佐 々木裕 子 他 488 をELISA抗 患 者 血 清 は1/100 1/6,400,免 は25μg/lnl 800μg/ml濃 Tween20-1%牛 BSA)に 疫 グ ロブ リン製 剤 度 にPBS-0.05%, 二 抗 体 に は,ア ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 抗 ヒ トIgGヤ
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- ともみ うとだ
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1 Key words: Mycoplasma, ELISA, Serodiagnosis, Immunoblotting
2 佐 々木裕 子 他 488 をELISA抗 患 者 血 清 は1/100 1/6,400,免 は25μg/lnl 800μg/ml濃 Tween20-1%牛 BSA)に 疫 グ ロブ リン製 剤 度 にPBS-0.05%, 二 抗 体 に は,ア ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 抗 ヒ トIgGヤ ル カ リフォ 質 は0.1% 温 で45分 間 反 応 さ せ た.吸 光 度 の 測 定 はELISAAnalyzer(ETY-96,Toyo SokkiCO.,Ltd,Tokyo)に 行 っ た. 清 の 希 釈 列 と同 時 に免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 の 各 濃 度 液 を 測 定 し,製 μg/ml濃 し,そ 度 液 の 示 すELISA-OD値 剤25 を カ ッ ト値 と の 値 を示 す 最 大 の 希釈 倍 数 の 逆 数 を も っ て ELISA抗 体 価 と し た. 4.SDS-PAGEと イ ム ノ ブ ロ ッテ ィン グ M.celllysatesを40,000 gで60 分 間 遠 心 し,得 抗 体169,60,55お よ び41-kDa た,ELIsA抗 者 血 清 中 に,細 特異 ミン ドが 認 め られ 体 価1,600倍 胞 付 着 に 関 与 す るP1蛋 対 す る 抗 体 が,わ の健康 白(169 ず か で は あ る が 存 在 し, 近 い 過 去 にM.感 染 の あ った こ とが 示 唆 さ れ た. よ り405nmで 測 定 す る プ レ ー ト毎 に,血 体 の証 明 染 患 者 血 清 中 に はM.の KDa)に p-nitrophenylphosphate(sigmachemicalco., 用 い,室 niae感 た(Fig.1).ま ギ 血 清(ICNIm munobiologicals,lotno.e609),基 ム ノ ブ ロ ッ テ イ ン グ に よ る ヒ ト免 疫 グ ロ ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 中 な ら び に 財.pneumo- 血 清 ア ル ブ ミ ン(PBS-Tween- 2時 間 反 応 させ た.第 1.イ 果 ブ リ ン 製 剤 中 のM.pnemoniae抗 て 連 続 二 倍 希 釈 した もの を用 い 室 温 に て USA)を 結 原 と し,健 康 者 血 清 は1/100 1/800, 2.ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リン 製 剤 濃 度 と抗M.pneu- moniaeelisa吸 白濃度 との 関 係 ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 濃 度25μg/mlか μg/mlに ら800 お い て 製 剤 濃 度 とELISA-OD値 の あ い だ に 良 好 な 直 線 関 係 が 見 ら れ た(Fig.2).供 た10ロ ッ ト と も,同 た.そ こ で,25μg/ml濃 製 剤 のOD値 ら れ た 膜 画 分 を5μg/ml蛋 光(OD)値 試 し じ 条 件 下 で ほ ぼ 同 じ値 を 示 し 度 の ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン を カ ッ ト値 と し,そ の値 を示す被検 血 清 の 最 大 希 釈 倍 率 の 逆 数 を も っ てELISA抗 体 に な る よ うにsamplebuffer(0.0625MTris-HCI, 2%SDS,5%2-Mercaptoethanol,10%Glycerol,pH6.8)に 加 え,100 こ の 抗 原 を8.75%濃 を,Laemmli6)の Fig. 1 で3分 間 可 溶 化 し た. 度 ゲ ル に ウ ェル あ た り20μl 方 法 で 泳 動 し た.泳 動 後,Towbin ら7)の 方 法 で ゲ ル か ら ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 (HAWP314FO,Millipore)へ 転 写 し た.転 ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を1%ス 写 後, キ ム ミル ク/PBSに 2時 間 浸 し ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た.抗 体 と し て, ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤,M.感 剤 はIgG濃 度 を500μg/lnlと1,000μg/mlに,血 清 はPBS- て400倍 ス 膜 と 室 温 で1時 に 希 釈 し,ニ 間 反 応 さ せ た.PBSで antibodies proteins stained with coomassie brilliant blue, M. membrane proteins reacted with 3: healthy serum, 4: patient' serum of M. infection, 5: normal immunoglobulin product 500ug/ml, 6: normal immunoglobulin product 1,000ug/m1 染患 者 血 清 お よ び 健 康 者 血 清 を 用 い た.製 Tween-BSAに Anti-Mycoplamsa found in -normal immunoglobulin product by Western blotting Lane 1: marker, 2: M. membrane トロセ ル ロ ー 洗 浄 後, 二 次 抗 体 と し て ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 抗 ヒ トIgG ヤ ギ 抗 体(CappelLab.Lot#20434,USA)1,000 倍 希 釈 液(PBS-Tween-BSAに 室 温 で2時 間 反 応 さ せ た.PBSで て 希 釈)を 用 い, 洗 浄 後,基 質液 (0.5%4-Chloro-1-Naphthpl,0.75%H2O2,Citrate buffer,ph6.0)中 に て 発 色 さ せ た. 感 染 症 学雑 誌 第64巻 第4号
3 M. Fig. 2 ELISA munoglobulin Mycoplasma activity product of ( ELISA診 normal IgG) im- against 断 の コン トロー ル血 清 Fig. 4 Differences 489 in ELISA titers : sera from under : sera from more five years than old, 6 years ELISA of 115 healthy sera by age in years old titer lgg μg/ml) Table Fig. 3 Relationship between ELISA OD and ELISA titers of patients' sera diluted to 1/100 and 1/800 Mean of ELISA OD of M. patients' sera diluted to 1/100 (S), 1/800 (A) and normal immunoglobulin product ( IgG) (A). Each bar indicates the 95%confidence limits at the mean. 1 Comparison ND: of antibody by CF, ELISA titers not done 時 に 測 定 し た25 200μg/ml濃 度 の ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 の 平 均OD値 を 示 した.ヒ ブ リ ソ 製 剤 濃 度 とOD値 と の 間 に は 相 関 が あ り, 800倍 希 釈 血 清 のOD値 ト免 疫 グ ロ で 比 較 し た 場 合,25μg/m1 の ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 のOD値 ELISA抗 体 価 は800倍,同 titer 3,200倍 4.健 IgG抗 価 と し た. 3.ELISAOD値 に お け る患 者 血 清 の希 釈 倍 数 と ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 濃 度 と の 関 係 そ れ ぞ れ のELISA抗 800に 希 釈 し,そ 95%信 頼 限 界 をFig.3に 平成2年4月20日 び1/ 平 均OD値 示 し た.Fig.3に の は,同 <50 100μg/m1は 体 価 に 相 当 し た. 康 者 血 清 中 のM.-ELISA 体 価 の年 齢 別 比 較 健 康 者 血 清115例 niae-elisaigg抗 体 価 血 清 を1/100及 れ ら の 平 均ODと のEHSA抗 に匹 敵 す る 様 に25μg/ml<OD μg/miは1,600倍,50μg/ml<od< ELlSA for M. and IHA に つ い て 年 齢 別M, pneumo体 価 を 調 べ た.5歳 歳 以 上 の 年 齢 層 を 比 べ る と,被 以 下 で はM.-ELISAIgG抗 以 下 と6 検 血 清 の う ち5歳 体価 が 400倍 以 上 を 示 す も の は 存 在 し な か っ た が,6歳 以
4 1) Moule, J. H.& Gaul, E. O.: The specific IgM response to Mycoplasma infection: Interpretation and application to early diagno- Epid. Inf., 99: , sis. 2) Hirschberg, L., Krook, A., Pettersson, C. A.& Vikerfors, T.: Enzyne-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma specific immunoglobulin M. Eur. J. Clin. Mi- Infect. Dis., 7: , crobiol. 3) Pearce, J., Bettleheim, K.& Metcalfe, R.: Antibody levels to Mycoplasma in sera collected from healthy blood donors of Wellington New Zealand, during J. Hyg. Camb., 96: , ) Ralph, H. R., Michael, S. C., Milton, B. D., Robert, E. L., Robert, E. R.& Benjamin, H. S.: Anti- body levels in reduced/alkylated intravenous immune globulin. Am. J. Med., 76 (3A): 40-45, 1984.
5 5) Sasaki, T., Bonissol, C.& Stoiljkovic, B.: Cross-reactive antibodies to Mycoplasmas found in sera by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Microbiol. Immunol., 31 (6): , ) Laemmli, U. K.: Cleavage of structual proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: , ) Towbin, H., Staehlin, T.& Gordon, J.: Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 76: , ) Brunner, H.& Chanock, R. M.: A radioimmunoprecipitation test for detection of Mycoplasma antibody. P. S. E. B. M., 143: , ELISA Diagnosis for Mycoplasma Infection with Human Normal Immunoglobulin Products as Control Sera Department Yuko SASAKI & Tuguo SASAKI of Biologics Control, National Institute of Health Norio OKAZAKI Department of Bacteriology and Pathology, Kanagawa Prefectural Public Health Laboratories It was found that the normal immunoglobulin G product, prepared from pooled plasma of at least 1,000 normal donors, contained some specific IgG antibodies to Mycoplasma by Western blotting. M. -ELISA OD values increaed linearly from 25 to 800 in the concentration of the product, there were no differences in the M. -ELISA OD value of the products among lots. Then we used this product as control serum for measurement of IgG antibodies to M. in sera by ELISA and compared the results with those obtained by complement fixation (CF) and indirect hemadosorption (IHA) tests. ELISA titers determined by this method had a mutual relation with CF and IHA titers.
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