応させる HRP の導入 HRP 標識第二抗体と室温で 30 分間反応させるあるいはビオチン標識第二抗体と室温で分間反応させる SA-HRP と室温で 30 分間反応させる TSA 増幅 TNT バッファーで 5 分間 3 回洗浄後水気を切ったのちチラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする蛍光検出蛍光退色防止剤入りの水性マウント剤などで封入し蛍光顕微鏡で観察する酵素発色検出 (TSA Fluorescein の場合のみ ) HRP あるいは AP 標識した抗フルオレセイン抗体で室温 30 分間インキュベーションする可視化発色基質を加え反応させる対比染色を行い顕微鏡観察する 5/20

6 IHC プロトコール操作 Step 1. 組織切片の準備通常の固定や包埋方法で組織や細胞を準備する脱パラフィンや親水処理を行う内因性ペルオキシダーゼ不活化を行う Step 2. ブロッキング TNB バッファーを添加し湿潤箱内で室温分間あるいは +4 C でオーバーナイトインキュベーションを行う Step 3. 一次抗体との反応 TNB バッファーを除き TNB バッファーで希釈した一次抗体と反応を行うインキュベーション時間や温度は抗体の製造者の指示に従う通常スライド当たり µL を用いる Step 4. 洗浄 TNT バッファー内で撹拌しながら室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す Step 5. HRP の導入 TNB バッファーで希釈した HRP 標識二次抗体と室温で 30 分間あるいは +4 C でオーバーナイトインキュベーションを行うスライド当たり µL を添加し湿潤箱内で行うコメント TNB (TN Blocking) バッファー 0.1M Tris-HCl, ph M NaCl 0.5% ブロッキング試薬次の濃度で TSA 検出を試て予め適切な一次抗体の濃度検討を行って下さいスライド 1: 通常の検出と同じ濃度 ( 製造元の推奨濃度 ) スライド 2: スライド 1 の 5 分の 1 濃度スライド 3: スライド 2 の 5 分の 1 濃度スライド 4: スライド 3 の 5 分の 1 濃度 ( 必要なら更に希釈系列を作る ) スライド 5: 一次抗体無し ( ネガティブコントロール ) TNT バッファー 0.1M Tris-HCl, ph M NaCl 0.05% Tween-20 HRP 標識抗マウス抗体 (NEF822001EA): 500-2,000 倍希釈 HRP 標識抗ウサギ抗体 (NEF812001EA): 500-2,000 倍希釈ビオチン標識二次抗体の場合は以下の操作となります 1) TNB バッファーで希釈して室温で分間反応させる 2) TNT バッファー内で撹拌しながら室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す 3) TNB バッファーで希釈した SA-HRP と室温で 30 分間あるいは +4 C でオーバーナイトインキュベーションを行うキットに含まれる SA-HRP: 100 倍希釈 SA-HRP (NEL750001EA): 1,250-2,500 倍希釈他社の HRP レポーター分子の場合推奨されている希釈倍率よりもより希釈する必要があると思います Step 6. 洗浄 TNT バッファー内で撹拌しながら室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す 6/20

7 Step 7. TSA 増幅キムワイプなどで切片の周りをぬぐうなどしてできる限り TNT バッファーを除く蛍光チラミド反応液をスライド当たり µL 添加する室温で 3-10 分間インキュベーションする湿潤箱内で行うかカバースリップを使い乾燥を防ぐ蛍光チラミド反応液蛍光チラミドストック溶液を 1x アンプリフィケーションダイ希釈液で 50 倍希釈し反応液とします Step 8. 洗浄 TNT バッファー内で撹拌しながら室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す Step 9. 検出 ( 可視化 ) DAPI を含む蛍光退色防止剤入りの水性封入剤などでマウントする蛍光物質が Coumarin の場合には DAPI や Hoechst 以外の対比染色を行ってください TSA Fluorescein の酵素発色検出の場合は以下の手順となります 1) TNB バッファーで希釈した HRP 標識抗フルオレセイン抗体 (1: 25) あるいは AP 標識標識抗フルオレセイン抗体 (1: 100) と湿潤箱内で室温 30 分間反応させる 2) TNT バッファー内で撹拌しながら室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す 3) 適切な発色基質との酵素反応を行う 4) 対比染色を行う ( 例えば DAB, AEC 発色であればヘマトキシリン NBT/BCIP 発色であれば Nuclear fast red) 5) Histomount あるいは ClearMount の様な封入剤を用いてマウントする対比染色やマウント溶媒は発色物質を溶かさない溶媒であることを確認してください対比染色剤の互換性 TSA の蛍光物質 Coumarin (402/443) Fluorescein (494/517) Tetramethylrhodamine (550/570) Cyanine 3 (550/570) Cyanine 5 (648/667) 蛍光対比染色 DAPI Propidium iodide SYTOX Green Hoechst (359/461)- Blue (536/617) Red (502/523) (346/460)- Blue NO YES YES NO YES YES NO YES YES NO YES YES YES NO YES YES YES YES YES YES 7/20

8 in situ ハイブリダイゼーション (ISH) の検出フロー DIG あるいはビオチン標識プローブ濃度と HRP 標識抗ハプテン分子 ( 例えば HRP 標識抗 DIG 抗体や SA-HRP) の希釈率を適切に設定することが良い結果を得るために大切です in situ ハイブリダイゼーションブロッキング HRP の導入 TSA による増幅可視化内因性ペルオキシダーゼの不活化 ( 必要に応じて ) プレハイブリダイゼーション ( 必要に応じて ) プローブハイブリダイゼーション洗い (Stringency wash) TNB バッファー中で室温 30 分間インキュベーションする適当な HRP 標識抗ハプテン分子 (HRP 標識抗 DIG 抗体 SA-HRP など ) と室温で 30 分間インキュベーションする TNT バッファーで 5 分間 3 回洗浄する余分な水分を除きチラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする蛍光検出蛍光退色防止剤入りのマウント剤などで封入し蛍光顕微鏡で観察する酵素発色検出 (TSA Fluorescein の場合のみ ) HRP あるいは AP 標識した抗フルオレセイン抗体で室温 30 分間インキュベーションする TNT バッファーで室温 5 分間 3 回洗浄後発色基質を加え反応させる対比染色を行い顕微鏡観察する 8/20

9 ISH プロトコール操作 Step 1. 組織切片の準備通常の固定や包埋方法で組織や細胞を準備する脱パラフィンや再水和を行う Step 2. ISH 常法に従い ISH をおこなう必要に応じてプレハイブリダイゼーションや内因性ペルオキシダーゼの不活性化を行う標識ハプテンは DIG ビオチン DNP フルオレセインなど自由に選択可能です通常の条件でハイブリダイゼーション後の洗い (Stringency wash) を行いますコメント次の濃度で TSA 検出を試て予め適切なプローブ濃度の検討を行って下さいスライド 1: 通常の検出と同じ濃度のプローブスライド 2: スライド 1 の 5 分の 1 のプローブ濃度スライド 3: スライド 2 の 2 分の 1 のプローブ濃度スライド 4: プローブ無し ( ネガティブコントロール ) 通常の検出系で十分なシグナルが得られているのであれば通常の検出法でぎりぎりシグナルが出るくらいまでにプローブを希釈してから TSA を使った検出を試みて下さい普段の検出でも TSA 増幅を行わないスライドとプローブを加えずに TSA 増幅を行うネガティブコントロールを常に置いて下さい可能ならば次のようなコントロールもご検討下さいネガティブコントロール本来のサンプルで得られたシグナルが特異的であることを確認するための次の 3 種類のコントロール a) Target Control: RNase 処理を行いサンプル中の mrna を分解したもの b) Hybridization Control: センス鎖プローブによりハイブリダイゼーションを行ったものハプテン標識アンチセンスプローブに大過剰 (10 倍程度 ) の標識していないアンチセンスプローブを加えてハイブリダイゼーションを行ったもの c) Detection Control: プローブを加えずにハイブリダイゼーション以降の処理を行ったもの抗ハプテン抗体を加えずに検出を行ったもの TSA による増幅を行わずに他の検出系を用いたものポジティブコントロール対象の組織で確実に発現している mrna に対するプローブを用いた TSA 検出を行うこれによりサンプル由来のパラメーター ( プロテアーゼによる浸透性の向上や内因性ペルオキシダーゼのクエンチングが適切に行われているか ) をまたプローブの標識反応あるいは免疫学的検出自体が機能しているかの確認が行えます Step 3. ブロッキング TNB バッファーを添加し湿潤箱内で室温分間あるいは +4 C でオーバーナイトインキュベーションを行う TNB (TNT Blocking) Buffer 0.1M Tris-HCl, ph M NaCl 0.5% ブロッキング試薬 9/20

10 Step 4. HRP の導入 TNB バッファーで希釈した HRP 標識抗ハプテン抗体と室温で 30 分間あるいは +4 C でオーバーナイトインキュベーションを行うスライド当たり µL を添加し湿潤箱内で行うビオチン標識プローブキットに含まれる SA-HRP: 100 倍希釈 SA-HRP (NEL750001EA): 250 1,000 倍希釈 DIG 標識プローブ HRP 標識抗 DIG 抗体 (NEF832001EA): 100-1,000 倍希釈フルオレセイン標識プローブ HRP 標識抗フルオレセイン抗体 (NEF710001EA): 倍希釈 DNP 標識プローブ HRP 標識抗 DNP 抗体 (FP1129): 倍希釈他社の HRP 抗ハプテン分子の場合推奨されている希釈倍率よりもより希釈する必要があると思います Step 5. 洗浄 TNT バッファー内で撹拌しながら室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す Step 6. TSA 増幅蛍光チラミド反応液をスライド当たり µL 添加する室温で 3-10 分間インキュベーションする湿潤箱内で行うかカバースリップを使い乾燥を防ぐ TNT バッファー 0.1M Tris-HCl, ph M NaCl 0.05% Tween-20 蛍光チラミド反応液蛍光チラミドストック溶液を 1x アンプリフィケーション希釈液で 50 倍希釈します Step 7. 洗浄 TNT バッファー内で撹拌しながら室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す Step 8. 検出 ( 可視化 ) DAPI を含む蛍光退色防止剤入りの封入剤などでマウントを行う蛍光物質が Coumarin の場合には DAPI Hoechst 以外の対比染色を行ってください TSA Fluorescein の酵素発色検出の場合は以下の手順となります 1) TNB バッファーで希釈した HRP 標識抗フルオレセイン抗体 (1: 25) あるいは AP 標識標識抗フルオレセイン抗体 (1: 100) と湿潤箱内で室温 30 分間反応させる 2) TNT バッファー内で撹拌しながら室温 5 分間の洗いを 3 回繰り返す 3) 適切な発色基質との酵素反応を行う 4) 対比染色を行う ( 例えば DAB, AEC 発色であればヘマトキシリン NBT/BCIP 発色であれば Nuclear fast red) 5) Histomount あるいは ClearMount の様な封入剤を用いてマウントする対比染色やマウント溶媒は発色物質を溶かさない溶媒であることを確認してください 10/20

トラブルシューティング IHC シグナルが弱い原因ターゲット抗原がサンプルで発現していないまたは一次抗体の反応性が低い抗原の存在量が非常に低かった一次抗体の濃度が低すぎまたは高すぎた対策あるいは確認方法同じ組織や細胞で用いた抗体によりシグナルが得られているのかを確認しますより高感度な検出が可能な TSA Plus を検討して下さいあるいは HRP の導入時に HRP

11 トラブルシューティング IHC シグナルが弱い原因ターゲット抗原がサンプルで発現していないまたは一次抗体の反応性が低い抗原の存在量が非常に低かった一次抗体の濃度が低すぎまたは高すぎた対策あるいは確認方法同じ組織や細胞で用いた抗体によりシグナルが得られているのかを確認しますより高感度な検出が可能な TSA Plus を検討して下さいあるいは HRP の導入時に HRP ポリマーを利用することを検討して下さい一次抗体の濃度の検討を行います一次抗体をより高い濃度とより希釈したものの両方で検討して下さい濃度の高い場合にシグナルがでないということは信じがたいことですが一次抗体がたくさんサンプルに残ることにより最終的に HRP が大量に存在すると一度に活性化されたチラミド同士が反応してダイマーを作ってしまいサンプルに結合しません HRP 存在量とチラミドシグナルの関係 ( 模式図 ) チラミドダイマーはコラーゲンやエラスチン (Elastin) にアフィニティーがあるという報告 1) が有りますこのためチラミドダイマーが形成された場合結合組織や血管で非特異的なシグナルが出る可能性が有ります検出する抗原に一次抗体がアクセスし難かったチラミド反応が生じない酵素が使われていた一次抗体を抗原にアクセスしやすくするために以下の方法があります a) 何らかの固定が施されたサンプルでは問題ありませんが凍結切片では抗体の浸透性をあげるためにブロッキングバッファーに 0.1% Triton X-100 を添加することができますただし核あるいは細胞質マトリクスを構成するタンパク質あるいは細胞膜上の抗原検出には溶出や膜構造の破壊を避けるため全てのステップで界面活性剤を含まないバッファーの使用を薦めます b) ホルマリン固定パラフィン包埋切片ではエピトープの構造や電荷が変化してしまい一次抗体がうまく認識できないことがありますこのような場合抗原賦活化 (antigen retrieval) と呼ばれる操作を行います賦活化にはいくつかの方法 2-5) があります脱パラフィン再水和の後例えば 10 mm クエン酸 ph 6.0 あるいは 1mM EDTA, ph 8.0 にサンプルスライドを浸し沸騰水浴中でインキュベーションまたは電子レンジで沸騰するまで加熱します蒸留水洗浄 2 分間の後 TBST によるブロッキング 10 分間を行います BioGenex, DAKO, Vector などから賦活化溶液も市販されています HRP 標識二次抗体あるいは SA-HRP をチラミドの反応に用いますアルカリフォスファターゼではチラミド反応は起こりません 11/20

12 チラミドの調整が適切でなかったあるいは分解していた 1x アンプリフィケーション希釈液で希釈したチラミドの失活の可能性最終検出が発色反応の場合酵素標識抗体の希釈が高すぎた発色基質が適切に調整されていなかった試薬の使用順序が適切でなかった蛍光チラミドはこのプロトコールに示された量の DMSO あるいは精製水で再構成します DMSO は Molecular Biology grade あるいは HPLC grade を使用して下さいまた古くなった DMSO は空気中の水分を吸収し冷蔵保存 (+ 4 C) では凍結しなくなりますこのような DMSO はチラミドの再構成に適しません a) 再構成後の保存は + 4 C を薦めます吸湿を防ぐため保存容器をパラフィルムでラップする実験台でふたを開けておいておく時間を最低限にするなど心がけて下さい - 80 C で保存することにより安定性が向上するまたは分解が進むという知見は今のところありません b) 何回もの凍結融解を避けるため小分けして保存なさる方もいらっしゃいますそのような場合にはガラス容器をお勧めしますプラスチック容器の場合おそらく DMSO に溶解する成分があるため問題が生じる場合があります c) DMSO で再構成した後の使用期間は 3 ヶ月間を目安にして下さい 1x アンプリフィケーション希釈液には過酸化水素が含まれるため一度調製した蛍光チラミド反応溶液は 2 3 時間が使用期限です使い切れなかったものは使用せずに廃棄して下さい発色反応に用いた酵素標識抗体の濃度を検討して下さい 2 倍高い濃度を試し下さい発色基質が適切でなかったあるいは分解していた可能性のある場合は発色基質の再調整や新規購入を検討して下さい操作の各ステップの順序や温度時間の再確認を行って下さいバックグラウンドが高い原因内因性ペルオキシダーゼ活性存在した対策あるいは確認方法内因性ペルオキシダーゼの不活化を行います例えば 0.3% から 3% の過酸化水素を含むメタノールまたは PBS を使い室温で分間処理してペルオキシダーゼを失活させますチラミドはペルオキシダーゼにより活性化されてサンプル組織に露出しているチロシン残基と結合します Tyramide O HN OH R H 2 O 2 O 2 HN Peroxidase O O R Isomers HN O R C O H + OH Protein HO HN O OH R R = Biotin, Fluorescence or DNP Tyrosin residue Protein もし組織や細胞に自然に含まれるペルオキシダーゼ活性が残っているとチラミドを活性化して非特異的なシグナルを生じます確認法 : サンプル切片にブロッキングだけを行いチラミド反応液を加えてみます検出を行いシグナルが生じていないかを確認します対策 : バックグラウンドシグナルが生じるのであればクエンチングの過酸化水素の濃度を上げるまたは処理時間を延ばしてみますあるいは他のクエンチング条件を試みます 6) ホルマリン固定パラフィン包埋切片では電子レンジ加熱による抗原の賦活化と同時に内在性ペルオキシダーゼ失活が行を行った例があります 7) 内因性ビオチンが存在した ( ビオチンアビジン系を使用した場合 ) 内因性ビオチンはパラフィン包埋切片の場合よりも凍結切片の場合に問題になることがありますサンプルとしては肝臓腎臓消化管肺脾臓脳乳腺脂肪組織あるいはリンパ節などが特に存在量が多いようです 12/20

13 確認法 : a) ブロッキングを行い蛍光または酵素標識ストレプトアビジンを反応させるシグナルが生じないかを確認します b) ブロッキングを行い HRP 標識ストレプトアビジン (SA-HRP) だけを反応させさらにチラミド反応を行いシグナルが生じていないかを確認します対策 : 可能であればサンプルをパラフィン包埋に変更します市販の内因性ビオチンブロッキングキット (DAKO X0590, Life Technologies ) を使用するあるいはビオチンストレプトアビジンの介在する反応を回避する系を検討して下さい一次抗体または標識二次抗体あるいは SA-HRP の濃度が高かった HRP 標識二次抗体や SA-HRP のストック溶液に凝集物が含まれそれが切片に沈着してしまった非特異的結合のブロッキングが不十分だった洗浄が不十分だった切片が部分的に乾燥してしまった自家発光を回避する何枚かのスライドを準備し TSA を用いずに検出していた場合あるいは抗体の製品説明書で推奨する希釈の 4 5 倍希釈した一次抗体を検討します一次抗体を 100 倍希釈で使用していた場合 1: 100, 1: 500, 1: 2,500 や 1: 12,500 の希釈を検討します二次抗体であれば 2 倍希釈を検討してみます確認法 : 内因性ペルオキシダーゼのクエンチングを行い一次抗体を用いずにその後の全ステップを行ったコントロール切片サンプルで非特異的シグナルが生じていないかを確認します対策 : 一次抗体をより希釈する更にバックグラウンドが出るようであれば二次抗体を希釈する HRP 標識二次抗体をより種特異性の高いものに換えて下さいストック溶液を軽く遠心して上清を希釈して使って下さい TSA ブロッキング試薬に 2-10 % の通常血清を組み合わせて使ってみます通常血清は用いる二次抗体の由来動物種と同じものを用います TSA ブロッキング試薬を一次抗体二次抗体あるいは SA-HRP 希釈液に添加することも非特異的バックグラウンドを抑えるため効果があることがあります粉末の TSA ブロッキング試薬を溶解する場合 0.1M Tris-HCl, ph7.5, 0.15M NaCl バッファーに徐々に加え撹拌したまま 55 C 程度に加熱して下さい 8) 分間撹拌して完全に溶かして下さい小分けして -20 C 保存が可能です TSA プロトコールに示されている洗いの回数は最低限必要な回数です回数を増やしたり時間を延ばしたり振盪することが効果的であることがあります細胞表面や / オルガネラ膜の染色以外では洗浄バッファーに界面活性剤を添加します組織や細胞の乾燥が起こった場合 ( 特にサンプルの端で ) まだら状の高いバックグラウンドを生じます対策 : サンプルを覆うのに十分な量の試薬を用いますまたカバースリップを使ったりインキュベーションを湿潤箱内で行い乾燥を防いでください内在性リポフスチン (Lipofuscin) やエラスチン由来の可能性やグルタルアルデヒドあるいはホルムアルデヒド固定に由来する自家発光が考えられます 9) 対策 : a) 発色による検出に切り替えるあるいは Cyanine 5 の使用を検討してください b) アルデヒド固定した切片では自家発光が生じることがありますこれは修飾された ε- アミノ基と蛍光物質が結合しているものと思われます一次抗体の反応の前に 50mM NH 4 Cl を含む PBS 中で 10 分間室温インキュベーション後 PBS でリンスします 13/20

14 ISH シグナルが弱い原因 mrna が対象サンプルで発現していないターゲット mrna が分解してしまった可能性は無いかプローブおよびハイブリダイゼーション条件対処法あるいは確認方法 RT-PCR で発現を確認してみて下さい凍結切片の場合組織は - 80 C で一ヶ月以上保存しないクリオスタット切片は 48 時間以内に使用する RNase の混入を避ける基本的な操作を行って下さいブローブの標識効率や濃度の確認を行う組織や細胞にプローブを浸透しやすくするためにプロテアーゼ処理や界面活性剤処理を試みて下さいバックグラウンドが高い ISH におけるバックグラウンドの原因はプローブ標識やハイブリダイゼーションの条件あるいは免疫学的手法を使った検出のどちらかまたは両方に由来しますプローブに由来するバックグラウンドプローブ濃度が高すぎた静電気によりプローブが非特異的に切片に付着したハイブリダイゼーションやその後の洗いのストリンジェンシーが低かった免疫学的手法に由来するバックグラウンド内因性ペルオキシダーゼまたは内因性ビオチンの影響ハプテンを認識する抗体濃度が高いあるいは凝集物を含んでいたブロッキングや洗いが不十分だった用いる試薬の量が不十分で切片の乾燥が生じたサンプルの自己蛍光確認法 : バックグラウンドが何に由来するのかを確認するためプローブを省くかセンス鎖プローブを使ったコントロールスライドで TSA 検出操作を行ってくださいコントロールスライドでバックグラウンドが見られないのであればプローブ濃度あるいはハイブリダイゼーション条件洗いのストリンジェンシーを検討して下さいバックグラウンドが見られたら免疫学的検出の条件を検討して下さい原因プローブおよびハイブリダイゼーション条件対処法あるいは確認方法 a) プローブ濃度を通常の検出の場合の 2 10 倍に希釈してみる b) プレハイブリダイゼーションの時間を延ばすあるいは行っていなければ行ってみる c) ハイブリダイゼーション温度を上げるバッファーのホルムアミド濃度を上げるなどにより, ストリンジェンシーを上げる d) 洗いのストリンジェンシーを上げる ( 塩濃度を下げる温度を上げる SDS 濃度を上げる ) e) 静電的なプローブの非特異的結合を減らすため切片のアセチル化 (0.25% acetic anhydride in 0.1M triethanolamine) を行ってみる f) Riboprobe を用いた場合ハイブリダイゼーションの後に RNase A 処理を行う g) T3 プロモーターによるプローブ作成であれば T7 や SP6 プロモーターに替えてみる免疫学的検出条件 IHC の項を参照 14/20

15 IHC 二重蛍光標識の検出フロー異なる動物種の一次抗体が利用可能な場合標準的な免疫染色手法ブロッキング一次抗体反応内因性ペルオキシダーゼの不活化 ( 必要に応じて ) 組織への抗体の浸透性を高める ( 必要に応じて ) TNB バッファー中で室温 30 分間ブロッキングを行う異なる抗原を認識する異なる動物種由来一次抗体を同時に室温で分間反応させる 1 st HRP の導入どちらか一方の一次抗体に対する HRP 標識第二抗体と室温で 30 分間反応させるビオチン標識第二抗体と室温で分間反応させる SA-HRP と室温で 30 分間反応させる 1 st TSA 増幅水気を切ったのち蛍光チラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする HRP 不活化 1% 過酸化水素を含む PBS ph7.0 中で室温 15 分間インキュベーションするあるいは 0.01N HCl 中で室温 10 分間インキュベーションする 2 nd HRP の導入ビオチン標識第二抗体と室温で分間反応させる SA-HRP と室温で 30 分間反応させるもう一方の一次抗体に対する HRP 標識第二抗体と室温で 30 分間反応させる 2 nd TSA 増幅水気を切ったのち蛍光チラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする可視化蛍光退色防止剤入りの水性マウント剤などでマウントし蛍光顕微鏡で観察する TSA の蛍光ラインアップの中で感度の高い順は Cyanine 3, TMR, Fluorescein となります存在量が低いと予想される抗原に対してより感度の高い蛍光物質のチラミドを使うことをお勧めします 15/20

16 同じ動物種の一次抗体の場合 ( ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に限る ) Step 1. スライドの準備通常の固定や包埋方法で組織や細胞を準備する脱パラフィンや再水和処理を行う例えば 1) キシレン中で 10 分間 3 回 2) 100% エタノール中 5 分間 3) 95% エタノール中 5 分間 4) 70% エタノール中 2 分間精製水で洗浄し TBST 中で 2 分間維持する普段の検出でも TSA 増幅を行わないスライドと一次抗体やプローブを加えずに TSA 増幅を行うネガティブコントロールを常に置いて下さいバックグラウンドシグナルを下げるためオートクレーブ滅菌した精製水を用いてください 16/20

17 Step 2. 電子レンジによる加熱処理 10mM クエン酸水溶液 ph6.0 を満たしたプラスチック容器にスライドグラスを入れ電子レンジの出力を最高にして沸騰するまで加熱する ( 容器の底には紙タオルなどを敷いて置く ) 出力を 20% に落とし 15 分間連続加熱する途中でスライドが乾燥しないよう注意するレンジから取出し室温まで放冷する精製水で洗浄を 2 分間行いブロッキングに進む Step 3. ブロッキング TNB バッファーを添加し室温で分間あるいは +4 C でオーバーナイトインキュベーションを湿潤箱内で行う電子レンジの出力 20% 調整ができなければ秒ごとに最大出力で沸騰させることを繰り返して適した回数を決めて下さいこの処理は抗原賦活化と内因性ペルオキシダーゼの失活を行うものです抗原賦活化に用いる溶液や温度条件は抗原や抗体の組合せで異なりますので適した条件を選んでくださいまた内因性ペルオキシダーゼの失活は過酸化水素を用いる方法でも結構です TNB (TNT Blocking) Buffer 0.1M Tris-HCl, ph M NaCl 0.5% ブロッキング試薬 Step 4 から 6 までは IHC プロトコールと同じです Step 7. 電子レンジによる加熱処理 10mM クエン酸水溶液 ph6.0 を満たしたプラスチック容器にスライドグラスを入れ電子レンジの出力を最高にして沸騰するまで加熱する出力を 20% に落とし 15 分間連続加熱する室温まで放冷する精製水で洗浄を 2 分間行いブロッキングに進む市販の抗原賦活化溶液 DAKO Target Retrieval Solution, ph6.1 BioGenex Antigen Retrieval Citra Solution なども使用可能です 17/20

18 ISH 二重蛍光標識の検出フロー in situ ハイブリダイゼーションブロッキング 1 st HRP の導入内因性ペルオキシダーゼの不活化 ( 必要に応じて ) プレハイブリダイゼーション ( 必要に応じて ) プローブハイブリダイゼーション (DIG フルオレセインあるいはビオチン標識プローブを同時にハイブリダイゼーション ) 洗い (Stringency wash) TNB バッファー中で室温 30 分間インキュベーションする TNB バッファーで希釈した HRP 標識抗 DIG 抗体あるいは抗フルオレセイン抗体と室温で 30 分間インキュベーションする TNT バッファーで 5 分間 3 回洗浄する 1 st TSA 増幅余分な水分を除き蛍光チラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする HRP 不活化 2 nd HRP の導入 1% 過酸化水素を含む PBS ph 7.0( あるいは 0.01N HCl) を加え室温 10 分間インキュベーションする DIG あるいはフルオレセインプローブのどちらかとビオチンプローブの組合せの場合 TNB バッファーで希釈した SA-HRP と室温で 30 分間反応させる DIG とフルオレセインプローブの組合せで最初にフルオレセインプローブを検出した場合 TNB バッファーで希釈した HRP 標識抗 DIG 抗体と室温で 30 分間インキュベーションする 2 nd TSA 増幅余分な水分を除き蛍光チラミド反応液を加え室温で 3-10 分間インキュベーションする可視化蛍光退色防止剤入りの水性マウント剤などでマウントし蛍光顕微鏡で観察する Note: 1) DIG プローブとフルオレセインプローブを組み合わせた場合には一般には最初の TSA 増幅でフルオレセンプローブ検出を行うことを薦めますしかし発現レベルが明らかに低い対象にはシグナルが強い DIG プローブを使い最初に TSA 検出を行ってください 2) 0.1% H 2 O 2 / MeOH による HRP 不活化はフルオレセインには影響ありませんが Cyanine 系蛍光物質は影響を受けるという報告 10) がありますので最初に TSA Cyanine 3/5 を用いた検出の場合はは使わないでください 18/20

19 参考文献 1) Roth, K.A. Tyramide signal amplification strategies for fluorescence labeling [on line] 2) McNichol, A.M. & Richmond, J.A. Optimizing immunohistochemistry: antigen retrieval and signal amplification. Histopathology 32, (1998). 3) Loup F., Weinmann O., Yonekawa Y., Aguzzi A., Wieser H.G. & Fritschy J-M. A highly sensitive immunofluorescence procedure for analyzing the subcellular distribution of GABAA receptor subunits in the human brain. J. Histochem. Cytochem. 46, (1998). 4) Toda, Y., Kono, K., Abiru, H. Kokuryo, K. Endo, M., Yaegashi, H. & Fukumoto, M. Application of tyramide signal amplification system to immunohistochemistry: A potent method to localize antigens that are not detectable by ordinary method. Pathology International 49, (1999). 5) Evans, M. F. Aliesky, H.A. & Cooper, K. Optimization of biotinyl-tyramide-based in situ hybridization for sensitive background-free applications on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens. BMC Clinical Pathology 3, 1-17 (2003). 6) Liu, G., Amin, S. Okuhama, N. Liao, G. and Mingle, L.A. A quantitative evaluation of peroxidase inhibitors for tyramide signal amplification mediated cytochemistry and histochemistry. Histochemistry and Cell Biology. 126, (2006). 7) Tóth, Z.E. & Mezey, È Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. J. Histochem. Cytochem. 55, (2007). 8) TSA protocol for ISH. [on line] 9) Autofluorescence: Causes and Cures, Wright Cell Imaging Facility, University Health Network Research. [on line] 10) Brend, T & Holley, S.A. Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization. [on line] 19/20

20 関連製品 TSA Blocking Reagent 3 g FP1020 1x Amplification diluent 60 ml FP1052 Horseradish Peroxidase Reagents Anti-rabbit IgG (goat) HRP 1 ml NEF812001EA Anti-mouse IgG (goat) HRP 1 ml NEF822001EA Anti-mouse IgG (goat) HRP 100 µl NEF822E001EA Anti-DNP (rat IgG1)-HRP 150 µl FP1129 Anti-Fluorescein/ FAM (sheep)-hrp 2x250µL NEF710001EA Streptavidin-HRP 2x250µL NEL750001EA Anti-Digoxigenin (mouse IgG1κ) HRP Lyophylized. Biotin Conjugates 500 µl After rehydration with H 2 O NEF832001EA Anti-rabbit IgG (goat) biotin 0.5 mg NEF813001EA Anti-mouse IgG (goat) biotin 0.5 mg NEF823001EA Anti-human IgG (goat) biotin 0.5 mg NEF803001EA Anti-Digoxigenin (mouse IgG1κ) biotin, Lyophilized. Labeled Streptavidin 500 µl After rehydration with H 2 O NEF833001EA Streptavidin Fluorescein 1 ml NEL720001EA Streptavidin Texas Red 1 ml NEL721001EA Streptavidin Coumarin 1 ml NEL722001EA Streptavidin-HRP 2x250µL NEL750001EA Streptavidin-AP 2x250µL NEL751001EA Chromogens BCIP/NBT Substrate DAB Substrate For detection of Alkaline Phosphatase For detection of Horseradish Peroxidase NEL937001PK NEL938001EA Version 1.04 株式会社パーキンエルマージャパンライフサイエンス事業部神奈川県横浜市保土ヶ谷区神戸町 134 横浜ビジネスパークテクニカルセンター 4F Phone: Fax: Other company or product names used in this document are generally trademarks or registered trademarks of their respective holders. Copyright 2015 by PerkinElmer Japan Co., Ltd. 20/20

MANUAL TSA Research Reagents Caution: For Laboratory Use. A research chemical for research purposes only. TSA Biotin Systems Tyramide Signal Amplifica

MANUAL TSA Research Reagents Caution: For Laboratory Use. A research chemical for research purposes only. TSA Biotin Systems Tyramide Signal Amplification For in situ Hybridization and Immunohistochemistry