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うきえつくとの
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1 1 東京大学大学院農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス人材養成プログラムバイオインフォマティクスリテラシー I 平成 19 年 6 月 4 日 ( 月 ) 7 日 ( 木農学部 2 号館化学第一講義室立体構造予測 II 二次構造予測立体構造予測 ( ホモロジーモデリング ) など東京大学大学院農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス人材養成ユニット特任助教古田忠臣

2 2 講義の予定構造類似性配列類似性 1D 検索 2D 予測 3D 予測 5 月 28 日 ( 月 ) 31 日 ( 木 ) 構造データベース :PDB 構造分類データベース :SCOP CATH 構造比較サーバー :CE DALI/FSSP VAST 相同性検索 :BALST PSI-BLAST FASTA CLUSTALW 6 月 4 日 ( 月 ) 7 日 ( 木 ) 二次構造予測 :PSIPRED PHDsec PREDETOR NPS@ 立体構造予測参考 :CASP 比較モデリング法ホモロジーモデリング :MODELLER SWISS-MODEL フォールド認識法 :meta server (3D-Jury) de novo / ab initio 予測法 : Robetta など

3 3 タンパク質立体構造予測とは? アミノ酸配列情報 ( 一次構造情報 ) 問題を基に物理化学的情報科学的手法を用いてそのタンパク質の立体構造 ( 三次構造情報 ) 答えを予測する問題一次構造 : アミノ酸配列例 ) MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAAT AEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDA TKTFTVTE 答え三次構造 : タンパク質立体構造例 ) 下図二次構造 :α へリックス β ストランドコイル ( ターン ) 創薬など公益性の高い分野に応用されている四次構造 : 複合体超分子

( 参考 ) CASP: 聖杯の探索 (The Search for the Holy Grail) Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction タンパク質立体構造予測の国際コンテスト [URL] http://predictioncenter.gc.ucdavis.

4 ( 参考 ) CASP: 聖杯の探索 (The Search for the Holy Grail) Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction タンパク質立体構造予測の国際コンテスト [URL] 2 年に一度開催される X 線解析 NMR 解析の実験研究者からその年構造が決定されるタンパク質のアミノ酸配列問題が提供される Human は約 3 週間 Server は 48 時間で構造を予測しモデルを 5 つまで提出年末の会議で GDT_TS 等のスコアで予測構造を決定された構造答えと比べて評価他ドメイン予測機能予測などもある CASP1 CASP2 CASP3 CASP4 CASP5 CASP6 CASP7 Year Targets 33 42/42 (T0001-T0042) 43/42 (T0043-T0085) 43/62 (T0086-T0128) 67/67 (T0129-T0195) 64/87 (T0196-T0282) 95/104 (T0283- T0386) Predictors Web で顔写真を探して下さい Leonardo da Vinci 実践バイオインフォマティクスゲノム研究のためのコンピュータスキルオライリージャパン節 CASP: 聖杯の探索 Web で写真を探して下さい The Last Supper 4

5 5 問題の分類難易度易難比較モデリング法 Comparative modeling (CM) Easy(BLAST) Hard(PSI-BLAST) フォールド認識法 Fold recognition (FR) Homologous Analogous 新規フォールド New fold (NF) de novo / ab initio 予測法 de novo / ab initio prediction Homology Based Modeling Non-homology Modeling Template-based modeling (High Accuracy) 如何に良い鋳型 (template) 構造を検索し良いアラインメントを得るか! Template-free modeling

6 6 構造モデル構築に用いる主な手法ツール CM( 比較モデリング ) Homology ホモロジーモデリング search BLAST, PSI-BLAST, FASTA, SSEARCHなど Model building MODELLER, SWISS-MODELなど Secondary 二次構造予測 structure prediction PHDsec,PSIPRED,NNPREDICT,Jpred, NPS@ など TransMembrane region prediction SOSUI, MEMSAT, TMHMM, PHDhtmなど Domain search / parsing Pfam, ProDom, TIGRFAM, RPS-BLAST/CDD など Motif(s)/block(s) search PROSITE, BLOCKSPRINTS など ( 以下上記情報を用いる ) FR( フォールド認識 ) Threading 3D-PSSM, FUGUE2, mgenthreader など Consensus meta server (3D-Jury) Model building MODELLER, SWISS-MODEL など NF( 新規フォールド ) Fragment Assembly ROBETTA, ProtInfo, ROKKY など

二次構造平行 β シート逆平行 β シート 1. DS1.7 で File Open URL PDB ID: 2GB1 2. Chart Ramachandran plot 3.

4 16 ) 3 10 ヘリックス Ramachandran plot 1 Contact map 対角線との関係付近 : へリックス垂直 : 逆平行 β シート平行 : 平行 β

Corey, PNAS37, 235-240 (1951), Atomic coordinates and structure factors for two helical

7 二次構造平行 β シート逆平行 β シート 1. DS1.7 で File Open URL PDB ID: 2GB1 2. Chart Ramachandran plot 3. Chart Contact plot C-Alpha 7 α L PDB ID: 2GB1 表示 :Solid ribbon α R へリックス ( ) 他 π ヘリックス ( ) 3 10 ヘリックス Ramachandran plot 1 Contact map 対角線との関係付近 : へリックス垂直 : 逆平行 β シート平行 : 平行 β シート L. Pauling, R.B. Corey, PNAS37, (1951), Atomic coordinates and structure factors for two helical configuratoins of polypeptide chains G.N. Ramachandran, C. Ramakrishnan, V. Sasisekharan, J. Mol. Biol.7, (1968), Stereochemistry of Polypeptide Cahin Configuration α 16 π

二次構造予測 : Chou-Fasman, GOR, NN,,, 8 NN, HMM, SMVの講義ゲノム知識情報処理論 ( 麻生川先生 ) Chou-Fasman 法 1974 15タンパク質から二次構造頻度 P α P β を計算しそれを基にある閾値以上をα(4/6) β(3/5) と予測する精度 :50-60% GOR(Garnier,Osguthorpe,Robson) 法

8 二次構造予測 : Chou-Fasman, GOR, NN,,, 8 NN, HMM, SMVの講義ゲノム知識情報処理論 ( 麻生川先生 ) Chou-Fasman 法タンパク質から二次構造頻度 P α P β を計算しそれを基にある閾値以上をα(4/6) β(3/5) と予測する精度 :50-60% GOR(Garnier,Osguthorpe,Robson) 法残基のWindowで配列をスキャンしその情報量を基に中心のアミノ酸の二次構造 (α( 連続 4) β( 連続 2) ) を予測精度 : 約 65% ニューラルネットワーク (NN) 法残基のWindowでNNを学習させ二次構造 (α β コイル) を予測 NNPREDICT Kneller et al PHD Rost, Sander 1993 PSIPRED Jones % (H) 最近接法 PREDATOR Frishman, Argos 1995 Web で顔写真を探して下さい D. Jones P.Y. Chou, G.D. Fasman, Biochemistry13, (1974), Prediction of Protein Conformation J. Garnier, D.J. Osguthorpe, B. Robson, J. Mol. Biol.120, (1978), Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins N. Qian, T.J. Sejnowski, J. Mol. Biol.202, (1988), Predicting the secondary structure of globular proteins using neural network models D.T. Jones, J. Mol. BIol.292, (1999), Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices (E) (C)

9 二次構造予測 : NNPREDICT [URL] 9 先程の 2GB1 の配列を表示し Sequence Show Sequence 配列を選択して右クリックでコピー NNPREDICTサイトで配列を貼り付け Submit

10 10 予測結果と答えとを比較予測結果予測 :MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE 答え :MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE 正答率 :37/56=0.66 DS1.7 の配列上で右クリック Secondary Structure Cartoon を選択し答えを表示

二次構造予測 : ( コンセンサス予測 ) NPS@ [URL] http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?

11 二次構造予測 : ( コンセンサス予測 ) NPS@ [URL] 11 NPS@ サイトを開き先程と同様に 2GB1 の配列を貼り付けて GORIV PHD PREDATOR にチェックを入れ SUBMIT をクリックして下さい

12 12 予測結果と答えとを比較予測 :MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE 答え :MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE 正答率 :50/56=0.89 一般にコンセンサスを取るほうが良い予測になります時代はコンセンサス!

13 13 ホモロジーモデリング ( 比較モデリング ) 問い合わせ配列に対してデータベースを用いて配列解析を行い検索された鋳型アラインメントを基に立体構造を構築することをホモロジーモデリング ( 比較モデリング ) と言います問い合わせ配列配列解析 PSI-BLAST などモデル構築 MODELLER などデータベース PDB などモデルの評価 Verify3D など立体構造

ホモロジーモデリングの標準的なツール MODELLER SWISS-MODEL MODELLER [URL] http://www.salilab.org/modeller/ ダウンロードして手元で実行力場 :CHARMM22 SWISS-MODEL [URL] http://swissmodel.expasy.

14 ホモロジーモデリングの標準的なツール MODELLER SWISS-MODEL MODELLER [URL] ダウンロードして手元で実行力場 :CHARMM22 SWISS-MODEL [URL] First Approach mode メールアドレス名前タイトル配列を入力し Normal mode をチェックして Send Request をクリック入力したメールアドレスにモデル構造 (PDB) が送信される力場 :GROMOS96 A. Sali A. Sali, T.L. Blundell, J. Mol. Biol.234, (1993), Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints M.C. Peitsch, Biochem. Soc. Trans.24, (1996), ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modelling 14 Web で顔写真を探して下さい

15 CASP6 のターゲット :T0225 のモデル構造をホモロジーモデリングにより構築してみましょう 1 配列の表示 15 講義のリンクページからファイル T0225.fasta をクリックしデスクトップなどに保存 DS1.7 で File Open を選択し今保存した T0225.fasta を開く ( ファイル名が表示されない時は直接ファイル名を入力してみて下さい )

16 16 2PSI-BLAST プロトコルを開く Protocols Explorer が表示されていない方は View Explorers Protocols を選択 Protocols Explorer の Discovery Studio Sequence Analysis の左の + をクリックして開く PSI-BLAST search をダブルクリック右下に BLAST プロトコルのパラメータ設定タブが開きます同時に左下に Help Jobs のタブも開きます

17 17 3 相同性検索 PSI-BLAST の実行設定を Input Sequence を T0225:T0225 Input Databese を PDB_nr95 PDB E-value Cutoff を Maximum Hits をと変更してウィンドウ左上の緑の三角をクリックし PSI-BLAST を実行して下さい Job( 検索 ) が始まり 40 秒ほどで終了します OK をクリック

xml をクリック Blast Window から Table View タブをクリック (1VL0

18 4 結果から鋳型を選択しその構造をダウンロードする結果を表示 Jobs から今計算した Protocol Name PSI-BLAST,,, をダブルクリック次に Output Files から T0255.xml をクリック Blast Window から Table View タブをクリック (1VL0 は答えなので他の鋳型を選択 ) 鋳型として 1N2S_A を右クリックし Load Selected Structures で構造をダウンロード ( 鋳型は複数選択することもできます ) 18

右クリックして Rename Sequence を選択 1N2S に変更して下さい

19 19 5 構造とアラインメントの修正リンク構造が表示されるので <Chain> や Water を削除し chain A のみにして下さい ( リガンドなど利用することも出来ます ) T0225 Blast Window に戻り 1N2S_A を右クリックし Load Sequence and Alignment を選択しアラインメントを表示して下さいアラインメントが表示されるので配列名 pdb 1N2S A を選択し右クリックして Rename Sequence を選択 1N2S に変更して下さい構造とアラインメントをリンクする : Sequence メニューから Link Sequence and Structure を選択 Link をクリック

Sequence Alignment 中身は + をクリックし展開すると以下です Input Model Sequence: T0225 Input Template

20 20 6 モデル構築の実行 Protocols Explorer の Protein Modeling から Build Homology Models をダブルクリック右下の Build Homology Models の設定を以下にする自動的に入力アライメントが表示されます Input Sequence Alignment: Similarity Sequence Alignment 中身は + をクリックし展開すると以下です Input Model Sequence: T0225 Input Template Structures: 1N2S Cut Overhangs: False に変更して下さい全ての残基がモデリングされます設定ができたのでモデル構築を実行左上の緑の右向きをクリック

21 21 7 結果の表示 3 分少々で計算が終了します OK をクリック Jobs タグの Build Homology,,, をダブルクリック Build Homology Models Html Window が開くので T0225.B msv をクリックし構築した構造を表示してみましょう表示を変えて見ましょう Atom:None Protein:Solid ribbon Colored by Secondary Type

22 構造の評価 : Verify3D PROCHECK PROSA 構築したモデル構造を評価しましょう Protocols Analysis Verify Protein (Profiles-3D) をダブルクリック右下の Verify Protein タブで設定が自動で以下になっていることを確認 Input

Eisenberg, Science253, 164-170 (1991), A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure R.A. Laskowski, M.W.

22 22 構造の評価 : Verify3D PROCHECK PROSA 構築したモデル構造を評価しましょう Protocols Analysis Verify Protein (Profiles-3D) をダブルクリック右下の Verify Protein タブで設定が自動で以下になっていることを確認 Input Protein Molecule: T0225.B : T0225.B 実行 J.U. Bowie, R. Luthy, D. Eisenberg, Science253, (1991), A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure R.A. Laskowski, M.W. MacArthur, D.S. Moss, J.M. Thornton, J. Appl. Cryst.26, (1993), PROCHECK: a program to check the stereochemical quelity of protein structures M.J. Sippl, Proteins 17, (1993), Recognition of Errors in Three-Dimensional Structures of Proteins

20 秒ほど実行されたのち終了します 23 Jobs から Verify Protein (P,,, をダブルクリックし開いた Html ウィンドウから T0225.B99990001.

23 20 秒ほど実行されたのち終了します 23 Jobs から Verify Protein (P,,, をダブルクリックし開いた Html ウィンドウから T0225.B msv をクリックし結果を表示してみましょう 3D window の下のスクロールバーを右端までスクロールすると Verify Score の欄が表示されます (100.67) 3D Window の下の方にデータが表示されていない場合 View Data Table にチェックを入れて表示させてください結果の表示を以下の様に変更してみましょう Ctrl + D 表示 (Display Style) の変更 Atom None Protein Solid Ribbon Display Size 0.5

24 24 構造は残基毎に以下の様に色分けされて表示されています良い - 青普通 - 白悪い - 赤それでは残基毎のスコアの図を作成してみましょう Amino Acid タブをクリック右にスクロールし Verify Score の列を選択 Chart Line Plot を選択右図の様なプロットが表示されます S < 0 悪い ( ミスフォールド!?) 0< S < 0.5 普通 0.5 < S 良い

25 25 RMSD を計算するそれでは答え (1VL0) とどれくらい近い構造が構築できたか RMSD を計算してみましょう (Verify3D ではなく ) 構築したモデルの 3D Window をアクティブにする File Insert From URL を選択 PDB ID に 1VL0 を入力し構造をダウンロード Cell の左の + で展開し Chain A 以外の B,C,Water などを選択し削除 Sequence Show Sequence を選択し配列を表示 T0225 の先頭に Space 一つ入力しアラインメントを合わせる X は MET の代わりに MSE の為 MSE = SELENOMETHIONINE

26 3D Window で chain A をアクティブにする Structure

:Ca stick 参考までにリガンドがある場合それを含めてモデリングすると (Build

26 26 3D Window で chain A をアクティブにする Structure Superimpose By Sequence Alignment を選択 T0255,,, を選択し OK をクリック Text Window が表示され 280 残基を用いて RMSD が 2.18 と表示されました表示を変えると構造がどれくらい似ているか見やすくなります表示 :Ca stick 参考までにリガンドがある場合それを含めてモデリングすると (Build Models の設定で Copy Ligands???) RMSD Verify Score などが改善されます

Homology,,, をダブルクリック Input Files から以下の 2 つのファイルを開いてください 1N2S.

27 27 アラインメントの修正 Window Close All で全ての Window を閉じてくださいアラインメントを修正してより良いモデルを構築してみましょう Jobs タブから先程実行した Build Homology,,, をダブルクリック Input Files から以下の 2 つのファイルを開いてください 1N2S.pdb Similarity_Sequence Alignment.bsml Gap(-) を全て削除してからアラインメントを以下の様に修正してください

先程と同様にモデル構築を行い Verify Score RMSD を計算してみてくださいモデル構築 Protocols Protein Modeling Build Homology

Template Structures 1N2S Cut Overhangs - False 実行 Verify Score 計算 Protocols Analysis Verify

Sequence Alignment アラインメントの修正により以下の様にモデルが改良されました Verify Score: 100.67 102.04 RMSD: 2.18 1.

28 先程と同様にモデル構築を行い Verify Score RMSD を計算してみてくださいモデル構築 Protocols Protein Modeling Build Homology Models Input Sequence Alignment - Similarity Sequence Alignment Input Model Sequence T0225 Input Template Structures 1N2S Cut Overhangs - False 実行 Verify Score 計算 Protocols Analysis Verify Protein (Profiles-3D) 構造を選択し実行 RMSD 計算答え (1VL0) を挿入アラインメントを合わせる Structure Superimpose By Sequence Alignment アラインメントの修正により以下の様にモデルが改良されました Verify Score: RMSD: BLAST アラインメントでの二次構造 PSIPREDの二次構造予測 28 修正したアラインメントでの二次構造アラインメントの修正は Verify3D スコアの低い部分および二次構造予測に基づく修正が功を奏しています

29 29 フォールド認識法 Threading など Web で顔写真を探して下さい K. Ginalski これまでは BLAST PSI-BLAST 等による相同性検索を用いて主に近縁の配列を検索しその鋳型アラインメントを基にモデル構築をおこないましたがマルチプルアラインメントプロファイル (PSSM) を有効に用いたり構造配列相関を用いることによりより遠縁の鋳型を検索することができますこれらフォールド認識法を用いた多くのサーバーが存在します 3D-PSSM, FUGUE2, Sam-T02, mgenthreader などさらにそれらいくつかのサーバーのメタサーバー ( コンセンサス予測をする ) もあります 3D-Jury [URL] やはり時代はコンセンサス!? CASP7 では FR,NF とも構築した構造をもう一度データベース情報を基に探すと良い構造が見つかった様です K. Ginalski et al., Bioinformatics19, (2003), 3D-Jury: a simple approach to improve protein structure predictions

30 ab initio / de novo 予測法 Fragment Assembly 法 Web で顔写真を探して下さい D. Baker 鋳型構造がないつまり新規フォールドの予測に関して PSSM 相関等で集めた部分構造 ( フラグメント ) を利用するフラグメントアセンブリ法が主流です D. Baker が普及させました (Rosetta 法 ) ROBETTA = Robot + Rosetta [URL] 30 立体構造予測においてプロファイル (PSSM) は大変重要です K.T. Simons et al., J. Mol. Biol.268, (1997), Assembly of protein tertiary structures from fragments with similar local sequences using simulate anealing and Bayesian scoring functions D. Chivian et al., Proteins53, (2003), Automated prediction of CASP-5 structures using the Robetta server

:Rosetta@home SETI, folding@home の次!? [URL] http://boinc.bakerlab.org/rosetta/ Web で顔写真を探して下さい Baker & ROKKY T0281(1WHZ) CE none DALI 1cb1 47 RMSD=3.15959 VAST 1DQ3 52 RMSD GDT_TS a.a. NF T0201 6.

31 CASP での歴史的な予測 BAKER group: T0281 in CASP6 BAKER group は FR/A のターゲット T0281 を鋳型に基づかない ab initio / de novo 予測で RMSD=1.59A という成功を収めましたしかし BAKER group でも NF FR/A のターゲット (25 個 ) に対する予測は数個の良い予測 (RMSD<5A ) はあるものの半分以上が RMSD>10A というのが現状ですちなみに T0281(1WHZ) の構造比較を行うと上記の成功は素晴らしいことがわかります Baker はデザインでも精力的な研究を行っています最近の話題 :Rosetta@home SETI, folding@home の次!? [URL] Web で顔写真を探して下さい Baker & ROKKY T0281(1WHZ) CE none DALI 1cb1 47 RMSD= VAST 1DQ3 52 RMSD GDT_TS a.a. NF T T0209_ T0216_ T0216_ T T0241_ T0241_ T T0248_ FR/A T T0199_ T0209_ T T T T0235_ T0239_ T0248_ T0248_ T0262_ T0272_ T0272_ T T0280_ T O. Schueler-Furman, et al., Science310, (2005), Progress in modeling of protein structures and interactions B. Kuhlman, et al, Science302, (2003), Design of a Novel Globular Protein Fold with Atomic-Level Accuarcy

32 課題 3 ホモロジーモデリング T0229 のホモロジーモデリングを行い結果を PowerPoint にまとめよ 1. 実習のリンクページからターゲットの配列 (T0229.fasta) をダウンロード 2. PSI-BLAST 検索を実行する 3. 答え (1VLA) 以外の一致度の高い鋳型を用いてモデル構築を行う 4. 構造の評価 (Verify3D) を行う 5. 答えとの RMSD を計算する (N 末端 His の 6 残基が余分 ) 6. 上記を図 (Blast の Map View Verify3D の Line Plot 重ね合わせた図 ( 赤青 Ca stick)) および値 (E-value Verify Score RMSD) などを含めて PowerPoint に記述する ( アラインメントの修正の必要はありません ) 32

33 33 課題 4 二次構造予測 1CSP の二次構造予測を行い結果を PowerPoint にまとめよ 1. コールドショックプロテイン (PDB ID: 1CSP) をダウンロードし配列をコピー 2. NPS@ サイト ([URL] s.html ) に貼り付けコンセンサス二次構造予測をする 3. PowerPoint で予測結果を答えと比較し正答率等を含めて記述する

34 34 < 課題の提出 > 上記課題 3 課題 4 を PowerPoint で 2 ページにまとめる PowerPoint ファイルを添付し Subject( 件名 ) を課題 : ホモロジーモデリング二次構造予測とし本文に学席番号講義用 ID 氏名等記入しで以下のメールアドレスへ送信する address: tadaomi@iu.a.u-tokyo.ac.jp

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Microsoft PowerPoint - LiteracyI web.ppt 東京大学農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス人材養成プログラムバイオインフォマティクスリテラシー I 平成 18 年 6 月 5 日 ( 月 ) 7 日 ( 水 ) @ 農学部 2 号館化学第一講義室立体構造予測 II 二次構造予測立体構造予測 ( ホモロジーモデリング ) など [Web 版 ] 東京大学農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス人材養成ユニット特任助手古田忠臣