第 10 回シーケンス講習会 RNA-seq library 調製法の特徴と選び方理化学研究所 (RIKEN) ライフサイエンス技術基盤研究センター (CLST) 機能性ゲノム解析部門 (DGT) ゲノムネットワーク解析支援施設 (GeNAS) 野間将平

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なごみあいきょう
5 years ago
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1 第 10 回シーケンス講習会 RNA-seq library 調製法の特徴と選び方理化学研究所 (RIKEN) ライフサイエンス技術基盤研究センター (CLST) 機能性ゲノム解析部門 (DGT) ゲノムネットワーク解析支援施設 (GeNAS) 野間将平

2 l シーケンスをする目的は? 概略 l よいシーケンスライブラリーとは? RNA-seq ライブラリーのムリムダムラ l いろいろな RNA-seq ライブラリーの特徴性能比較実験の結果から

3 RNA シーケンスをする目的 l RNA を研究することで分かること RNA-seq は細胞組織の今の状態を知る l ライブラリー作製シーケンスは解明のための通過点 ( 一手段 ) RNA 抽出が完了した時点で結果は出ているそこからいかに情報を失わずシーケンスに持ち込むか

4 減らしたい RNA シーケンスのムリムダムラ l ムリ RNA が本来持っていた情報が正確に反映されていない状態結果にバイアスがかかった状態 RNA の品質サンプル量 l ムダ RNA の持つ情報は極力失いたくない l ムラとはいえ Total RNA をそのままシーケンスするとほとんど (9 割 ) が rrna 現行のシーケンサー能力やコストを考慮すると rrna を効率的に除去する必要がある Oligo dt Beads RiboZero (Epicentre/Illumina) GeneRead rrna Depletion Kit (QIAGEN) etc PCR 条件の最適化 PCR duplicate の割合を減らす結果が再現しないサンプリング RNA の品質実験環境手技

5 Stranded RNA-seq 手法比較 l 評価対象 TruSeq Stranded RNA (Illumina) ScritSeq v2 (Epicentre) RNA ligase base method (GeNAS) l Human Brain total RNA 1ug を使用して各手法 n=3 で library 調製 l rrna 除去には RiboZero Gold を使用 Non-cording RNA も含まれる l 3mix ibrary / lane で HiSeq PE でシーケンス l Genomic Work Bench (CLC Bio) で解析

6 TruSeq Stranded RNA Sample prep cdna synthesis /Ligate adapter / PCR amplification 5 UUA U 3 3 AAT A 5 1st strand cdna synthesis with random hexamer RNA First strand cdna 5 3 AAT A 3 1st strand cdna UUA U 5 2nd strand cdna 2nd cdna synthesis with random hexamer Incorporates dutp instead of dttp 5 3 AAT UUA A U End repair, adenilafon Adapter ligafon AAT A 3 Pol UUA Pol U Amplify with High- fidelity Taq Strand selecfve amplificafon Total 2day

7 ScriptSeq v2 Total 1day h7p:// ls.com/products/scriptseq_v2_rna_seq_library_preparafon_kit/

8 RNA ligase base method AAAAAAAA AAAAAAAA Poly(A )RNA selecfon or rrna removal Random fragmentafon by sonicafon P AAAAAAAA Phosphatase treatment and PolynucleoFde Kinase treatment Pre- adenylated 3 linker ligafon P App 5 linker ligafon P Reverse transcripfon reacfon RT primer PCR and size selecfon (AMPure beads) Total 3day Sequencing by Illumina GAIIx, HiSeq2000, HiSeq2500

9 再現性 Technical replica r=0.99 r=0.99 r=0.99 TruSeq stranded Epicentre GeNAS RNA ligase base hg19 refseq に mapping して RPKM 算出 Log10(1+RPKM) でプロット各手法とも再現性は高レベル

10 手法間での発現量相関 TruSeq stranded R=0.98 RNA ligase base ScriptSeq R=0.92 ScriptSeq R=0.95 RNA ligase base TruSeq stranded 異なる調製法のライブラリーを単純比較するのは危険

11 Strand Specificity TruSeq RNA Non-stranded 53.03% TruSeq RNA stranded 98.74% ScriptSeq v % RNA ligase base 99.96% l l l l Read1 のFastq をCLC Genomics Workbench 6.0.2にimport hg19, ERCC ref seq にmapping PCR duplicateを除去 ERCCに対するreadの方向を比較

12 Coverage evenness A B C A B A:RNA ligase base B:TruSeq Stranded C:ScriptSeq C TruSeq Stranded が安定して全体をカバーできている他は coverage に偏りあり Replicate 間で偏り傾向は一致していたので手法に依存したバイアスがある推測される Coverage スケールはそれぞれ異なる

13 検出遺伝子数 TruSeq Stranded (17165) RNA ligase base (17093) ScriptSeq (16245) 365 Triplicate で RPKM 1< 示したものをカウント

14 40000 Number of gene detected 検出遺伝子数 RNA ligase base TruSeq Stranded ScriptSeq v2 GeNAS Ilum ina Epicentre E-03 1.E-02 1.E-01 1.E+00 1.E+01 1.E+02 RPKM 一定の RPKM 以上で検出された遺伝指数 14

15 ERCC による定量性の検証 10 RPKM ERC C RPKM GeNAS RPKM Illum ina RPKM EpicentreRPKM E+00 理論値 1.000E+01 Read count 10 未満を外れ値として除外してプロット RPKM で取ったスピアマン相関係数 RNA ligase base : 0.90 TruSeq Stranded : 0.94 ScriptSeq v2 : 0.91

16 l 手法毎に得手不得手はある手法間の相対比較現時点で TruSeq Stranded が相対的に優れている点が多い手法名 Illumina (TruSeq Stranded) Epicentre (ScriptSeq v2) GeNAS (RNA ligase base) 必要サンプル量 ug 0.1-1ug 1ug コスト 48 反応 /kit 6 反応 /kit 試薬を個別に用意する必要あり操作性 2day 1day 3day 再現性 R=0.99 R=0.99 R=0.99 Strand Specificity Coverage evenness 定量性極めて優れる優れる普通 Agilent, NuGEN などからもStrand specificな RNA-seq library prep kit は販売されている

NGS_KAPA RNA HyperPrep Kit

NGS_KAPA RNA HyperPrep Kit シークエンシングワークフローライブラリー調製サンプル調製末端修復エンドポイントライブラリー増幅 A-TAILING アダプターライゲーションサイズセレクション & サイズ確認またはリアルタイムライブラリー増幅ライブラリー定量クラスター増幅 KAPA RNA HyperPrep Kit illumina社用ライブラリー調製キット KAPA RNA HyperPrep Kit

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