シーケンサー利用技術講習会第10回サンプルQC、RNAseqライブラリー作製/データ解析実習講習会

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まれあひらみね
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1 シーケンサー利用技術講習会第 10 回サンプル QC RNAseq ライブラリー作製 / データ解析実習講習会理化学研究所ライフサイエンス技術基盤研究センターゲノムネットワーク解析支援施設田上道平

2 次世代シーケンサー Sequencer File Format Output(Max) Read length Illumina Hiseq2500 Fastq 600 Gb 100 bp Life tech SOLiD csfasta,qual 100 Gb 50 bp Roche FLX Sff 600 Mb 800 bp

3 Hiseq 2500/1500

4 Fastq 1:N:0: TAAATGGTAGGGAAAGAGTGTAGGGAAAGAGTGTAAGGAATAGCGTCGTGTTGGGTAAGAGTGAAAGGGGTGTGGCTTTTAGTCATAGCTGTTTCCTGCTG + 1:N:0: ATTTTTTGTGGATGTATAGTTTATTTGTTGTGTTGGATTTGTTAGGATTTTAAGTTTTTTGAGTATAATAGAGTTTAAAGATAAAAAGATTATTTTTTGTA + TAAATGG. ( シーケンスで読まれた配列 ) + CCCFFFF ( クオリティースコア )

5 Quality Check for fastq data ソフトウェア FastQC stqc/ FASTX html#fastx_barcode_splitter_usage

6 FastQC 1 枚の HTML に複数の結果がまとめられ出力される豆知識 : --nogroup オプションで実行すると 1 ベース毎の結果が表示される

7 FASTX 各項目ごとに解析を行う Galaxy に入っている場合が多い豆知識 : CASAVA1.8 以降では Q33 オプションで実行する

8 ときどきある質問 Index やバーコードなどの特徴的な配列のサイクルのクオリティーが下がる事がある Illumina シーケンサーは同じサイクルで同じ塩基を多数読むとエラー率が高くなる

9 RNA-Seq 解析についてアダプター Trimming ( 必要なら ) rrna filtering マッピング定量化比較解析 (De novo assembly)

10 rrna filtering についてライブラリー作成時に取り除けなかった rrna のリードを除去する rrna 配列に対して Mapping を行い Unmapped のリードを取りだす samtools view f 4 *.bam Mouse rrna Reference : BK Human rrna Reference : U

11 rrna removal library kit

12 ライブラリー作成時に rrna が良く取り除けた例と, 悪い結果の例 2 mapped reads unmapped reads rrna reads 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

13 悪い例の結果が出た場合ライブラリー作成マニュアルプロトコルを見直すライブラリー再作成再シーケンス

14 アダプター Trimming ソフトウェア FASTX fastx_clipper html#fastx_clipper_usage 豆知識 : CASAVA1.8 以降では Q33 オプションで実行する Cutadapt

15 アダプター Trimming ( 例 ) Trimming 前の, 50 サイクル Fastq データ Trimming 後の Fastq データの Length Distribution

16 Mapping for RNA-Seq TopHat2

17 Mapping の違い Bwa Tophat

18 Tophat による mapping ( 例 )

19 定量 ( マップされたリードの数から normalize して値を算出 ) Gene A Gene B Gene C Gene Mapped Read count exon size A Total mapped read count RPM (read per Million) 40 (=400*1,000,000/10,00 0,000) RPKM(RP M per kilo exon) B ,000, C

20 cufflinks Cufflinks アノテーション情報とマッピング結果より FPKM を算出

21 定量比較の問題 RPKM(FPKM) は遺伝子 (exon size) の大きさや高発現遺伝子の影響により結果がばらつく TMM ( Trimmed Mean of M-values) による正規化

22 R による比較解析 DESeq edger

23 R による解析良いところ Normalize 正規化比較解析までパッケージ化されている正規化される事によりバイアスの少ない結果が出る少しめんどくさいところ R の使い方を覚える BAM からタグカウントの情報を作成する Samtools HTSeq などを使用する

RNA-Seq 解析例登録データサンプル Library - Sequence SRR064437 SRR064286 正常ヒト胸腺由来 cdna の RNA-seq データヒト MCF-7 breast cancer cell line 由来の RNA-seq データ Non directional

24 RNA-Seq 解析例登録データサンプル Library - Sequence SRR SRR 正常ヒト胸腺由来 cdna の RNA-seq データヒト MCF-7 breast cancer cell line 由来の RNA-seq データ Non directional RNA-Seq Paired End Sequence Non directional RNA-Seq Paired End Sequence SRA : DRA :

25 RNA-Seq 解析例 (workflow) Quality Check for fastq data Trimming low quality data rrna filtering Tophat mapping Tag counts DESeq

26 Mapping workflow with moirai

27 Summary for mapping SRR mapped unmapped unmatch rrna SRR ,000,000 10,000,000

28 Tag count (HTSeq) Mapping 結果の BAM を samtools で SAM ファイルに変換 samtools sort SRR bam SRR064437_sorted samtools view SRR064437_sorted.bam > SRR064437_sorted.sam HTSeq によりタグカウント htseq-count SRR064437_sorted.sam gencode.v18.annotation.gtf > SRR064437_tag-count.txt HTSeq 使用したアノテーションファイル gencode.v18.annotation.gtf

29 Tag count の結果 (HTSeq) 1 カラム目 : EnsID 2 カラム目 : 正常ヒトのタグカウント 3 カラム目 : MCF-7 breast cancer cell line タグカウント

30 DESeq output pvalue でソートして正常ヒトに対して breast cancer で Up-regulated された遺伝子 Up-regulated TOP1 : DSCAM-AS1 TOP2 : TFF1 TOP3 : BRIP1

31 TFF1 Deficiency in trefoil factor 1 (TFF1) increases tumorigenicity of human breast cancer cells and mammary tumor development in TFF1-knockout mice

32 IGV genome viewer breast cancer~ の Mapping 結果正常ヒト ~ の Mapping 結果

33 おまけ Moirai 面倒な作業を効率化 GUIでの操作クラスターサーバへの対応オリジナルワークフロー作成可能 Galaxyとちがうの? もうそろそろ公開されるはず

34 RNA-Seq Tools Seq_bioinformatics_tools

35 ありがとうございました

PowerPoint プレゼンテーション

PowerPoint プレゼンテーション V1 次世代シークエンサ実習 II 本講義の内容 Reseq 解析 RNA-seq 解析公開データ取得クオリティコントロールマッピング変異検出公開データ取得クオリティコントロールマッピング発現定量 FPKM を算出します 2 R N A - s e q とはメッセンジャー RNA(mRNA) をキャプチャして次世代シーケンサーでシーケンシングする手法リファレンスがある生物種の場合

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