Human shRNA Library

Size: px

Start display at page:

Download "Human shRNA Library"

ぎんとくぬぎ
7 years ago
Views:

1 研究用 Human shrna Library 説明書 v201703da

2 本製品はヒト遺伝子約 17,000 種類に対応する shrna を網羅したレトロウイルス型ヒト shrna 発現ライブラリーです文部科学省ゲノムネットワークプロジェクトの研究成果に基づいています遺伝子発現の抑制機序のひとつとして RNA 干渉作用 (RNA interference; RNAi) があります 1) 特定配列の二本鎖 RNA を導入することによりその標的遺伝子の mrna を分解し発現を抑制することが可能であり哺乳類細胞では 21 ~ 23 塩基の短い二本鎖 RNA(short interfering RNA;siRNA) によって RNAi 効果が得られることが明らかとなっています 2-4) 合成 sirna を直接細胞に導入する方法は発現抑制効果が短く細胞への導入効率が影響しますその問題を解決する目的で発現ベクターを用いる方法が有用です本製品の shrna 配列は RNA 干渉誘導効率が高いだけでなく RNA 干渉実験で起こる目的外遺伝子の発現を抑制する効果 ( オフターゲット効果 ) が低い特長を有しています約 17,000 種のヒト遺伝子に対する高い網羅性を有しており疾患関連遺伝子の探索研究などヒト遺伝子の機能解析研究において幅広く利用できます本製品は文部科学省ゲノムネットワークプロジェクトの一環としての東京大学によるヒト全遺伝子レトロウイルス型 sirna ライブラリー構築の成果に基づくライブラリーです shrna 配列は東京大学で開発されたアルゴリズムに基づいて設計されています 5) I. 製品内容本ライブラリーは全クローンのセットおよびカテゴリーセットとして提供されますこれらは遺伝子組換え生物に該当します添付文書をご確認ください全クローンセット: Human shrna Library (Full collection) ( 製品コード 3680) 形状 : 形質転換済み大腸菌 JM109 のグリセロールストック ( 各約 0.1 ml 96 穴プレートに分注 ) クローン情報を含むデータ CD カテゴリーセット(6 タイプ ): Human shrna Library (apoptosis family)( 製品コード 3681) Human shrna Library (mitochondrion_pol_iii family)( 製品コード 3682) Human shrna Library (transcription factor activity family)( 製品コード 3683) Human shrna Library (catalytic activity family)( 製品コード 3684) Human shrna Library (signal transducer activity family)( 製品コード 3685) Human shrna Library (transporter activity family)( 製品コード 3686) 形状 : 形質転換済み大腸菌 JM109 のグリセロールストック ( 各約 0.1 ml 96 穴プレートに分注 ) クローン情報を含むデータ CD 必要なクローンだけを個別にプラスミド DNA としてご注文いただくこともできます Human shrna Library (plasmid clone) プラスミド DNA 溶液 ( 約 500 ng/μl 約 20 μl TE バッファー溶液 ) Human shrna Library 検索サイト ( で検索して専用発注書でご注文くださいタカラバイオ ( 株 ) 2

3 機能 puc ori: 大腸菌での複製起点 (E. coli 由来 ) Amp r : アンピシリン耐性遺伝子 (E. coli 由来 ) 5 PCMV LTR : PCMV 由来 5 LTR 配列 PSI: レトロウイルス用パッケージングシグナル配列 (MoMSV + MoMLV 由来 ) H1 RNA promoter: ヒト H1 遺伝子由来プロモーター配列 PGK promoter: マウス PGK 遺伝子由来プロモーター Puro r : ピューロマイシン耐性遺伝子 (Streptomyces alboniger 由来 ) 3 PCMV Δ LTR: PCMV 由来 3 Δ LTR 配列図 1: ヒト shrna 発現ライブラリーの基本構造 II. 本ライブラリーの構成本ライブラリーは pshgnp レトロウイルスベクタープラスミドの Bgl II と Hind III 部位の間に shrna に対応する DNA 配列が挿入されたプラスミドライブラリーです ( 図 1) RNA polymearase III による上流 H1 promoter からの shrna の細胞内での高発現が期待されます本製品は精製したプラスミド DNA をそのまま細胞へ導入して shrna を発現することもできますまたレトロウイルス型であるため Retrovirus Packaging Kit Eco/Ampho を用いて G3T-hi 細胞や 293T 細胞に一過性トランスフェクションすることにより shrna 発現組換えレトロウイルスを産生しいろいろな細胞へ感染させることも可能で shrna 発現安定細胞株の樹立を行うこともできます shrna 発現プラスミドの大量調製レトロウイルスベクターを作製するためにプラスミド DNA をパッケージング細胞などへトランスフェクションする場合高純度に精製されたものが必要になります本ライブラリーの pshgnp ベクターは高コピープラスミドでありアンピシリンを含む 25 ~ 40 ml の大腸菌培養液から約 100 μg のプラスミドを得ることができますプラスミドは塩化セシウム密度勾配による超遠心やトランスフェクショングレードのプラスミド DNA 精製キット [NucleoBond Xtra Midi( 製品コード ) など ] によって精製し滅菌精製水または TE Buffer で 1 mg/ml の濃度に溶解したものを使用してくださいタカラバイオ ( 株 ) 3

4 III. 保存 - 80 : グリセロールストックこの状態で数年間安定に保存することが可能です凍結融解を頻繁に繰り返すと大腸菌の viability に影響が出る場合がありますのでご注意ください IV. 使用方法 ( レトロウイルスベクターを作製し遺伝子導入を行う場合 ) IV-1. レトロウイルスベクターの作製 IV-1-1. プラスミド DNA の調製目的クローンからプラスミド DNA を調製する (3 ページ参照 ) 必要量を 1 μg/μl 水溶液となるよう濃度調整する IV-1-2. 必要な器具装置および用意するもの Retrovirus Packaging Kit Eco/Ampho( 製品コード 6160/6161) レトロウイルス調製細胞 G3T-hi 細胞 ( 製品コード 6163) 293 細胞 293T 細胞などゼラチンまたはコラーゲンコートプレート 5 ml ポリスチレン丸底滅菌済みチューブ培地 (Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) 4.5 g/l Glucose with L-Glutamine (584 mg/l)(lonza Code F/12-604Q) Fetal Bovine Serum(FBS) Puromycin( 製品コード /631306) 滅菌精製水 Penicillin-Streptomycin Mixture(Lonza code E) Trypsin/EDTA (1X)(Lonza Code E) 力価測定用細胞 (NIH/3T3 など ) ポリブレン電動ピペッター 0.45 μm 滅菌済みフィルター ( 低吸着タイプ ) フィルター付滅菌済みチップタカラバイオ ( 株 ) 4

5 IV-1-3. ウイルス作製前日 G3T-hi 細胞 293 細胞または 293T 細胞を 6 cm シャーレに cells 播く 1 日目 ( トランスフェクション ) (1)Retrovirus Packaging Kit の中からベクター (pgp, pe-eco/ampho) Chloroquine 必要数量の Transfection Buffer を溶解する (2)Transfection Buffer 滅菌精製水を室温に戻す (3) 培地 (10% FBS/DMEM) に 1,000 分の 1 量の Chloroquine を添加後培地を 37 で保温する (4) 細胞が 70 ~ 80% コンフルエントであることを確認し Chloroquine 含有培地 3 ml と交換する (5)DNA 混合液の調製以下の溶液を 5 ml ポリスチレン丸底チューブ内で混合する shrna 発現プラスミド (1 μg/μl 水溶液 ) 10 μl pgp Vector 5 μl pe-eco/ampho Vector 5 μl 2 M CaCl2 62 μl 滅菌精製水 418 μl (6) リン酸カルシウム沈殿の作製およびトランスフェクション 500 μl の Transfection Buffer を電動ピペッターを用いて (5) の液に緩やかに加える ( チューブを振りながら混ぜる ) 添加後直ちにピペッターの排出を利用してバブリングする (10 ~ 20 秒 ) 1 ~ 2 分以内にシャーレに均一に滴下し培地と混合する (2 分間以上の放置は大きな凝集体形成の原因となるためできるだけ避けること顕微鏡観察で細胞に粉雪が降りかかったような状態が見えればリン酸カルシウム沈殿の形成は成功している ) 37 5% CO2 インキュベーターで培養する (7 ~ 11 時間 ) 7 ~ 11 時間後シャーレから培地 3 ml を除き新たに 10% FBS/DMEM を 4 ml 加える 2 日目 ( トランスフェクションから 24 時間後 ) 培地を交換する (10% FBS/DMEM 4 ml) 3 日目 ( トランスフェクションから 48 時間後 ) 上清を 0.45 μm フィルターでろ過しウイルス液とする調製したウイルス液は直ちに使用しない場合小分けして- 80 保存し凍結融解の繰り返しを避ける 293T 細胞を用いてウイルス生産した場合 10 5 ~ 10 6 cfu/ml 程度のウイルス力価が得られるタカラバイオ ( 株 ) 5

6 IV-1-4. ウイルス力価測定 ( 実施例 ) 前日 NIH/3T3 細胞を 6 穴プレートに cells/well の密度で播く 1 日目 ( 感染 ) ウイルスストックの溶解希釈および感染 (1)- 80 で保存したウイルス液を 37 水浴中で速やかに溶かし溶解後は氷上で保持する (2) 希釈系列の作製ウイルス液はマイクロチューブ中で 10% FBS 入り DMEM を用いて 10 倍 10 2 倍 10 3 倍 10 4 倍 10 5 倍に希釈する希釈液は各 200 μl 以上用意する (3)NIH/3T3 細胞の培地を 8.9 μg/ml ポリブレンと 10% FBS を含む培地 900 μl と交換する (4)10 倍 10 2 倍 10 3 倍 10 4 倍 10 5 倍に希釈したウイルス液 100 μl を各ウェルに添加し感染させる実験は 2 連で行う ( ウイルス液の最終希釈濃度は 10 2 倍 10 3 倍 10 4 倍 10 5 倍 10 6 倍になりポリブレン濃度は 8 μg/ml となる ) (5) 感染から 4 ~ 6 時間後各ウェルに 10% FBS を含む培地 1 ml を添加する 2 日目以降 (6) 感染から 24 時間後 1 μg/ml Puromycin を含有する 10% FBS を含む培地 2 ml と交換する ( 培地交換するときに細胞が乾かないように注意する ) (7) 以後 3 日 ~ 4 日ごとに Puromycin 含有培地を交換し 9 ~ 12 日間培養する 10 ~ 14 日目 ( コロニー染色 ) 生育してきたコロニーをギムザ液やメチレンブルーなどで染色する [ 染色例 : メチレンブルー染色 ] 用意するもの PBS 0.2% メチレンブルー / メタノール溶液工程 (1) プレートから培地を吸引除去し 1 ウェルあたり 1 ml の PBS を添加後 PBS を吸引除去する (2) プレートの蓋を安全キャビネット内で開けキャビネットのファンで風乾させる (3) プレートが完全に乾いたら 1 ウェルあたり 0.5 ml の 0.2% メチレンブルー / メタノール溶液を添加して 10 分間染色する (4) メチレンブルー染色液を除きウェルを水洗し乾燥させる (5) 青く染まったコロニーの数を計数し 10 ~ 100 コロニーを含むウェルのコロニー値に希釈倍率を乗じた値を力価 (cfu/ml) とする Retrovirus Titer Set (for Real Time PCR)( 製品コード 6166) を用いるとリアルタイム RT-PCR により迅速に力価 (RNA タイター ) を測定することが可能ですタカラバイオ ( 株 ) 6

7 IV-2. レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入実験例 (RetroNectin を使用する場合 ) IV-2-1. 必要な器具装置 C O 2 インキュベーター安全キャビネット細胞観察用顕微鏡電動ピペッター細胞培養用シャーレフィルター付滅菌済みチップ RetroNectin( 製品コード T100A/B) およびノンコートタイプの培養容器または RetroNectin Dish( 製品コード T110A) 2% BSA/PBS 溶液 PBS IV-2-2. 準備 (RetroNectin Dish を用いる場合には不要 ) ノンコートタイプの培養容器に RetroNectin をコーティングし 2% BSA/PBS 溶液でブロッキング後 PBS または Hank s 緩衝液で洗浄する ( 詳細は RetroNectin の取扱説明書参照 ) IV-2-3. 感染 (1)RetroNectin をコートしたプレートにウイルス原液または血清培地で希釈したウイルス液を 125 ~ 250 μl/cm 2 加え 32 または 37 の CO2 インキュベーター内で 3 ~ 5 時間インキュベートする * *: レトロウイルスベクターの力価が低い場合やより高効率に細胞への遺伝子導入を行いたい場合には遠心による RetroNectin 上へのウイルス結合法が有効です詳細は RetroNectin の取扱説明書をご覧ください (2) 増殖期にある細胞を回収し新しい増殖培地で 0.2 ~ cells/ml になるように懸濁する (3) 感染の直前に RetroNectin プレートからウイルス液を吸引除去し PBS で 1 回洗浄するプレートが乾かないように注意する (4) 洗浄後直ちに細胞をプレートに添加する播種密度は細胞の大きさや増殖速度によって異なるが一般的に推奨される密度は 0.5 ~ cells/cm 2 である V. 遺伝子導入細胞の選択 pshgnp ベクターは選択マーカー遺伝子として Puromycin 耐性遺伝子を搭載しているため遺伝子導入細胞を Puromycin で選択することができる Puromycin 選択は感染後 24 時間以上経過してから開始し 3 ~ 4 日ごとに Puromycin 培地を交換する RetroNectin 法で感染した接着系の細胞の場合には組織培養用プレートに細胞密度を減らしてまきなおしてから Puromycin 選択を行う Puromycin 選択開始後約 2 週間で遺伝子導入細胞が得られる細胞によって Puromycin に対する感受性は異なるのであらかじめ使用する細胞に適した Puromycin 濃度 (1 ~ 10 μg/ml) を決定しておく ( 実施例に関しては弊社ウェブカタログをご覧ください ) VI. 参考文献 1) Tuschl, et al. Genes Dev. (1999) 13: ) Miyagishi, et al. Nat Biotechnol. (2002) 20: ) Martinez, et al. Cell. (2002) 110: ) Chiu, et al. Mol Cell. (2002) 10: ) Ui-Tei, et al. Nucleic Acids Res. (2002) 32: タカラバイオ ( 株 ) 7

8 VII. 関連製品 Retrovirus Packaging Kit Eco/Ampho( 製品コード 6160/6161) レトロウイルス調製細胞 G3T-hi 細胞 ( 製品コード 6163) Retrovirus Constructive System Eco/Ampho( 製品コード 6164/6165) RetroNectin (Recombinant Human Fibronectin Fragment)( 製品コード T100A/B) RetroNectin Dish(RetroNectin Pre-coated Dish, 35 mm φ)( 製品コード T110A) Puromycin( 製品コード /631306) Retrovirus Titer Set (for Real Time PCR)( 製品コード 6166) NucleoBond Xtra Midi( 製品コード /.50/.100) NucleoBond Xtra Midi Plus( 製品コード /.50) その他のベクターへの載せ換えも別途承ります受託窓口までお問い合わせください (TEL: ) VIII. 注意本製品は研究用試薬ですヒト動物への医療臨床診断には使用しないようご注意くださいまた食品化粧品家庭用品等として使用しないでくださいタカラバイオの承認を得ずに製品の再販譲渡再販譲渡のための改変商用製品の製造に使用することは禁止されています ( 本製品により得られた生物材料を第三者へ譲渡することもできません ) 本製品は遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律の遺伝子組換え生物等に該当しますご使用の際は研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置を定める省令 ( 平成 16 年文科省環境省令第 1 号 ) および組織内の安全委員会の指示に従って適切な拡散防止措置の下で取り扱ってください本レトロウイルスベクターの系によって生産されるウイルス上清は挿入断片によっては危険なウイルスを含む恐れがあるため組換えレトロウイルスの生産と取扱いには適切な処置をとる必要があります吸入や付着を防ぐため必ず安全キャビネットを使用してください本製品ご利用の際は省令および組織内の組換え DNA 安全委員会の指示に従い安全には十分ご注意ください本製品の使用によって生じたいかなる事故損害についても弊社では責任を負いかねますのでご了承の上本製品をご使用くださいライセンスに関する情報は弊社ウェブカタログをご覧ください RetroNectin はタカラバイオ株式会社の登録商標ですその他本説明書に記載されている会社名および商品名などは各社の商号または登録済みもしくは未登録の商標でありこれらは各所有者に帰属します v201703da

pSINsi-hH1 DNA, pSINsi-hU6 DNA, pSINsi-mU6 DNA

pSINsi-hH1 DNA, pSINsi-hU6 DNA, pSINsi-mU6 DNA 研究用 psinsi-hh1 DNA( 製品コード 3660) psinsi-hu6 DNA( 製品コード 3661) psinsi-mu6 DNA( 製品コード 3662) 説明書 v201603da 目次 I. 製品説明と原理 II. 保存 III. 準備 : ヘアピン型 RNA を発現させるための DNA 合成 IV. psinsi ベクターへのヘアピン型 RNA 発現のための合成 DNA の挿入