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はるまさおとべ
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1 QCWS 参考プロトコル抗体検査 (FlowPRA) 平成 29 年度版作成者日本組織適合性学会認定制度委員会ワーキンググループ抗 HLA 抗体 WG

2 改訂履歴版数改訂日施行日改訂理由改訂内容改訂責任者 2

3 目次 1.FlowPRA 製品概要 FlowPRA の使用目的原理 FlowPRA の種類検査の準備検査機器の準備キット内容検体処理検体の処理検査の手順 FlowPRA Screening Test のフローサイトメーター条件設定 FSC vs. SSC FL2 vs. FSC FL1 ヒストグラム NC 血清を流す意義 PC 血清を流す意義コントロールビーズを流す意義コンペンセーションの調整 ( 蛍光補正 ) マーカー設定の考え方 FlowPRA Screening Test データ例 Class I& II コントロールビーズと NC 血清を反応させた場合のヒストグラム Class I ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム Class II ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム機器設定の重要性 FlowPRA Screening Test ケーススタディー FlowPRA Screening Test ケーススタディー日本組織適合性学会 QCWS 参加施設のデータ例... 18

4 1.FlowPRA 製品概要 1.1 FlowPRA の使用目的原理 FlowPRA はフローサイトメーターを使用して血清中の HLA 抗体を検出する為の研究用試薬で精製した HLA 抗原がコーティングされたマイクロビーズである高感度に HLA 抗体を検出する事ができる FlowPRA ビーズと血清を反応後 FITC 標識抗ヒト IgG 抗体で染色しフローサイトメーターにより蛍光強度を測定し HLA 抗体を検出する 1

5 1.2 FlowPRA の種類 FlowPRA は FlowPRA Screening FlowPRA Specific FlowPRA Single Antigen の 3 種類のキットがある ( 図 1) 1. FlowPRA Screening: 1 ビーズに 1 パネルセル由来の HLA 抗原が結合しており HLA 抗体の有無及び %PRA * を確認できる ClassI ClassII 用キットがあり各 30 種類のビーズで全 HLA 抗原を網羅している 2. FlowPRA Specific:1 ビーズに 1 パネルセル由来の HLA 抗原が結合しており HLA 抗体の有無 %PRA とおよその特異性を確認できる各 32 種類の抗原ビーズで全 HLA 抗原を 100% 網羅している ClassI ClassII 用キットがあり 8 色のビーズと 1 つのコントロールビーズが予め混合しているバイアルが 4 本入っている 3. FlowPRA Single Antigen:1 ビーズに対しリコンビナント HLA 抗原が 1 種類のみ結合しており HLA 抗体の抗原特異性が分かる * %PRA(Panel Reactive Antibody): 全パネル細胞の何 % が陽性となるかの値 %PRA が高い程様々な抗原に対する抗体を保有している指標となる 2

6 2. 検査の準備 2.1 検査機器の準備キット内容検体処理検査器具資材の準備機器名称フローサイトメーター器具資材 1.5 ml マイクロ遠心チューブ 1.5 ml マイクロ遠心チューブ用高速遠心機 (8,000-10,000 xg が出せるもの ) ボルテックスミキサーシェーカー P-10 マイクロピペットチップ P-20 マイクロピペットチップ P-200 マイクロピペットチップ P-1000 マイクロピペットチップ 50 ml ファルコンチューブプラスチック製ディスポピペット ( 先端ができるだけ細いもの ) 参考商品ピペット E-231( アズワン ) 蒸留水 ( または精製水 ) タイマーアルミホイルキムタオル FACS チューブ 3

7 2.1.2 キット内容と保存方法未開封のキットは -65 以下で有効期限まで保存できる一度解凍したあとの保存方法と有効期限は下記のとおりである商品コード FL1-30 FL2-30 FL12-60 キット内容 FlowPRA Class I ビーズ 10 Wash buffer 100 FITC anti-human IgG FlowPRA Class II ビーズ 10 Wash buffer 100 FITC anti-human IgG FlowPRA Class I ビーズ FlowPRA Class II ビーズ 10 Wash buffer 100 FITC anti-human IgG 保存と有効期限受領後キットの箱を開封せずに使用時まで -80 ~-65 のフリーザーに保管製品はこの状態で保存期間内は安定である ( 箱に記載された有効期限を参照 ) 初回使用後および / または製品の解凍後は試薬を 2 ~5 に保管する一度解凍した FlowPRA ビーズまたは FITC conjugated F(ab') 2 anti-human IgG は再凍結しない解凍したビーズは 3 ヵ月または有効期限が 3 ヵ月以内の場合はその有効期限まで 2 ~ 5 に保管する Wash Buffer または FITC conjugated F(ab') 2 anti-human IgG は 12 ヵ月または有効期限が 12 ヵ月以内の場合はその有効期限まで 2 ~5 に保管する 1 検体あたりのビーズ使用量 5 µl 5 µl 5 µl + 5 µl 他に必要な試薬商品コード商品名梱包単位 1 検体あたりの血清使用量 FL1-PC FlowPRA クラス IPC 血清 10 tests 20 µl FL2-PC FlowPRA クラス IIPC 血清 10 tests 20 µl FL-NC FlowPRA クラス I & クラス IINC 血清 10 tests 20 µl FLCNTBD FlowPRA コントロールビーズ 10 tests 1 µl 製品コード品名容量 1 検体の使用量 LS-NC FlowPRA negative control serum 400uL(20test) 20uL LS-AB2 FITC conjugatedgoat anti human IgG 0.5mg ( 約 1000test) PBS Stock を 1uL 4

2.2 検体の処理 2.2.1 検体前処理 ( 必須 ) 1. 血清は必ず凍結融解する融解後はしっかり転倒混和を行ってから遠心を行う ( 8000 ~10000g 10 分間以上 ) 不純物が多い検体は遠心速度時間を増やすバックグラウンドが高くなるため血漿の使用は推奨しない 2. 遠心後上層下層および壁面に凝固物が存在する可能性があるので慎重に中間層から検体を回収して使用する 2.

8 2.2 検体の処理検体前処理 ( 必須 ) 1. 血清は必ず凍結融解する融解後はしっかり転倒混和を行ってから遠心を行う ( 8000 ~10000g 10 分間以上 ) 不純物が多い検体は遠心速度時間を増やすバックグラウンドが高くなるため血漿の使用は推奨しない 2. 遠心後上層下層および壁面に凝固物が存在する可能性があるので慎重に中間層から検体を回収して使用する再検査の為の検体処理 (QCWS 部会推奨 ) 1. 非特異シフトが見られる場合 : 非特異物質の吸着操作使用する試薬 :AdsorbOut( 製品コード :ADSORB One Lambda) AdsorbOut 処理プロトコル ( メーカープロトコル ) 1 (1 テストあたり ) 血清 30uL に対して Adsorb Out ビーズを 3 ul 加えボルテックスする 2 室温で 30 分間振とうしながら反応させ rpm で 5 分間遠心する 3 上清をビーズを吸わないように慎重に新しい別の 1.5mL チューブに移す 4 もし検体に Adsorb Out ビーズが混入した場合には再度超遠心し上清を移す 2. ピークの波形がギザギザでシフトしていない場合 : DTT 処理による IgM 抗体の除去使用する試薬 :DTT (dithiothreitol メーカー不問) DTT 処理プロトコル ( 第 4 回アメリカ組織適合性学会 ASHI 推奨プロトコル ) 1 DTT 溶液 (0.05M) 10 ul に対して血清を 90 ul 加える ( DTT の終濃度は 0.005M) 2 よく混ぜた後 37 で分間反応させる 1300g で 10 分間遠心し上清を使用する 5

9 2.3 検査の手順操作の流れ前処理血清を凍結融解転倒混和 ( 血漿は不可 ) 8000~10000g で 10 分間遠心反応 NC 血清 PC 血清サンプル血清とビーズを混合遮光室温 (20-25 ) 振とうで 30 分間反応洗浄 (3 回 ) 洗浄バッファー 1mL 遠心 (9000xg 2 分間 ) 上清除去ドライボルテックス FITC 標識 100 倍希釈した二次抗体を 100uL ずつ添加遮光室温 (20-25 ) 振とうで 30 分間反応洗浄 (2 回 ) 洗浄バッファー 1mL 遠心 (9000xg 2 分間 ) 上清除去ドライボルテックス 6

5mL チューブに NC 血清 PC 血清 (ClassI&II) サンプル血清 20 µl を分注する 2.

10 2.3.2 標準プロトコル注意 FlowPRA Screening Test で Class I と Class II を同時にスクリーニングする場合は 1 検体あたり Class I Class II ビーズを各 5 µl コントロールビーズ 1 µl をあらかじめ必要検体数分混合しておき混合したビーズを 1 テストあたり 11 µl 使用する操作 1. FlowPRA ビーズを使用前によくボルテックスする各 1.5mL チューブに NC 血清 PC 血清 (ClassI&II) サンプル血清 20 µl を分注する 2. 下記の量のビーズを入れてピペッティングで混合するビーズをチューブから取る際不均一になるのを防ぐためにピペッティングしながら一定の動作で取る検体の入ったチューブに血清を加える際にもピペッティングし混合する Class I ビーズ量 Class II ビーズ量コントロールビーズ量 Class I のみ 5 µl - 1 µl Class II のみ - 5 µl 1 µl Class I + Class II 5 µl 5 µl 1 µl 7

11 3. シェーカーでゆっくりシェイクしながら暗所で 30 分間反応するシェーカーがない場合は反応の間に数回軽くボルテックスする 4. 10x Wash buffer を蒸留水 ( または精製水 ) で希釈し 1 Wash buffer を調製する 5. 各チューブに 1x Wash buffer を 1000 µl 加えてボルテックスし 9000 xg で 2 分間遠心後先の細いピペットで上清をしっかり除去するビーズを吸わないように注意する洗浄 1 回目 6. 上清を除いたペレットをほぐすために 2 秒 ~5 秒程度ボルテックスする ( ドライボルテックスは長くかけすぎ無い様に注意する以下同様 ) 各チューブに 1x Wash buffer を 1000 µl 加えてボルテックスし 9000g で 2 分間遠心後先の細いピペットで上清をしっかり除去する洗浄 2 回目 8

7. 上清を除いたペレットをほぐすためにドライボルテックスする 8. 各チューブに 1x Wash buffer を 1000 µl 加えてボルテックスし 9000 xg で 2 分間遠心後先の細いピペットで上清をしっかり除去するビーズを吸わないように注意する洗浄 3 回目 9. 上清を除いたペレットをほぐすためにボルテックスする ( ドライボルテックス ) 10.

1x FITC anti-human IgG 100 µl をビーズに加えてボルテックスしシェーカーでゆっくりシェイクしながら暗所 20-25 で 30 分間反応するシェーカーがない場合はインキュベーションの間に 1 回軽くボルテックスする 12.

12 7. 上清を除いたペレットをほぐすためにドライボルテックスする 8. 各チューブに 1x Wash buffer を 1000 µl 加えてボルテックスし 9000 xg で 2 分間遠心後先の細いピペットで上清をしっかり除去するビーズを吸わないように注意する洗浄 3 回目 9. 上清を除いたペレットをほぐすためにボルテックスする ( ドライボルテックス ) 10. 洗浄 3 回目の遠心時に 1 テストあたり 100x FITC anti-human IgG 1 µl を Wash buffer 99 µl で希釈し 1 FITC anti-human IgG を調製する 11. 1x FITC anti-human IgG 100 µl をビーズに加えてボルテックスしシェーカーでゆっくりシェイクしながら暗所で 30 分間反応するシェーカーがない場合はインキュベーションの間に 1 回軽くボルテックスする 12. 各チューブに 1x Wash buffer を 1000 µl 加えてボルテックスし 9000 xg で 2 分間遠心後先の細いピペットで上清をしっかり除去するビーズを吸わないように注意する洗浄 1 回目 13. 上清を除いたペレットをほぐすためにボルテックスする ( ドライボルテックス ) 14. 各チューブに 1 Wash buffer を 1000 µl 加えてボルテックスし 9000 xg で 2 分間遠心後先の細いピペットで上清をしっかり除去するビーズを吸わないように注意する洗浄 2 回目 15. 上清を除いたペレットをほぐすためにボルテックスする ( ドライボルテックス ) Wash buffer 500 µl をチューブに加えスポイトでフローサイトメーター用のチューブに移す 17. すぐに測定するあるいは遮光して 2-5 で 24 時間までは保存可能初期設定時などゆっくり長く流したい時はこの最終液量は 500 µl 程度まではフレキシブルに変更可能 ( また機種によっても最低液量が異なることがあるので注意 ) 翌日読む場合は Fixing solution: PBS with 0.5% formaldehyde (add 1.35 ml 37% formaldehyde to 100 ml PBS) を使用すると良い 9

13 3. FlowPRA Screening Test のフローサイトメーター条件設定 QCWS 参考プロトコル HLA 抗体検査 FlowPRA FlowPRA の測定では正しいデータをとるために最初にフローサイトメーターの条件設定を正しく行うことが非常に重要この設定を保存し以降呼び出して使用すれば基本的には微調整のみで測定できる FlowPRA Screening Test を読み取るためには陰性コントロール血清 Class I 陽性コントロール血清 Class II 陽性コントロール血清コントロールビーズを検体血清と同時に流す必要がある 3.1 FSC vs. SSC Class II ビーズ Class I ビーズコントロールビーズ FlowPRA Screening Test Class I Class II コントロールビーズの FSC vs. SSC ドットプロットビーズの半径は約 2 ~4 µm のためリンパ球向けのモードで解析している場合は感度を上げる 3.2 FL2 vs. FSC Class II ビーズコントロールビーズ Class I ビーズ FlowPRA Screening Test Class I Class II コントロールビーズの FL2 vs. FSC ドットプロット Class II ビーズおよびコントロールビーズにはビーズに色素が含まれているため PE の蛍光強度により領域を分けることができる 10

14 3.3 FL1 ヒストグラム QCWS 参考プロトコル HLA 抗体検査 FlowPRA NC 血清を流す意義 NC 血清を検体と同時に流す目的は陰性血清を基準に陽性領域と陰性領域を決めるため Class I Class II PC 血清を流す意義 PC 血清を検体と同時に流す目的は二次抗体が働いているかを確認するため Class I Class II コントロールビーズを流す意義 Class I ビーズ Class II ビーズコントロールビーズ陰性コントロール血清に Class I Class II とコントロールビーズを反応させた際の FL1 ヒストグラムコントロールビーズを他のビーズと混合して流す目的は血清中の非特異反応の有無を確認するため HLA 抗体陰性の検体にも関わらず非特異反応によりヒストグラムが右側にシフトする場合がありコントロールビーズのヒストグラムを基に非特異か陽性反応かを判断する 11

15 3.4 コンペンセーションの調整 ( 蛍光補正 ) QCWS 参考プロトコル HLA 抗体検査 FlowPRA コンペンセーションとは 2 種類以上の蛍光の測定においてそれぞれの蛍光の波長が重なり合う場合 ( 例 :FITC と PE) 互いの検出器にいわゆる光漏れが起きるため電気的に補正するもの 1:Class I ビーズ + NC 血清 (FL-NC) 2:Class I ビーズ + Class I PC 血清 (FL1-PC) 3: Class II ビーズ + PBS を混合したビーズをフローサイトメーターに流し集団の位置を調整する凡例集団 1: Class I ビーズ + FL-NC (1) 集団 2: Class I ビーズ + FL1-PC (2) 集団 3: Class II ビーズ + PBS (3) 集団 2 は上にずれる傾向なので下に寄せて集団 1 と 2 が X 軸と並行な位置に来るように調整 (FL2-%FL1 の値を上げる ) 集団 3 は右にずれる傾向なので左に寄せて集団 1 と 3 が Y 軸と並行な位置に来るように調整 (FL1-%FL2 の値を上げる ) 4. マーカー設定の考え方ネガティブコントロール血清被検血清 Class I ビーズ Class II ビーズコントロールビーズと血清を反応させた場合の Class I ヒストグラム検体血清が図のようにネガティブピークがはっきり分かる形状の場合 NC 血清で設定した M1 をそのまま用いるのではなくネガティブピークのすぐ横のピーク谷間に合わせて M2 を再設定して %PRA を求める 12

16 5. FlowPRA Screening Test データ例 5.1 Class I& II コントロールビーズと NC 血清を反応させた場合のヒストグラム NC Class I NC Class II Cont. 13

17 5.2 Class I ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム QCWS 参考プロトコル HLA 抗体検査 FlowPRA 陰性検体 0.9% Class I の NC 血清 (P14) のヒストグラムと比較して波形がほぼ同一の位置にあり形状も同一陽性検体 98.4% Class I の NC 血清 (P14) のヒストグラムと比較して波形が右側へシフトしており多峰性を示している Class I 抗体陽性検体のヒストグラム例は波形が右側にシフトしており明らかに多峰性を示している 2 は一番左側のピークの横に新たなライン ( 線 ) を引き直し %PRA を変更する 4 は小さい山が右側にシフトしており弱陽性の HLA 抗体があると思われる 14

18 5.3 Class II ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム QCWS 参考プロトコル HLA 抗体検査 FlowPRA 陰性検体 0.3% Class II の NC 血清 (P14) のヒストグラムと比較して波形がほぼ同一の位置にあり形状も同一陽性検体 99.8% Class II の NC 血清 (P14) のヒストグラムと比較して波形が右側へシフトしており多峰性を示している Class II 抗体陽性検体のヒストグラム例は波形が右側にシフトしており明らかに多峰性を示している 2 は小さい山が右側に見えるまたピークの右側の部分が少し膨らんでいる 15

19 6. 機器設定の重要性添付文書と同じプロットが描けているか確認する添付文書より FSC vs. SSC FSC vs. FL-2 Class II Control Class I 機器の設定が出来ていない例 FSC vs. SSC FSC vs. FL2 ( 日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ引用 ) FlowPRA Screening Test ケーススタディー 1 同一検体 (HLA Class I 抗体陰性の検体 ) を FlowPRA Screening Test Class I で測定した 16

20 もの異なる施設およびフローサイトメーターで測定した例を下図に示す陰性と判定した施設ヒストグラムは右側へシフトしているが陰性と判定した施設陽性と判定した施設説明 : ヒストグラムのパターンが大きく 2 パターンに分かれたすなわちネガティブコントロールと同じ位置に検体血清のピークが出た施設ネガティブコントロールよりも右側にシフトした施設があったさらに検体血清が右側にシフトした場合陰性と判定した施設や陽性と判定した施設があった検体血清のヒストグラムは右側にシフトしてるが波形がシングルピークでかつ NC 血清とほぼ同形のため陰性と判断する検体血清が右側にシフトした原因として 1 コンペンセーション調整が合っていない 2 洗浄が悪い 3 機器の差などが考えられる ( 日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ引用 ) FlowPRA Screening Test ケーススタディー 2 同一検体 (HLA Class II 抗体弱陽性の検体 ) を FlowPRA Screening Test Class II で測定したもの異なる施設およびフローサイトメーターで測定した例を下図に示す 17

は多施設と比べてほとんど右側のピークがほぼ見えず二次抗体のラベリングが出来ていない可能性がある洗浄時 ( 特に二次抗体の添加前 ) は上清をしっかりする再度検査することをおすすめする ( 日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ引用 ) 日本組織適合性学会 QCWS 参加施設のデータ例同一検体を用いて

21 正しいヒストグラム陰性と判定した施設 (2 施設 ) 施設 I 施設 II 保留と判定した施設 (4 施設 ) 施設 III 施設 IV 施設 V 施設 VI 陽性と判定した施設 (5 施設 ) 説明 : 陰性と判定とした 2 施設について施設 I は機器の適切なコンペンセーション調整が出来ていない施設 II はシングルピークのため陰性と判断している施設 II はサンプル調製の手技に問題があると考えられる使用する血清をよく遠心しビーズと血清との反応を行った後洗浄や二次抗体のラベリングを正確に行うことをおすすめする保留と判定した施設 III 施設 IV 施設 VI は右側に見られる小さなピークを陽性と判断して構わない施設 V は多施設と比べてほとんど右側のピークがほぼ見えず二次抗体のラベリングが出来ていない可能性がある洗浄時 ( 特に二次抗体の添加前 ) は上清をしっかりする再度検査することをおすすめする ( 日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ引用 ) 日本組織適合性学会 QCWS 参加施設のデータ例同一検体を用いて FlowPRA Screening Test Class I を行った際の QCWS 参加施設のヒストグラム (raw data) 同一の血清を用いたにもかかわらず様々なヒストグラムが得られる各施設の機器においてピークの出方や波形の傾向を把握することによって弱陽性の HLA 抗体反応や非特異反応を見つけることができ検査の精度を上げることができる 18

22 ( 日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ引用 ) 19

スライド 1

スライド 1 Flow PRA 法の検査状況の解析福岡赤十字病院検査部移植検査課 / 輸血細胞治療部金本人美参加施設数 -Flow PRA- Screening ClassⅠ 25 施設 ClassⅡ 24 施設 Single antigen ClassⅠ 2 施設 ClassⅡ 2 施設 18th 17th Screening ClassⅠ 22 施設 ClassⅡ 20 施設 Single antigen