(Microsoft Word - FlowPRA\220\335\222\350ADC.docx)

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ためひとおえづか
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1 Navios における FlowPRA プロトコルの自動感度設定設定に必要な試薬機器類 1.) プロトコルの動感度設定には以下のベックマンコールター社製の試薬が必要です製品番号製品名内容定価 QuickComp 2 キット CD45-FITC/CD45-PE 各 1 ml(50 テスト ) 32, CYTO-COMP Cell キット 10 テスト 5 バイアル 38,000 A63492 FlowSet Pro 10 ml 3 バイアル 37,000 その他に PBS を使用しますプロトコル感度設定確認微調整のために以下の 2 検体サンプルが必要となります FlowPRA Screening のネガティブ血清を検体とした測定サンプル FlowPRA Screening の Class I ポジティブ血清を検体とした測定サンプル 2.) その他プロトコル感度設定に必要なサンプルの作成に以下もご意くださいピペット類 (20, 100, 1000 µl の分取をいます ) ボルテックスミキサーフローサイト測定用サンプルチューブ 3 本上記 FlowPRA Screening サンプル調製のための必要な試薬等

2 設定に使用するサンプルの調製 1.) フローサイト測定用サンプルチューブ 3 本の識別が可能になるようにそれぞれのチューブに A, B, C とラベルします 2.) FlowSet Pro のバイアルをよく転倒混和し A のサンプルチューブに 15 滴入れます 3.) CYTO-COMP Cell キットのいキャップのバイアルの溶液 1 ml を赤いキャップのバイアルに添加し沈殿物がしっかり拡散するようによく撹拌します 4.) 上記 3 で作成した懸濁液を B および C のサンプルチューブに 100 µl 添加します 5.) Quickcomp 2 キットの CD45-FITC を B へ CD45-PE を C のサンプルチューブに 20 µl を添加しよく撹拌した後に暗所室温にて 20 分間インキュベートします 6.) B および C のサンプルチューブに PBS を 1 ml 添加しよく撹拌します 7.) A, B, C の順にカローセルのロケーション No1 から 3 にサンプルチューブをセットします

3 ADC 用アプリケーションの作成 1.) Tool > Auto Setup Application Definition の順にクリックし Auto Setup Application Definition ウィンドウを開きます 2.) Application Availability で All user(common) を選択し Next をクリックします 3.) Brows をクリックして FlowPRA Screening 測定用の Protocol を選択 ( 選択後 Open をクリック ) し Next をクリックします 4.) フィルター設定を確認し Next をクリックします 5.) 使用する色素を確認し Next をクリックします 6.) FlowSet Pro の各ターゲット値をし Next をクリックしますフローセットプロターゲット値 FS 272 SS 297 FL1 167 FL2 301

4 7.) Application Name を FlowPRA Screening として Next をクリックします (Setting プロトコル名は自動で設定されます ) 8.) 再度 Next をクリックし画面を次に送ります 9.) Finish をクリックすると各設定用プロトコルが自動作成されます

5 1.) プロトコル感度設定蛍光補正のオートセッティングのための準備前項で作成したプロトコル FlowPRA Screening_STAND.pro をワークスペースに呼び出します上記プロトコルは Common(Acquisition)フォルダ内にありますドラッグドロップ 2.) 各プロット図のリニアリージョンを選択し右クリックした後に Reagion Properties を選択します

6 の中の Lower limit および Upper limit に下記数値をし OK をクリックします FSPro, SS, FL1, FL2 の全てのリージョンにいます 3.) Region Properties Lower limit Upper limit FSPro SS FL1 FL2 4.) をクリックしプロトコルを上書き保存しますの数値

ADC を使したプロトコル感度蛍光補正のオートセッティング 1.) Tool -> Auto Setup Scheduler の順にクリックし Auto Setup Scheduler ウィンドウを開きます 2.) 前項で作成したアプリケーション FlowPRA Screening-C を選択しサンプルチューブをセットしたカローセルの No.

) Carousel Load Report に示された内容とワークリストのカローセルポジションとサンプル調製の項で作成したサンプルチューブをセットしたロケーションが一致していることを確認します必要であれば Carousel Load Report を印刷します 5.

7 ADC を使したプロトコル感度蛍光補正のオートセッティング 1.) Tool -> Auto Setup Scheduler の順にクリックし Auto Setup Scheduler ウィンドウを開きます 2.) 前項で作成したアプリケーション FlowPRA Screening-C を選択しサンプルチューブをセットしたカローセルの No. をしカローセルをセットします目的アプリケーションを選択使用するカローセルの No. を 3.) Schedule ボタンをクリックします 4.) Carousel Load Report に示された内容とワークリストのカローセルポジションとサンプル調製の項で作成したサンプルチューブをセットしたロケーションが一致していることを確認します必要であれば Carousel Load Report を印刷します 5.) Close ボタンをクリックして Carousel Load Report ウィンドウを閉じます 6.) Start ボタンをクリックし FlowSetPro のチューブから順に測定を開始します 7.) 各パラメータの感度設定が自動でわれます * 感度が合いにくい場合がありますこの場合はマニュアル操作で機器による感度設定を補正してください 8.) ターゲットリージョンに FlowSetPro のピークが全て収まると次のチューブの測定に移りますターゲットリージョンにピークが収まらずに測定が終了した場合は Return をクリックし再度設定をってくださいその場合はマニュアル操作により機器の感度設定を補正してください

9.) 蛍光補正の自動設定のための測定が続いてわれますこの時に FlowPRA のピーズ測定用の感度に FS および SS がなっていますので細胞は FS の上限を振り切って測定されます蛍光補正設定の際には下記を参考にして細胞の集団を囲むようにゲートを手動で動かしてください PE の測定時にも同様にってください 10.

8 9.) 蛍光補正の自動設定のための測定が続いてわれますこの時に FlowPRA のピーズ測定用の感度に FS および SS がなっていますので細胞は FS の上限を振り切って測定されます蛍光補正設定の際には下記を参考にして細胞の集団を囲むようにゲートを手動で動かしてください PE の測定時にも同様にってください 10.) すべてのチューブを測定し終わったら Finish ボタンをクリックした後 Approve ボタンをクリックしてサイトセッティングを保存します * セッティングをやり直す必要がある場合は Reject All をクリックしますこの場合はサイトセッティングは保存されません 11.) Common(Acquisition) フォルダ内の FlowPRA Screening settings プロトコルに本設定は保存されておりますこのプロトコル設定が測定プロトコルに反映されるように以下の手順でいます 12.) FlowPRA Screeinig 測定用パネルを構成している測定プロトコルをワークスペースに呼び出します 13.) Tool バーの Cytometer -> Get Cytosetting from protocol をクリックします 14.) Look in を users に変更し admin -> acquisitionprotocol フォルダ内のプロトコル FlowPRA Screening settings を選択し Open をクリックします 15.) をクリックしプロトコルを上書き保存します

9 サンプル測定による設定の確認 1.) パネルおよびプロトコルを使用してネガティブ血清を検体としたサンプルを測定し各パラメータの感度設定および FL2 FL1 への蛍光補正を確認します * 下記のポイントをチェックしてください I. FS/SS のプロット図においてビーズの集団がわかりやすく中央付近で検出される II. Class I のビーズの FL1(FITC) におけるピークの頂点が 10 0 より低く検出される III. FS/FL2 のプロット図で 3 種類のビーズ集団が明確に識別できる IV. FL1/FL2 のプロット図で Class I と II のビーズ集団の中心が直線上に存在する I III IV II 2.) ポジティブ血清を検体としたサンプルを測定し感度設定および FL1 FL2 への蛍光補正を確認します * 下記のポイントをチェックしてください V. FL1/FL2 のプロット図において陽性 Class I のビーズの集団の中心が X 軸に沿った形で直線上に検出される V

Microsoft Word - A5_FlowCount.DOC

Microsoft Word - A5_FlowCount.DOC >> http://www.bc-cytometry.com Flow-Count TM を用いた細胞絶対数の測定 5 はじめに - 目印の効用従来フローサイトメトリー (FCM) の使用目的は細胞集団の中のあるポピュレーションの割合 ( 陽性率 ) を調べることが中心でしたしかし今日造血幹細胞残存白血球 CD4 陽性 T 細胞数などポピュレーションの割合と同時にその細胞実数 ( 絶対数