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ひさともむこやま
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1 東京大学農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス人材養成プログラムバイオインフォマティクスリテラシー I 平成 18 年 6 月 5 日 ( 月 ) 7 日 ( 水農学部 2 号館化学第一講義室立体構造予測 II 二次構造予測立体構造予測 ( ホモロジーモデリング ) など [Web 版 ] 東京大学農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス人材養成ユニット特任助手古田忠臣

2 講義の予定構造類似性配列類似性 1D 検索 2D 予測 3D 予測 5 月 29 日 ( 月 ) 31 日 ( 水 ) 構造データベース :PDB 構造分類データベース :SCOP CATH 構造比較サーバー :CE DALI/FSSP VAST 相同性検索 :BALST PSI-BLAST FASTA CLUSTALW 6 月 5 日 ( 月 ) 7 日 ( 水 ) 二次構造予測 :PSIPRED PHDsec PREDETOR NPS@ 立体構造予測参考 :CASP 比較モデリング法ホモロジーモデリング :MODELLER SWISS-MODEL フォールド認識法 :meta server (3D-Jury) de novo / ab initio 予測法 : Robetta など

3 タンパク質立体構造予測とは? アミノ酸配列情報 ( 一次構造情報 ) 問題を基に物理化学的情報科学的手法を用いてそのタンパク質の立体構造 ( 三次構造情報 ) 答えを予測する問題一次構造 : アミノ酸配列例 ) MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAAT AEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDA TKTFTVTE 答え三次構造 : タンパク質立体構造例 ) 下図二次構造 :α へリックス β ストランドコイル ( ターン ) 創薬など公益性の高い分野に応用されている四次構造 : 複合体超分子

( 参考 ) CASP: 聖杯の探索 (The Search for the Holy Grail) Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction タンパク質立体構造予測の国際コンテスト [URL] http://predictioncenter.gc.ucdavis.

4 ( 参考 ) CASP: 聖杯の探索 (The Search for the Holy Grail) Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction タンパク質立体構造予測の国際コンテスト [URL] 2 年に一度開催される X 線解析 NMR 解析の実験研究者からその年構造が決定されるタンパク質のアミノ酸配列問題が提供される Human は約 3 週間 Server は 48 時間で構造を予測しモデルを 5 つまで提出年末の会議で GDT_TS 等のスコアで予測構造を決定された構造答えと比べて評価他ドメイン予測機能予測などもある CASP1 CASP2 CASP3 CASP4 CASP5 CASP6 CASP7 Year Targets 33 42/42 (T0001-T0042) 43/42 (T0043-T0085) 43/62 (T0086-T0128) 67/67 (T0129-T0195) 64/87 (T0196-T0282) (T0283- ) Predictors Web で肖像画を探して下さい Leonardo da Vinci 実践バイオインフォマティクスゲノム研究のためのコンピュータスキルオライリージャパン節 CASP: 聖杯の探索 Web で絵画を探して下さい The Last Supper

5 問題の分類難易度易難比較モデリング法 Comparative modeling (CM) Easy(BLAST) Hard(PSI-BLAST) フォールド認識法 Fold recognition (FR) Homologous Analogous 新規フォールド New fold (NF) de novo / ab initio 予測法 de novo / ab initio prediction Homology Based Modeling Non-homology Modeling Template-based modeling 如何に良い鋳型 (template) 構造を検索し良いアラインメントを得るか! Template-free modeling

6 構造モデル構築に用いる主な手法ツール CM( 比較モデリング ) Homology ホモロジーモデリング search BLAST, PSI-BLAST, FASTA, SSEARCHなど Model building MODELLER, SWISS-MODELなど Secondary 二次構造予測 structure prediction PHDsec,PSIPRED,NNPREDICT,Jpred, NPS@ など TransMembrane region prediction SOSUI, MEMSAT, TMHMM, PHDhtmなど Domain search / parsing Pfam, ProDom, TIGRFAM, RPS-BLAST/CDD など Motif(s)/block(s) search PROSITE, BLOCKSPRINTS など ( 以下上記情報を用いる ) FR( フォールド認識 ) Threading 3D-PSSM, FUGUE2, mgenthreader など Consensus meta server (3D-Jury) Model building MODELLER, SWISS-MODEL など NF( 新規フォールド ) Fragment Assembly ROBETTA, ProtInfo, ROKKY など

二次構造平行 β シート 1. DS1.5 で File Open URL 2GB1 2. Chart Ramachandran plot 3.

7 二次構造平行 β シート 1. DS1.5 で File Open URL 2GB1 2. Chart Ramachandran plot 3. Chart Contact plot 逆平行 β シート α L PDB ID: 2GB1 Schematic 表示 α R へリックス ( ) 他 π ヘリックス ( ) 3 10 ヘリックス Ramachandran plot 1 13 Contact map 対角線との関係付近 : へリックス垂直 : 逆平行 β シート平行 : 平行 β シート L. Pauling, R.B. Corey, PNAS37, (1951), Atomic coordinates and structure factors for two helical configuratoins of polypeptide chains G.N. Ramachandran, C. Ramakrishnan, V. Sasisekharan, J. Mol. Biol.7, (1968), Stereochemistry of Polypeptide Cahin Configuration

二次構造予測 : Chou-Fasman, GOR, NN,,, Chou-Fasman 法 1974 15タンパク質から二次構造頻度 P α P β を計算しそれを基にある閾値以上をα(4/6) β(3/5) と予測する精度 :50-60% GOR(Garnier,Osguthorpe,Robson) 法 1978 17 残基のWindowで配列をスキャンしその情報量を基に

8 二次構造予測 : Chou-Fasman, GOR, NN,,, Chou-Fasman 法タンパク質から二次構造頻度 P α P β を計算しそれを基にある閾値以上をα(4/6) β(3/5) と予測する精度 :50-60% GOR(Garnier,Osguthorpe,Robson) 法残基のWindowで配列をスキャンしその情報量を基に中心のアミノ酸の二次構造 (α( 連続 4) β( 連続 2) ) を予測精度 : 約 65% ニューラルネットワーク (NN) 法残基のWindowでNNを学習させ二次構造 (α β コイル) を予測 NNPREDICT Kneller et al PHD Rost, Sander 1993 PSIPRED Jones % (H) 最近接法 PREDATOR Frishman, Argos 1995 NN, HMM, SMV の講義ゲノム知識情報処理論 ( 麻生川先生 ) Web で顔写真を探して下さい D. Jones P.Y. Chou, G.D. Fasman, Biochemistry13, (1974), Prediction of Protein Conformation J. Garnier, D.J. Osguthorpe, B. Robson, J. Mol. Biol.120, (1978), Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins N. Qian, T.J. Sejnowski, J. Mol. Biol.202, (1988), Predicting the secondary structure of globular proteins using neural network models D.T. Jones, J. Mol. BIol.292, (1999), Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices (E) (C)

9 二次構造予測 : NNPREDICT [URL] 先程の 2GB1 の配列を表示し Sequence Show Sequence 配列を選択して右クリックでコピー NNPREDICT サイトで配列を貼り付け Submit

10 予測結果と答えとを比較予測結果予測 :MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE 答え :MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE 正答率 :37/56=0.66 DS1.5 の配列上で右クリック Secondary Structure Cartoon を選択し答えを表示

二次構造予測 : ( コンセンサス予測 ) NPS@ [URL] http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?

11 二次構造予測 : ( コンセンサス予測 ) NPS@ [URL] NPS@ サイトを開き先程と同様に 2GB1 の配列を貼り付けて MLRC DSC GORIV PHD PREDATOR にチェックを入れ SUBMIT をクリックして下さい

12 予測結果と答えとを比較予測 :MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE 答え :MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE 正答率 :47/56=0.83 一般にコンセンサスを取るほうが良い予測になります時代はコンセンサス!

13 ホモロジーモデリング ( 比較モデリング ) 問い合わせ配列に対してデータベースを用いて配列解析を行い検索された鋳型アラインメントを基に立体構造を構築することをホモロジーモデリング ( 比較モデリング ) と言います問い合わせ配列配列解析 PSI-BLAST などモデル構築 MODELLER などデータベース PDB などモデルの評価 Verify3D など立体構造

ホモロジーモデリングの標準的なツール MODELLER SWISS-MODEL MODELLER [URL] http://www.salilab.org/modeller/ ダウンロードして手元で実行力場 :CHARMM22 SWISS-MODEL [URL] http://swissmodel.expasy.

14 ホモロジーモデリングの標準的なツール MODELLER SWISS-MODEL MODELLER [URL] ダウンロードして手元で実行力場 :CHARMM22 SWISS-MODEL [URL] First Approach mode メールアドレス名前タイトル配列を入力し Normal mode をチェックして Send Request をクリック入力したメールアドレスにモデル構造 (PDB) が送信される力場 :GROMOS96 Web で顔写真を探して下さい A. Sali A. Sali, T.L. Blundell, J. Mol. Biol.234, (1993), Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints M.C. Peitsch, Biochem. Soc. Trans.24, (1996), ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modelling

15 CASP6 のターゲット :T0225 のモデル構造をホモロジーモデリングにより構築してみましょう 1 配列の表示講義のリンクページからファイル T0225.fasta をクリックしデスクトップなどに保存 DS1.5 で File Open を選択し今保存した T0225.fasta を開く ( ファイル名が表示されない時は直接ファイル名を入力してみて下さい )

16 2BLAST プロトコルを開く Protocols Explorer が表示されていない方は View Explorers Protocols を選択 Protocols Explorer の Discovery Studio Protein Modeling フォルダを左の + をクリックして開く BLAST をダブルクリック右下に BLAST プロトコルのパラメータ設定タブが開きます同時に左下に Help Jobs のタブも開きます

17 3 相同性検索 BLAST の実行設定を配列を T0225:T0225 データベースを PDB E-value を 0.01 出力配列数を 25 と変更して BLAST を実行して下さい Job( 検索 ) が始まり 20 秒ほどで終了します OK をクリック

18 注意他の設定は変更しないで下さいそのままの設定では BLAST 検索結果から構造が上手くダウンロードできませんので以下の様に設定を変更して下さい Edit Preferences を選択 Files Explorer の左の + をクリック PDB Location をクリック Web Site をから pdb.rcsb.org を選択設定が変更できたので OK を選択

19 4 アラインメントを表示し鋳型構造をダウンロードする相同性検索の結果がスコアで色分けされて表示されます Blast Window の Table View をクリックする 1VL0 は答えなので 1KC1:A を鋳型に選びましょう複数の鋳型を選択することもできます 1KC1_A を選択し右クリックで Load Structure and Alignment を選択する

20 5 構造とアラインメントの修正構造がダウンロードされ 1KC1 3D Window アラインメントが表示されます Structure Sequence Alignment - Sequence Window <Chain> や Water を削除し chain A のみにして下さい鋳型の配列名を右クリックし Rename Sequence を選択し 1KC1 から 1KC1_A に変更して下さい

Structure Sequence Alignment を選択する同時に以下の様に変更される

21 6 モデル構築の実行 Protocols Explorer から Build Models をダブルクリック右下の Build Models タブから設定を Alignment - Structure Sequence Alignment を選択する同時に以下の様に変更される Model Sequence T0225 Protein Structures - 1KC1_A 設定ができたのでモデル構築を実行

22 Job が実行され 4,5 分で終了するさて何人上手く実行できるでしょうか?

23 構築された構造の表示左下の Jobs タブから Build Models をダブルクリック Files Explorer の BuildModels_,,, の Output の左の + をクリック T0225.B msv をダブルクリック

構造の評価 : Verify3D PROCHECK PROSA 構築したモデル構造を評価しましょう Protocols Analysis Verify Protein をダブルクリック右下の Verify Protein タブで設定で以下を選択 Protein Structure T0225.B99990001:,,, 実行 J.U. Bowie, R. Luthy, D.

24 構造の評価 : Verify3D PROCHECK PROSA 構築したモデル構造を評価しましょう Protocols Analysis Verify Protein をダブルクリック右下の Verify Protein タブで設定で以下を選択 Protein Structure T0225.B :,,, 実行 J.U. Bowie, R. Luthy, D. Eisenberg, Science253, (1991), A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure R.A. Laskowski, M.W. MacArthur, D.S. Moss, J.M. Thornton, J. Appl. Cryst.26, (1993), PROCHECK: a program to check the stereochemical quelity of protein structures M.J. Sippl, Proteins 17, (1993), Recognition of Errors in Three-Dimensional Structures of Proteins

20 秒ほど実行されたのち終了します終了すると結果が表示されます 3D window

(Display Style) の変更 Atom None Protein Solid

25 20 秒ほど実行されたのち終了します終了すると結果が表示されます 3D window の下のスクロールバーを右端までスクロールすると Verify Score の欄が表示されます (97.78) 結果の表示を以下の様に変更してみましょう Ctrl + D 表示 (Display Style) の変更 Atom None Protein Solid Ribbon Display Size 0.5 3D Window の下の方にデータが表示されていない場合 View Data Table にチェックを入れて表示させてください

26 構造は残基毎に以下の様に色分けされて表示されています良い - 青普通 - 白悪い - 赤それでは残基毎のスコアの図を作成してみましょう Amino Acid タブをクリック右にスクロールし Verify Score の列を選択 Chart Simple Line Plot を選択右図の様なプロットが表示されます S < 0 悪い ( ミスフォールド!?) 0< S < 0.5 普通 0.5 < S 良い

RMSD を計算するそれでは答え (1VL0) とどれくらい近い構造が構築できたか

Sequence を選択し配列を表示 T0225 の先頭に Space 一つ入力し

27 RMSD を計算するそれでは答え (1VL0) とどれくらい近い構造が構築できたか RMSD を計算してみましょう (Verify3D ではなく ) 構築したモデルの 3D Window をアクティブにする File Insert From URL を選択 1VL0 を入力し構造をダウンロード Chain A の他を選択し削除 Sequence Show Sequence を選択し配列を表示 T0225 の先頭に Space 一つ入力しアラインメントを合わせる X は MET の代わりに MSE の為 MSE = SELENOMETHIONINE

28 3D Window で chain A をアクティブにする Structure Superimpose Superimpose by Sequence Alignment を選択 T0255,,, を選択し OK をクリック Text Window が表示され 280 残基を用いて RMSD が 2.25 と表示されました表示を変えると構造がどれくらい似ているか見やすくなります参考までにリガンドを含めてモデリングすると (Build Models の設定で Copy Ligands 1KC1_A::NDP901) RMSD=2.20 Verify Score= に改善されます

Models をダブルクリック Input フォルダから以下の 2 つのファイルを開いてください

29 アラインメントの修正 Window Close All で全ての Window を閉じてくださいアラインメントを修正してより良いモデルを構築してみましょう Jobs タブから先程実行した Build Models をダブルクリック Input フォルダから以下の 2 つのファイルを開いてください 1KC1_A.pdb Structure Sequence Alignment.bsml アラインメントを以下の様に修正してください

先程と同様にモデル構築を行い Verify Score RMSDを計算してみてくださいモデル構築 Protocols Protein Modeling Build

Structures 1KC1_A 実行 Verify Score 計算 Protocols Analysis Verify Protein 構造を選択し実行 RMSD

Structure Superimpose Superimpose by Sequence Alignment アラインメントの修正により

30 先程と同様にモデル構築を行い Verify Score RMSDを計算してみてくださいモデル構築 Protocols Protein Modeling Build Models Alignment - Structure Sequence Alignment Model Sequence T0225 Protein Structures 1KC1_A 実行 Verify Score 計算 Protocols Analysis Verify Protein 構造を選択し実行 RMSD 計算答え (1VL0) を挿入アラインメントを合わせる BLAST アラインメントでの二次構造 PSIPREDの二次構造予測修正したアラインメントでの二次構造 Structure Superimpose Superimpose by Sequence Alignment アラインメントの修正により以下の様にモデルが改良されました Verify Score: RMSD: アラインメントの修正は Verify3D スコアの低い部分および二次構造予測に基づく修正が功を奏しています

31 フォールド認識法 Threading など Web で顔写真を探して下さい K. Ginalski これまでは BLAST PSI-BLAST 等による相同性検索を用いて主に近縁の配列を検索しその鋳型アラインメントを基にモデル構築をおこないましたがマルチプルアラインメントプロファイル (PSSM) を有効に用いたり構造配列相関を用いることによりより遠縁の鋳型を検索することができますこれらフォールド認識法を用いた多くのサーバーが存在します 3D-PSSM, FUGUE2, Sam-T02, mgenthreader などさらにそれらいくつかのサーバーのメタサーバー ( コンセンサス予測をする ) もあります 3D-Jury [URL] やはり時代はコンセンサス!? K. Ginalski et al., Bioinformatics19, (2003), 3D-Jury: a simple approach to improve protein structure predictions

32 ab initio / de novo 予測法 Fragment Assembly 法 Web で顔写真を探して下さい D. Baker 鋳型構造がないつまり新規フォールドの予測に関して PSSM 相関等で集めた部分構造 ( フラグメント ) を利用するフラグメントアセンブリ法が主流です D. Baker が普及させました (Rosetta 法 ) ROBETTA = Robot + Rosetta [URL] 立体構造予測においてプロファイル (PSSM) は大変重要です K.T. Simons et al., J. Mol. Biol.268, (1997), Assembly of protein tertiary structures from fragments with similar local sequences using simulate anealing and Bayesian scoring functions D. Chivian et al., Proteins53, (2003), Automated prediction of CASP-5 structures using the Robetta server

:Rosetta@home SETI, folding@home の次!? [URL] http://http://boinc.bakerlab.org/rosetta/ Web で顔写真を探して下さい (Baker & ROKKY) T0281(1WHZ) CE none DALI 1cb1 47 RMSD=3.15959 VAST 1DQ3 52 RMSD GDT_TS a.a. NF T0201 6.

33 CASP での歴史的な予測 BAKER group: T0281 in CASP6 BAKER group は FR/A のターゲット T0281 を鋳型を基づかない ab initio / de novo 予測で RMSD=1.59A という成功を収めましたしかし BAKER group でも NF FR/A のターゲット (25 個 ) に対する予測は数個の良い予測 (RMSD<5A ) はあるものの半分以上が RMSD>10A というのが現状ですちなみに T0281(1WHZ) の構造比較を行うと上記の成功は素晴らしいことがわかります Baker はデザインでも精力的な研究を行っています最近の話題 :Rosetta@home SETI, folding@home の次!? [URL] Web で顔写真を探して下さい (Baker & ROKKY) T0281(1WHZ) CE none DALI 1cb1 47 RMSD= VAST 1DQ3 52 RMSD GDT_TS a.a. NF T T0209_ T0216_ T0216_ T T0241_ T0241_ T T0248_ FR/A T T0199_ T0209_ T T T T0235_ T0239_ T0248_ T0248_ T0262_ T0272_ T0272_ T T0280_ T O. Schueler-Furman, et al., Science310, (2005), Progress in modeling of protein structures and interactions B. Kuhlman, et al, Science302, (2003), Design of a Novel Globular Protein Fold with Atomic-Level Accuarcy

34 課題 3 ホモロジーモデリング T0229 のホモロジーモデリングを行い結果を PowerPoint にまとめよ 1. 実習のリンクページからターゲットの配列 (T0229.fasta) をダウンロード 2. BLAST 検索を実行する 3. 答え (1VLA) 以外の一致度の高い鋳型を用いてモデル構築を行う 4. 構造の評価 (Verify3D) を行う 5. 答えとのRMSDを計算する 6. 上記を図も含めて PowerPointに記述する

35 時間に余裕がある方は以下の課題を行って下さい課題 4 二次構造予測 1CSP の二次構造予測を行い結果を PowerPoint にまとめよ 1. コールドショックプロテイン (PDB ID: 1CSP) をダウンロードし配列をコピー 2. NPS@ サイト ([URL] s.html ) に貼り付けコンセンサス二次構造予測をする 3. PowerPoint で予測結果を答えと比較し正答率等を含めて記述する

36 < 課題の提出 > 上記課題 3 ( 時間に余裕がある方は課題 4 ) を PowerPoint で 2 ページまでにまとめる PowerPoint ファイルを添付しで以下のメールアドレスへ送信する address: tadaomi@iu.a.u-tokyo.ac.jp

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Microsoft PowerPoint - LiteracyI web.ppt 1 東京大学大学院農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス人材養成プログラムバイオインフォマティクスリテラシー I 平成 19 年 6 月 4 日 ( 月 ) 7 日 ( 木 ) @ 農学部 2 号館化学第一講義室立体構造予測 II 二次構造予測立体構造予測 ( ホモロジーモデリング ) など東京大学大学院農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス人材養成ユニット特任助教古田忠臣