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1 Dual-Luciferase Reporter(DLR ) レポーター遺伝子アッセイ Spark マルチ検出モードプレートリーダーによる発光測定

2 2 緒言 レポーター遺伝子アッセイ近年 レポーター遺伝子を用いたシステムが 真核細胞 原核細胞を問わず 遺伝子発現 遺伝子調節 細胞応答を研究 理解するのに大きな影響を及ぼしている レポーター遺伝子システムは プロモーターまたは調査したい遺伝子配列にレポーター遺伝子を接続したものが 発現ベクターに組み入れられている レポータータンパク質の発現は タンパク質そのものを測定することによっても タンパク質の酵素活性を測定することによっても明らかにすることが可能である 酵素を測定するほうが 反応生成物を生成するのに必要なレポーター酵素の量がごくわずかでよいことから きわめて感度が高い 感度が高く 測定が容易であることから さまざまな生物から採取したルシフェラーゼ酵素が レポーターシステムに普通に用いられるようになってきている 測定原理 Promega Corp. の Dual-Luciferase Reporter Assay System は 2 種類のルシフェラーゼ活性を測定することに基づいている レポーターの一方を 実験の目的となる反応を測定するのに使用する 通常 このレポーターを 実験用 レポーターと呼んでいる もう一方のレポーターを内部コントロールとして用い 実験用レポーターのデータを補正するのに用いられる ホタル (Photinus pyralis) からとったホタルルシフェラーゼは 61 kda の一量体酵素であり ルシフェリンの酸化を触媒して約 560 nm の光を放出する ウミシイタケ (Renilla reniformis) からとった同じく一量体で分子量が小さい Renilla luciferase(31 kda) は セレンテラジンを酸化して約 480 nm の光を放出する 実験の組立て方によって ホタルルシフェラーゼかウミシイタケルシフェラーゼのどちらを実験レポーター コントロールレポーターに用いてもよい カブトムシルシフェリン セレンテラジン 図 1: ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの反応 デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイでは ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を連続して測定する そうするにはまず サンプル細胞ライセートの入ったウェルに 個々のマイクロウェルプレートを分析したホタルルシフェラーゼ試薬 (LAR II)100 l を分注する 10 秒間の発光測定ののち Stop& Glo 試薬 100 l を分注する この試薬は最初の反応を停止 ( 消光 ) させると同時に ウミシイタケルシフェラーゼ反応の基質を供給する ふたたび 10 秒間の発光測定を行う 本テクニカルノートでは Tecan の次世代型ハイエンドマルチ検出モードリーダー Spark を使用した Dual-Luciferase Reporter Assay System の導入について説明する 同システムは 8 桁以上のダイナミックレンジを備えた高感度発光測定 ( フラッシュ & グロー ) が可能である また改良型発光モジュールにより 最大 5 種類のルシフェラーゼを用いたマルチカラーアッセイの測定が可能である他 ( 発光タンパク質などの ) スペクトルスキャン機能も備えている (1) 材料及び方法 組換えホタルルシフェラーゼ ウミシイタケルシフェラーゼ オキシルシフェリン セレンテラミド +AMP+PP1+CO2+ 光 CO2+ 光 Spark マルチ検出モードリーダー (Tecan オーストリア) 96 ウェル平底白色ポリスチロールマイクロプレート (Greiner Bio-One ドイツ) Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega ドイツ) ウミシイタケルシフェラーゼ ( 組換え ) (LUX Biotechnology 英国) QuantiLum Recombinant Luciferase (Promega ドイツ)

3 3 試薬の調製製造業者の説明書に従い ルシフェラーゼアッセイ試薬 II(LAR II) Dual-Glo Stop & Glo 試薬および受動溶解緩衝液 (1 x PLB) を調製した (2) 1 x PLB を用いて ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ保存溶液 (~1 mg/ml タンパク質濃度 ) を調製した 保存溶液から 1 x PLB を用いて各ルシフェラーゼ希釈液 (~800 万カウント ) を調製した 必要に応じ 1 x PLB を用いて希釈液をさらに希釈した インジェクター A に LAR II を充填し インジェクター B に Stop & Glo 試薬を充填した マイクロプレートからの自然燐光を抑えるため 製造業者の説明書に従い アッセイの実施前に リーダー内に 10 分間プレートを設置した (3) チューブへの吸着 : 試薬がインジェクターチューブ内面に吸着していないことを確認するため ピペットを使用し 組換えホタルルシフェラーゼのウミシイタケルシフェラーゼ (1:50) 希釈液 (20 µl) を 96 ウェルマイクロプレートの 1 列 (12 ウェル ) に注入した プレートをリーダー内に設置し 表 1 の手順を用いて測定を開始した ( 測定値 1) 10 分後 再びピペットを使用して各希釈液をプレートの別の列 (12 ウェル ) に注入し 上記と同じ手順で測定した ( 測定値 2) 次に式 1 を用いて 2 回の測定におけるルシフェラーゼ活性を計算した 活性 (%) = 測定値 2/ 測定値 式 1: 活性の計算 活性 (%) ルシフェラーゼ活性 測定値 1 初回の測定値 測定値 2 2 回目の測定値 (10 分間の培養後 ) 消光ピペットを使用して PLB(20 µl) をマイクロプレートの A 列のウェルに注入し ブランク試料とした 次にピペットを使用して 組換えホタルルシフェラーゼ (20 µl) を D 列および G 列 (24 ウェル毎 ) に注入した 表 1 のパラメータを用いてプレートを測定し 消光速度を求めた 式 2 を用いて消光を計算した 消光 = シグナル FF/ シグナル REN 式 2: 消光速度の計算 シグナル FF LAR II 注入後に測定した発光 シグナル REN Stop & Glo 注入後に測定した発光 一致度ウミシイタケルシフェラーゼを用いて組換えホタルルシフェラーゼを希釈し モル比を 1:50 および 50:1 とした この 2 種類の条件について ピペットを使用して各々の酵素希釈液 (20 µl) をマイクロプレートの 2 列 (24 ウェル ) に注入した 表 1 の手順を用いてプレートを測定し 各ルシフェラーゼに関する発光シグナルの一致度を求めた 式 3 を用いて一致度を計算した %CV = 標準偏差 / 平均値 100 式 3: 一致度の計算 %CV 相対変動係数標準偏差シグナルの標準偏差平均値平均シグナル ( カウント / 秒 ) 測定パラメータ表 1 に示すパラメータを用いて 発光スキャン測定を実施した 測定パラメータ プレート モード 装置の設定 Greiner96fw 発光ウェルモード 注入インジェクター A: 体積 100 µl LAR II 200 µl/ 秒 注入後に再充填待機 3 秒 測定 減衰 積分時間 待機時間 出力 発光測定 自動 10,000 ミリ秒 0 ミリ秒 カウント / 秒 注入 インジェクター B: 体積 100 µl Stop & Glo 200 µl/ 秒 注入後に 再充填 待機 3 秒 測定 発光測定 減衰 自動 積分時間 10,000 ミリ秒 待機時間 0 ミリ秒 出力 カウント / 秒 表 1: DLR 測定時の装置の設定

4 4 結果 チューブへの吸着インジェクターチューブ内で DLR 試薬を 10 分間培養した後 ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を計算した 10 分間の培養後の活性は いずれのルシフェラーゼでも 95% 以上を維持しており したがってチューブへの試薬の吸着は観察されなかった ( 表 2) FF 値 REN 値 平均値 標準偏差 平均値 標準偏差 測定値 1 8,019, , ,715 5,704 測定値 2 (10 分後 ) 7,878,739 50, ,234 1,535 活性 (%) 表 2: DLR 測定時の装置の設定 消光 Stop & Glo 試薬の注入後 ホタルルシフェラーゼのシグナルは 10,000 分の 1 以下に減少し ウミシイタケルシフェラーゼの発光のみが観察された 本実験では 試験対象の全てのウェルのシグナルが平均で 100,000 にまで (1.4 x 10 5 ) 減少した ( 図 2) 一致度 2 種類のルシフェラーゼ反応測定の一致度を明らかにするため 濃度の異なる酵素に対する試験を実施した 図 3 に 異なるモル比 ( それぞれ 1:50 および 50:1) で混合し 連続して測定したホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの発光出力をまとめたグラフを示す 2 種類の酵素の発光出力の干渉は観察されなかった さらに 24 個のウェルで測定したシグナルは一致し その相対変動係数 (%CV) は 1.3% から 2.1% の間であることが明らかになった 発光 ( カウント / 秒 ) ウェル 図 3: ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼのシグナルの非依存性 ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼを混合し モル比をそれぞれ 1:50 および 50:1 とし 発光 ( カウント / 秒 ) を測定した 発光 ( カウント / 秒 ) 消光後消光前 結論 このテクニカルノートでは Tecan Spark マルチ検出モードマイクロプレートリーダーで Promega Dual Luciferase Reporter Assay を実施すると 良好な性能を発揮することを示している インジェクターモジュールや測定の均一性などのアッセイを行うために必要な機能は Spark ですぐに利用できる ウェル / レプリケート 図 2: 消光実験から得られたデータの例 Stop & Glo 試薬 (100 µl) の添加後 ホタルルシフェラーゼ反応が抑制された ルシフェラーゼ反応も 多くの酵素反応と同じく 温度依存性である このため 機器を反応温度に 30 分以上馴化することが望ましい Spark の温度調製機能で アッセイ中は機器内の温度を均一にすることができる また 冷却モジュールにより測定中の温度変化を安定化することも出来る

5 5 ルシフェラーゼアッセイの感度が高いため 機器を適切に管理することが欠かせない Dual Luciferase Reporter Assay を実施する前に 試薬の希釈や汚染を予防するため インジェクターを入念に洗浄する必要がある アッセイの試薬をインジェクターに満たす前に チューブ内の液体をすべて backflush オプションで除去するとよい アッセイ終了後 インジェクターとチューブを まず蒸留水 次に 70% エタノールに 30 分間 そして再び蒸留水で浸漬してきれいにする こうすることによって プラスチックの種類によって可逆吸着を起こす Stop&Glo 試薬を効果的に除去することができる マイクロプレートは 素材によって自家発光が大きいものがある このため 実験開始前に マイクロプレートの自己発光をテストしておく必要がある 一般的に 白色アッセイプレートは自家発光を減衰するためにリーダー内部で平衡時間を与えられるべきある 謝辞 有益なアドバイスと 多大なご協力をいただいた Promega Corp. の Tracy Worzella および Amy Landreman 氏に感謝いたします 略語の一覧 CV 変動係数 DLR Dual Luciferase Reporter FF ホタルルシフェラーゼ REN ウミシイタケルシフェラーゼ LAR II ルシフェラーゼアッセイ試薬 II PLB 受動溶解緩衝液 REN/PR Renilla reniformis ルシェラーゼ StDev 標準偏差 参考文献 1) Spark Brochure. Tecan V. 1.0, ) Dual-Luciferase Reporter Assay System, Instructions for use (Promega Corp., MA) このアプリケーションノートは Tecan ( 本社スイス ) が発行 ( 原文 英語 ) し テカンジャパンが日本語翻訳したものです 翻訳文の表現等に疑義が生じた場合は 原文をご参照ください Australia Austria Belgium China Denmark France Germany Italy Japan Netherlands Singapore Spain Sweden Switzerland UK USA Other countries Tecan Group Ltd. では本文書において正確かつ最新の情報をご提供するよう最善の努力を尽くしておりますが 誤謬や脱漏が生じる可能性があります したがって Tecan Group Ltd. では明示的または暗示的にかかわらず 本文書における情報の正確性または完全性につき 何らの表明または保証を行うものではありません また 本文書は予告なく変更する場合があります 記載された商標はすべて法律で保護されています 本文書に記載された仕様書の技術的詳細および詳しい手順については テカンの担当者までご連絡ください 本文書で取り上げたアプリケーションおよび製品は一部の市場で入手困難な場合がありますので 営業担当者にお問い合わせください 記載された商標はすべて法律で保護されています 本文書に記載された商標とデザインは Tecan Group Ltd.( スイス Männedorf) の商標または登録商標です 完全なリストは で参照できます リストには含まれませんが ここに記載されている製品名および会社名はそれぞれの所有者の商標である場合があります Tecan および Infinite は Tecan Group Ltd.( スイス Männedorf) の登録商標です Spark は同商標です Spark は研究用途向けです 診断用途ではご使用いただけません 2017 Tecan Trading AG スイス著作権所有免責事項と商標については をご覧ください J V

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