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しなつくまじ
5 years ago
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1 メダカのウロコの骨芽細胞及び破骨細胞に対する静的及び動的な過重力応答矢野幸子 (JAXA) 鈴木信雄北村敬一郎佐藤雄亮関口俊男中島廣志早川和一笹山雄一 ( 金沢大学 ) 服部淳彦中野真樹( 東京医科歯科大学 ) 池亀美華坂本竜哉( 岡山大学 ) 大森克徳( 亜細亜大学 ) 千葉篤彦( 上智大学 ) 江尻貞一( 朝日大学 ) 高垣裕子 ( 神奈川歯科大学 ) 三島弘幸( 高知学園短期大学 ) 舟橋久幸( 昭和大学 ) Zoological Science Award 2014 受賞論文 Yano, S., Kitamura, K., Satoh, Y., Nakano, M., Hattori, A., Sekiguchi, T., Ikegame, M., Nakashima, H., Omori, K., Hayakawa, K., Chiba, A., Sasayama, Y., Ejiri, S., Mikuni-Takagaki, Y., Mishima, H., Funahashi, H., Sakamoto, T. and Suzuki, N.: Static and Dynamic Hypergravity Responses of Osteoblasts and Osteoclasts in Medaka Scales. Zool. Sci., 30: (2013) はじめに骨には骨を形成する骨芽細胞と骨を壊す破骨細胞が共存しており体内のミネラルの恒常性を保つため常に骨形成と骨吸収のリモデリングを繰り返しているまた宇宙を含め骨格への負荷がない状態では骨芽細胞の活性低下によって骨形成が低下することが報告されているしかしながら破骨細胞の作用については結果に一致を欠いており (Carmeliet et al., 2001) 特に破骨細胞の重力応答については不明な点が多くその応答を調べる為の優れたモデル系が切望されている一方硬骨魚類において骨とウロコがカルシウムの貯蔵庫であるが放射性同位元素 ( 45 Ca) による研究で椎骨ではなく主にウロコからカルシウムを出し入れしていることが報告されている (Mugiya and Watabe, 1977) このことは魚類のカルシウム調節においてウロコこそがヒトの骨と同様の役割を持つことを意味している硬骨魚のウロコの基本構造は I 型コラーゲンからなる線維層と I 型コラーゲンとハイドロキシアパタイトからなる骨質層 ( 石灰化層 ) の二層である (Bereiter-Hahn and Zylberberg, 1993) そして骨質層の表面に破骨細胞と骨芽細胞が共存しており添加的石灰化直接骨化骨代謝を行っている (Suzuki et al., 2008) またウロコに存在する破骨細胞は多核で波状縁も観察されヒトの破骨細胞と同様の組織構造と生理活性を持つことが示されている (Azuma et al., 2007) このようにウロコには 1シンプルな構造と石灰化様式を示す 2 破骨細胞はヒトと同様の細胞構造と活性を持つといった利点があるそこで本研究ではメダカのウロコに注目してアッセイ系を開発して静的及び動的な過重力応答の違いを解析した 1

メダカのウロコの骨芽細胞破骨細胞の形態観察メダカのウロコを 4% パラホルムアルデヒド溶液で化学固定し骨芽細胞のマーカーであるアルカリフォスファターゼ (ALP) と破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ (TRAP) の活性染色を行ったその結果を図 1に示す Aは ALP 陽性細胞 Bは TRAP 陽性細胞を示すこのようにメダカのウロコには

メダカのウロコを用いたバイオアッセイ系の開発メダカのウロコは小さいのでウロコ 1 枚で ALP 活性 ( 骨芽細胞活性 ) と TRAP 活性 ( 破骨細胞の活性 ) を測定することは難しいそこでメダカ体表の片面 ( 左側 ) から採取した全てのウロコを実験群とし反対側 ( 右側 ) から採取した全てのウロコを対照群として用いたこれら片面のすべてのウロコを 1.

2 メダカのウロコの骨芽細胞破骨細胞の形態観察メダカのウロコを 4% パラホルムアルデヒド溶液で化学固定し骨芽細胞のマーカーであるアルカリフォスファターゼ (ALP) と破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ (TRAP) の活性染色を行ったその結果を図 1に示す Aは ALP 陽性細胞 Bは TRAP 陽性細胞を示すこのようにメダカのウロコには骨芽細胞と破骨細胞が共存していることが判明したそこで次にウロコ図 1メダカのウロコのアルカリフォスファターゼ (ALP)(A) 及び酒を用いたバイ石酸抵抗性酸フォスファターゼ (TRAP)(B) 染色オアッセイ系 A: 矢印は ALP 陽性細胞を示す Bar: 100 m の開発を行っ B: 矢頭は単核の TRAP 陽性細胞矢印は多核の TRAP 陽性細胞を示たす Bar: 100 m メダカのウロコを用いたバイオアッセイ系の開発メダカのウロコは小さいのでウロコ 1 枚で ALP 活性 ( 骨芽細胞活性 ) と TRAP 活性 ( 破骨細胞の活性 ) を測定することは難しいそこでメダカ体表の片面 ( 左側 ) から採取した全てのウロコを実験群とし反対側 ( 右側 ) から採取した全てのウロコを対照群として用いたこれら片面のすべてのウロコを 1.5ml チューブに入れ蒸留水を加えて超音波破砕したその上清中の TRAP 及び ALP 活性をタンパク質当たりの比活性で算出したその結果左右のウロコの ALP 及び TRAP 活性には差はないことがわかった ( 図 2) 図 2 左右のウロコの ALP 活性 (A) 及び TRAP 活性 (B) メダカのウロコに対する静的及び動的な過重力応答の解析開発した系を用いて遠心機による静的及び加速度負荷装置 ( バイブレーション負荷装 2

3 置 ) による動的な過重力への応答を解析した遠心機またはバイブレーション装置により 2 3 4G の強度で 10 分間負荷後 6 または 24 時間培養し細胞活性を測定したその結果またメダカのウロコは静的な遠心機の過重力及び動的なブレーションの加速度重力にも非常によく応答することが判明した即ち骨芽細胞の活性は 2~4G において遠心とバイブレーションの両方で有意に上昇した一方破骨細胞の活性は 2 3G では遠心とバイブレーションの両方で有意に減少したがバイブレーションによる 4G 負荷では上昇したこれは骨芽細胞の活性が 4G において顕著に上昇したことに起因する可能性があるそこで骨芽細胞と破骨細胞の相互作用に関与する遺伝子の発現を解析した Receptor Activator of NF-κB Ligand (RANKL) は骨芽細胞で発現して破骨細胞の分化を促し骨吸収を促進する因子である (Teitelbaum, 2000) さらに Osteoprotegerin (OPG) は RANKL のデゴイ受容体であり RANKL と結合することにより骨吸収を抑制するしたがって RANKL と OPG を解析すれば骨芽細胞と破骨細胞の相互作用を調べることができるそこでメダカの RANKL(JN119285) の配列から RANKL のプライマーを設計した次にメダカの全アミノ酸配列を Genome to Protein Structure and Function Database (GTOP) を用いて検索しフグの OPG アミノ酸配列と最も相同性のある部分をメダカの OPG アミノ酸配列候補としたそして CLUSTAL X2 を用いて同一配列を検索し OPG 配列を推定してプライマーを設計した遠心機またはバイブレーション装置により 4G の強度で 10 分間負荷後 24 時間培養したメダカのウロコから total RNA isolation kit を用いて Total RNA を抽出し PrimeScriptTM RT reagent kit により cdna を合成しリアルタイム PCR 法によって RANKL と OPG の発現図 3 遠心機による静的な過重力とバイブレーション解析を行ったその結果による動的な過重力下での RANKL/OPG-like の比 RANKL の mrna 発現は遠心機による過重力では増加し *:p<0.05 なかったがバイブレーションによる加速度重力により有意に増加した RANKL と OPG-like mrna の比は遠心機による過重では差がなかったがバイブレーションによる加速度重力では対照群と比較して有意に高かった ( 図 3) 前述のように RANKL/OPG 比は骨吸収の指標として使われる (Teitelbaum, 2000) 加速度重力で骨芽細胞が顕著に活性化されたことが破骨細胞の活性を上昇させた可能性が高い 3

おわりにメダカは小型の硬骨魚で全ゲノム配列が解読されているしたがってメダカを用いて様々な生理現象を分子レベルで解析することが可能であるまたメダカは宇宙実験にも使われ 2012 年には国際宇宙ステーション ( 図 4) の日本の実験棟きぼうにおいてメダカを用いた長期飼育実験が実現したメダカを用いることにより

4 おわりにメダカは小型の硬骨魚で全ゲノム配列が解読されているしたがってメダカを用いて様々な生理現象を分子レベルで解析することが可能であるまたメダカは宇宙実験にも使われ 2012 年には国際宇宙ステーション ( 図 4) の日本の実験棟きぼうにおいてメダカを用いた長期飼育実験が実現したメダカを用いることにより骨芽細胞と破骨細胞の相互作用のメカニズムを過重力環境だけでなく微小重力環境でも分子レベルで解析することが可能になると考えられる本研究によりメダカのウロコを用いた新たな in vitro のアッセイシステムを開発することができさらに遠心機による静的および加速度負荷装置 ( バイブレーション負荷装置 ) による動的な過重力への違いも解析することができたしたがってメダカのウロコは宇宙での骨代謝モデルとなりうる可能性が示されたと言える日本の実験棟きぼう図 4 国際宇宙ステーション矢印 : 日本の実験棟きぼう Photo credit: NASA 引用文献 Azuma K, Kobayashi M, Nakamura M, Suzuki N, Yashima S, Iwamuro S, Ikegame M, Yamamoto T, Hattori A (2007) Two osteoclastic markers expressed in multinucleate osteoclasts of goldfish scales. Biochem Biophys Res Commun 362:

5 Bereiter-Hahn J, Zylberberg L (1993) Regeneration of teleost fish scale. Comp Biochem Physiol 105A: Carmeliet G, Vico L, Bouillon R (2001) Space flight: A challenge for normal bone homeostasis. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 11: Mugiya Y, Watabe N (1977) Studies on fish scale formation and resorption II: Effect of estradiol on calcium homeostasis and skeletal tissue resorption in the goldfish, Carassius auratus, and the killifish, Fundulus heteroclitus. Comp Biochem Physiol 57A: Suzuki N, Somei M, Seki A, Reiter RJ, Hattori A (2008) Novel bromomelatonin derivatives as potentially effective drugs to treat bone diseases. J Pineal Res 45: Teitelbaum SL (2000) Bone resorption by osteoclasts. Science 289:

Microsoft Word - 第2章鈴木様原稿0302.doc

Microsoft Word - 第2章鈴木様原稿0302.doc 第 2 章魚類のウロコを用いた宇宙生物学的研究金沢大学鈴木信雄北村敬一郎清水宣明染井正徳笹山雄一 JAXA 大森克徳矢野幸子重藤祐子谷垣文章 JSF 鈴木ひろみ嶋津徹岡山大学池亀美華富山大学田渕圭章高崎一朗和田重人近藤隆東京海洋大学遠藤雅人早稲田大学中村正久東京大学井尻憲一東京医科歯科大学田畑純奈良雅之服部淳彦 Fish Scale Study for Space Biology