危機管理研修平成20年9月18日鼻に一吹き次世代ワクチン国立感染症研究所感染病理部長谷川秀樹インフルエンザウイルスの感染インフルエンザウイル電子顕微鏡写真直径約80nm (1nmは1mmの百万分の一 1

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えりかさどひら
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1 危機管理研修平成20年9月18日鼻に一吹き次世代ワクチン国立感染症研究所感染病理部長谷川秀樹インフルエンザウイルスの感染インフルエンザウイル電子顕微鏡写真直径約80nm (1nmは1mmの百万分の一 1

2 危機管理研修平成20年9月18日鼻に一吹き次世代ワクチン国立感染症研究所感染病理部長谷川秀樹インフルエンザウイルスの感染インフルエンザウイル電子顕微鏡写真直径約80nm (1nmは1mmの百万分の一 1

3 Influenza virus Influenza type : A, B, C Eight negative-strand viral RNA segments (PA,PB1,PB2,HA,NP,NA,M,NS) Surface antigen of type A virus: Hemagglutinin (HA) 1-16 Neuraminidase (NA) nm NA HA NA1 HA1 NA2 HA3 NA1 HA5 H1N1 H3N2 H5N1

4 インフルエンザ 1. インフルエンザウイルスによって引き起こされ鼻咽頭のど気管支などを標的臓器とし 3 日位の潜伏期の後に発症し通常約 1 週間で軽快する急性呼吸器感染症日本では毎年 11 月 ~4 月が流行期 2. 症状 : 突然の 38~39 を超える発熱頭痛関節痛筋肉痛等に加え鼻汁咽頭痛咳などの上気道炎症状がみられ全身倦怠感等の全身症状が強いのが特徴乳幼児高齢者基礎疾患をもつ人では気管支炎肺炎などを併発したり基礎疾患の悪化を招き最悪の場合は死に至る 3. 診断 : 迅速診断キットによって感染早期のウイルス抗原を検出可能確定診断は咽頭ぬぐい液うがい液鼻腔吸引液などからのウイルス分離や血液検査での抗体価の有意な上昇 ( 抗体陽転あるいは 4 倍以上の上昇 ) によってなされる

5 鼻粘膜で増殖し出芽するインフルエンザウイルス

6 インフルエンザウイルス感染の病理組織 NIID Dept. of Pathol.

7 インフルエンザウイルスの感染による免疫応答 1. 粘膜表面でのインターフェロンの分泌 2. 粘膜上への分泌型 IgA 抗体の産生 3. 血中の IgG 抗体の産生 4. 細胞障害性 T 細胞の誘導

8 インフルエンザウイルス感染時の粘膜免疫応答汎粘膜免疫機構 (Common mucosal Immune system) M 細胞分泌型 IgA 抗体特異的 IgA 抗体産生細胞が全身の粘膜に再分布する呼吸器だけでなく消化器泌尿生殖器の粘膜で特異的 IgA 抗体が分泌抗原提示細胞 IgA 産生細胞

9 現行の注射型インフルエンザワクチンの問題点インフルエンザウイルス感染後の発症重症化を予防できるが感染防御するものではないワクチン株と流行株が一致した時には有効であるが株が一致しない場合に効果が低いワクチン株決定から製造までに最低半年かかる新型インフルエンザのパンデミックにおいては流行株を予測する事は不可能である

10 次世代経鼻粘膜投与型ワクチンの目標感染阻止! 流行株がワクチン株とある程度一致しな場合にも交叉防御能 (cross-protection) がある予測不能な新型インフルエンザに対応できるプレパンデミックワクチンとして最適なワクチンである ( ただしヒトで安全に使えるアジュバントが必要である )

11 粘膜表面におけるインフルエンザウイルス感染防御感染分泌型 IgA 抗体 IgG Poly Ig 受容体 IgG 抗体産生細胞 IgA 抗体産生細胞

12 分泌型 IgA が交叉防御に与える影響 Asahi Y et.al. J. Med. Virol., 74: , 鼻腔内への分泌型 IgA 抗体が見られない交叉防御が見られない

13 経鼻インフルエンザワクチンは変異株に対しても防御効果がある皮下接種ワクチン流行ウイルス株痛い! ワクチン株血清中 IgG Saishin-igaku : vol.57 経鼻ワクチンワクチン株ぜんぜん痛くない! 粘膜上 IgA

低温馴化生ウイルスワクチン (FluMist) 2003 年米国で認可 (5~49 歳の健康なヒトに限る ) Death 50 40 30 20 10 適用外不活化ワクチンを用いて安全な経鼻ワクチンの開発を行っている

14 低温馴化生ウイルスワクチン (FluMist) 2003 年米国で認可 (5~49 歳の健康なヒトに限る ) Death 適用外不活化ワクチンを用いて安全な経鼻ワクチンの開発を行っている ( 全ての年齢層を対象 ) ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Age ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~

15 経鼻インフルエンザワクチンの開発

16 国立感染症研究所感染病理部における経鼻インフルエンザワクチン開発 1987 年感染研病理部細胞病理室長田村慎一 ; 部長倉田毅によるコレラアジュバント(CTB*) 併用経鼻インフルエンザワクチン開発研究開始 1989 年特許ワクチン製剤感染研と ( 社 ) 北里研究所の共同出願 1989 年最初の論文発表 (Protection against influenza virus infection by vaccine Inoculated intranasally with CTB. (Vaccine 6: ,1988)) *2002~2004 年スイスで大腸菌易熱性毒素をアジュバントとした経鼻ワクチンを接種した一部のヒトに顔面麻痺 (Bell s Palsy) が発症したため使用中止される新しい安全なアジュバントの開発開始 2002 年感染研感染病理部第二室長長谷川秀樹 ; 部長佐多徹太郎 : Poly I:C 併用経鼻インフルエンザワクチン ] 開発研究開始 2004 年特許粘膜免疫誘導アジュバントを含む新規ワクチン感染研と ( 財 ) 阪大微研の共同出願 2005 年最初の論文発表 (Synthetic double-stranded RNA [poly (I:C)]combined with mucosal vaccine protects against influenza virus infection.( J Virol 79, , 2005)) 2006 年 ~ 安全性の高いアジュバントであるAmpligen (Poly I:C 12 U 米国 Hem 社製 ) を併用した経鼻新型インフルエンザ (H5N1) ワクチンが, ワクチン株と異なる株の流行も予防する可能性が動物実験で示されプレパンデミックワクチン開発計画開始 2007 年 ~ 厚生労働科学研究費医療技術実用化総合研究事業開始 1988 年 ~2008 年 : 経鼻インフルエンザワクチンについて英文論文 62 報発表

17 経鼻ワクチン (intranasal vaccine) 不活化ワクチン単独では免疫応答を誘導できない経鼻ワクチンには免疫応答を増強させる物質が必要!

18 病原体認識機構 TLR (Toll-like receptor) リポタンパク ( 細菌 ) 一本鎖 RNA ( ウイルス ) CpGDNA ( 細菌ウイルス ) LPS ( 細菌 ) 二本鎖 RNA ( ウイルス ) TLR1 TLR7 TLR9 TLR4 TLR3 Myd88 IRAK TRIF NF-κB IRF-3 炎症性サイトカインの誘導 IFN-α/β の誘導

19 粘膜ワクチンアジュバントの歴史コレラトキシン (CT) 大腸菌易熱性毒素 (LT) CT/LT 併用経鼻ワクチンによりワクチン特異的な全身の IgG 応答だけではなく鼻粘膜上の IgA 抗体も誘導する 2000 年スイスで LT アジュバント併用の経鼻ワクチン治験ワクチンを受けたヒトの一部に顔面神経麻痺が生じたため毒素系アジュバントはヒトには用いられなくなった

20 新規粘膜ワクチンアジュバントの開発 1) Compliment C3d fused HA vaccine [ Watanabe I Hasegawa H et al. Vaccine 2003 Nov;7(31): ] 2) Chitin microparticles (CMP) [ Hasegawa H et al. J.Med.Virol Jan;75(1): ] 3) Surfclam microparticles (SMP) [ Ichinohe T, Hasegawa H. et al. J.Med.Virol May;23(7): ] 4) Synthetic double stranded RNA [poly(i:c)], Toll like receptor-3 ligand [ Ichinohe T, Hasegawa Het al. J Virol Mar;79(5): Asahi-Ozaki Yet.al. Microbes and Infection 2006 Oct;8(12-13): Ichinohe T et.al. Microbes and Infection 2007 Sep;9(11): Ichinohe T et.al. J Infect Dis Nov 1;196(9): ] 5) Alpha-galactosylceramide (a-galcer), NKT cell ligand (Mucosal Immunology in press)

21 Recognition of dsrna TLR independent TLR dependent MDA5 RIG-I IRF3, IRF7 TLR Type I IFNs IRF3, IRF7 Type I IFNs Fibroblasts, cdc plasmacytoid DC Kato et al. (2005) Immunity

22 実験スケジュール A/PR8 (H1N1) HA vaccine 1 μg (split-product virus vaccine) + Poly ( I:C ) 10 ~ 0.1 μg or CTB * 1 μg 10 μl PBS ( - ) CTB* : CTB containing a trace amount (0.1%) of holotoxin (CT) 1st 2nd A/PR8/34 (H1N1) virus challenge (1000 pfu) Balb/c mice 6-8 weeks old ( weeks ) Nasal wash Serum Lung wash 5 μl / Nasal cavity

23 Poly(I:C) 併用経鼻インフルエンザワクチン接種によりインフルエンザウイルスの感染を防御できる Vaccine Primary Secondary A/PR8P(I:C) A/PR8P(I:C) ( μg ) ( μg ) ( μg ) ( μg ) Anti-A/PR8 HA IgA in nasal wash ( ng / ml ) Anti-A/PR8 HA IgG in serum ( μg / ml ) A/PR8 virus titer in nasal wash ( PFU / ml ; 10 n ) < 1* < 1* < 1* < 1* < 1* * * * * : p < 0.05

24 Poly(I:C) 併用経鼻ワクチンは変異ウイルスに対しても効果的である ( 交叉防御効果 ) A. Nasal-restricted influenza model (challenged with A/PR8 virus) Vaccine Vaccine ( 1μg ) + Poly ( I:C ) 3μg A / PR8 ( H1N1 ) A / Beijing ( H1N1 ) A / Yamagata ( H1N1 ) A / Guizhou ( H3N2 ) B / Ibaraki B / Yamagata B / Aichi - Anti-A/PR8 HA IgA in nasal wash ( ng / ml ) Anti-A/PR8 HA IgG in serum ( μg / ml ) A/PR8 virus titer in nasal wash ( PFU / ml ; 10 n ) < 1* * : p < 0.05 < 1* < 1* * Neutralizing antibody titers to A/PR8 virus Nasal serum wash 1: B. Lethal lung influenza model (challenged with A/PR8 virus) Survival rate (%) days A/PR8 (H1N1) A/Yamagata (H1N1) A/Guizhou (H3N2) B/Ibaraki -

25 Poly(I:C) 併用経鼻ワクチン後のワクチン特異的な T 細胞応答 A [ 3 H]-TdR incorporation * * 10 μg/ml 1 μg/ml 0.1 μg/ml None T cells ( spleen ) B IFN-γ production ( pg / ml ) A/PR8 ( H1N1 ) * A/Yamagata ( H1N1 ) A/Guizhou ( H3N2 ) B / Ibaraki * : p < 0.05 APC + Antigen (A/PR8) IFN-γ 4 days 0.0 A/PR8 ( H1N1 ) A/Yamagata ( H1N1 ) A/Guizhou ( H3N2 ) B / Ibaraki

Relative increase in mrna level A Infection 50 40 30 20 10 0 * * 0 6 24 72 B Vaccine + Poly (I:C) 20 15 10 5 0 C Vaccine 20 * * * * * * 168 h ND 0 6 24 72 168 h * * TLR3 TLR7 TLR4 Nasopharyngeal

26 Relative increase in mrna level A Infection * * B Vaccine + Poly (I:C) C Vaccine 20 * * * * * * 168 h ND h * * TLR3 TLR7 TLR4 Nasopharyngeal associate lymphoid tissue NALT total RNAs Sensors of dsrna TLR3 (endosome) RIG-I (cytosol) MDA-5 (cytosol) ND h Vaccine with poly(i:c) mimics the state of viral infection Protective immune response!

27 Influenza vaccine + poly(i:c) Cytotoxic T cells TLR3 idc IFN-α/β mdc IL-12 Th0 IL-4 IFN-γ Th1 Th2 IgG IgA Antibody forming cells Innate immunity Acquired immunity

28 経鼻ワクチンの利点簡便で痛くない! 全身の粘膜へ分泌型 IgA 抗体の誘導感染自体を防ぐ交叉防御効果変異株に対して有効通常のインフルエンザだけでなく新型インフルエンザに対応針が必要なく安全医療廃棄物の減量

29 高病原性鳥インフルエンザウイルスワクチンへの応用

30 Affected areas with confirmed cases of H5N1 avian influenza since 2003, status as of (latest available update)

31 背景高病原性鳥インフルエンザウイルス (H5N1) ワクチンはヒトでの皮下接種において免疫応答が低いことが知られているウイルスのどの株がパンデミックを起こすのか予測することは難しく流行前にパンデミックワクチンを準備しておくことは困難である皮下接種ワクチンはワクチン株と流行ウイルス株が一致しないとワクチンの効果が期待できない感染部位が呼吸器だけでなく消化管への感染が報告されている

32 交叉防御能を有する分泌型 -IgA 抗体インフルエンザウイルス H5N1 変異ウイルスに対する防御が必要であるそのためには交叉防御能を有する分泌型 IgA 抗体を粘膜上に誘導する必要がある H5N1 (A/Hong Kong/483/97) H5N1 (A/Vietnam/1194/2004) Mucosal IgA H5N1 (unpredictable virus/ 20??)

33 PolyI:PolyC 12 U (Ampligen ) 合成二本鎖 RNA TLR3 ligand 慢性疲労症候群第 3 相臨床治験終了 (USA) > 75,000 dose (400 mg IV) I I I C C U 12 塩基に 1 塩基ミスマッチ Proc Natl Acad Sci U S A Feb 19;105(7): The adjuvant role of poly IC requires Toll-like receptor (TLR) 3 and melanoma differentiation-associated gene-5 (MDA5) receptors, but its analog poly IC12U requires only TLR3. I C

34 実験スケジュール全粒子不活化ワクチン 1μg : NIBRG14 (A/Vietnam/1194/2004) アジュバント 10μg : PolyI:PolyC 12 U (Ampligen ) A/Vietnam/1194/2004(H5N1) 経鼻皮下 1st 2nd A/Hong Kong/483/97(H5N1) A/Indonesia/6/2005(H5N1) ( weeks ) 1000PFU / 2μl

35 ベトナム株由来 H5N1ワクチンの感染防御効果 A. ベトナム株 / ウイルスがまったく感染していないワクチン株と同じウイルス株ワクチン株と異なるウイルス株ワクチン株と異なるウイルス株ウイルス価 (PFU/ml;10 n ) 無皮下経鼻鼻腔でのウイルス価 B. 香港株 / ウイルス価 (PFU/ml;10 n ) 0 無皮下経鼻鼻腔でのウイルス価 C. インドネシア株 /2005 ウイルス価 (PFU/ml;10 n ) 無皮下経鼻鼻腔でのウイルス価生存率 (%) 生存率 (%) 生存率 (%) 経鼻皮下無日日数経鼻皮下無皮下経鼻共に 100% 生存経鼻は 80% 生存皮下は 100% 死亡日日数経鼻皮下無日日数経鼻は 100% 生存皮下は 40% 生存

36 実験スケジュール 05/06 シーズンインフルエンザ HA ワクチン 1μg : A/New Caledonia (H1N1) A/NewYork (H3N2) B/Shanghai アジュバント 10μg : dsrna 経鼻皮下 1st 2nd 3rd A/Vietnam/1194/2004(H5N1) A/Hong Kong/483/97(H5N1) A/Indonesia/6/2005(H5N1) ( weeks ) 1000PFU / 2μl

37 2005/2006 年シーズナルインフルエンザワクチンによる抗体応答 Trivalent vaccine ( μg ) Vaccine dsrna ( μg ) Route Vaccine-specific IgA in nasal wash ( Abs. at 405 nm ) Vaccine-specific IgG in serum ( Abs. at 405 nm ) i.n. * * * * ** 1 - i.n i.n s.c. * ** 1 - s.c. * * * - 10 s.c A/New Caledonia (H1N1) A/New York (H3N2) B/Shanghai

38 2005/2006 年シーズナルインフルエンザワクチンによる A高病原性鳥インフルエンザウイルスH5N1の感染防御 A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) B C Virus titer (PFU/ml;10 n ) Virus titer (PFU/ml;10 n ) Virus titer (PFU/ml;10 n ) Naive Naive * * Trivalent vaccine (s.c.) Trivalent vaccine (s.c.) Trivalent vaccine (i.n.) A/HongKong/483/97 (H5N1) Trivalent vaccine (i.n.) A/Indonesia/6/2005 (H5N1) * * Naive Trivalent vaccine (s.c.) Trivalent vaccine (i.n.) Survival rate (%) Survival rate (%) Survival rate (%) Days after VN/1194/04 infection Intranasal Subcutaneous Control Intranasal Subcutaneous Control Days after HK/483/97 infection Intranasal Subcutaneous Control Days after Indonesia/6/05 infection

39 まとめ経鼻インフルエンザワクチンにより注射型ワクチンでは誘導されない分泌型のIgA 抗体が誘導される分泌型 IgA 抗体は感染前にウイルスと反応し感染自体を防ぐ分泌型 IgA 抗体には交叉防御能 (cross protection) があり変異株に対しても有効である経鼻インフルエンザワクチンにより誘導される粘膜免疫は汎粘膜免疫機構 (common mucosal immune system) により全身の粘膜を防御する高病原性鳥インフルエンザH5N1に対する経鼻インフルエンザワクチンはCladeの異なる株に対しても有効であり流行株の予測が不可能なプレパンデミックワクチンとして最適なワクチンである

41 社会的に注目され実用化が待たれている! 読売新聞朝刊平成 20 年 1 月 13 日読売新聞夕刊平成 19 年 6 月 30 日

42 Acknowledgement 国立感染症研究所感染病理部一戸猛史相内章川口晶神戸光彦永田典代岩田奈緒子原嶋綾田村慎一佐多徹太郎倉田毅ウイルス第 3 部田代眞人小田切孝人板村繁之二宮愛今井正樹動物管理室網康至須崎百合子

Research 2 Vol.81, No.12013

2 5 22 25 4 8 8 9 9 9 10 10 11 12 14 14 15 7 18 16 18 19 20 21 16 17 17 28 19 21 1 Research 2 Vol.81, No.12013 Vol.81, No.12013 3 P r o d u c t s 4 Vol.81, No.12013 Research Vol.81, No.12013 5 6 Vol.81,

危機管理研修 平成20年9月18日 鼻に一吹き次世代ワクチン 国立感染症研究所感染病理部 長谷川 秀樹 インフルエンザウイルスの感染 インフルエンザウイル電子顕微鏡写真 直径約80nm (1nmは1mmの百万分の一 1

危機管理研修平成20年9月18日鼻に一吹き次世代ワクチン国立感染症研究所感染病理部長谷川秀樹インフルエンザウイルスの感染インフルエンザウイル電子顕微鏡写真直径約80nm (1nmは1mmの百万分の一 1