連載 DDS 研究開発に有用な試薬蛍光標識試薬 Fluorescent labeling reagent 1. 背景蛍光イメージングは生きている状態のままの生体でリアルタイムかつ高い時空間分解能で生命現象を視ることが可能であるため生命科学研究および臨床医療においてなくてはならな

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くにひとさわなか
5 years ago
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1 連載 DD 研究開発に有用な試薬蛍光標識試薬 Fluorescent labeling reagent 1. 背景蛍光イメージングは生きている状態のままの生体でリアルタイムかつ高い時空間分解能で生命現象を視ることが可能であるため生命科学研究および臨床医療においてなくてはならない技術となっている例えばこの蛍光イメージングにおいてタンパク質や生体小分子などを蛍光標識試薬によって蛍光ラベルすることでその分子の生体内での挙動を可視化することができるさらに対象とする生体分子との化学反応によって励起波長蛍光波長蛍光強度などの蛍光特性が変化する蛍光プローブを用いることでさまざまな標的分子を観察することができる本稿では蛍光標識試薬に注目し蛍光試薬としては金属や半導体でできたナノスケールの粒子である Quantum Dot( 量子ドット ) や遺伝的に生体内に導入可能な蛍光タンパク質もあるが DD 研究において汎用される有機小分子の蛍光試薬について DD 研究において有用となる市販試薬の種類選択する場合に重要な要素入手できる試薬について解説する第 13 回 * 花岡健二郎るこの蛍光を検出することで細胞レベルおよび組織レベル個体レベルでの蛍光標識分子の生体内挙動を可視化することができるこの蛍光試薬の明るさは蛍光試薬のモル吸光係数および蛍光量子収率によって決まるが市販されている試薬はこれら要素が十分に高いため蛍光試薬の選択において重要なのは蛍光試薬の励起および蛍光の波長である ( 図 1) 例えば青色 (~400nm) 緑色 (~500nm) 赤色 (~570nm) 近赤外 (650~900nm) の光は分離可能であるためこれらの光をもつ蛍光色素を同時に使用することができるつまり単純に使用したい波長の蛍光試薬を選んで使用すればよいが一般に光の波長が長ければ長いほど自家蛍光が低く組織透過性は高い特に動物個体レベルでの蛍光イメージングを行う場合は生体組織から発せられる自家蛍光が低く光の組織透過性の高い近赤外励起光 ( 蛍光試薬が吸収する波長の光を照射 ) 蛍光色素領域の蛍光試薬が有用となる代表的な蛍光標識試薬である Alexa Fluor Dyes(ThermoFisher IETIFI 社 ) や ATT TE 蛍光色素 (ATT T E 社 ) DyLight シリーズ (ThermoFisher IETIFI 社 ) IRDye Infrared Dyes(LI R 社 ) TELLA Fluor TM シリーズ ( 五稜化薬 ( 株 )) について表 1 に示すこのように試薬メーカー各社さまざまな励起蛍光波長を示す蛍光色素のラインナップを揃えている 3. 蛍光色素の標識法市販されている蛍光試薬の多くは通常蛍光色素骨格のみではなく生体分子またはポリマー材料などに結合させるための反応性官能基をもった蛍光標識試薬である反応性官能基について以下に代表的な例を記す ( 図 2) 3 1. アミノ基 ( 2 基 ) の標識イソチオシアネート基やスクシミジルエステル基テトラフルオロフェニル (TFP) エステル基をもつ蛍光色素はタンパク質のリシン側鎖のアミノ基やラベル化したい分子のもつアミノ基と温和な条件でアミド結合を形成することができる蛍光 ( 蛍光試薬が発する蛍光の波長の光を検出 ) 2. 蛍光試薬の選択蛍光試薬は適切な光 ( 励起光 ) を照射することで蛍光が発せられ * Kenjiro anaoka 東京大学大学院薬学系研究科 Graduate chool of Pharmaceutical ciences, The University of Tokyo 蛍光色素の特性 : 極大吸収波長極大蛍光波長モル吸光係数蛍光量子収率図 1 蛍光色素に関わる重要な要素 Drug Delivery ystem 32 5,

2 表 1 代表的な蛍光標識試薬蛍光色素極大吸収波長 (nm) 極大蛍光波長 (nm) 蛍光色モル吸光係数 Alexa Fluor Blue 19,000 DyLight Blue 15,000 ATT Blue 24,000 DyLight Blue 70,000 Alexa Fluor Blue 34,000 Alexa Fluor Green / Yellow 16,000 ATT Blue 45,000 ATT Green 75,000 DyLight Green 70,000 TELLA Fluor TM Green 71,000 Alexa Fluor Green 71,000 ATT Green 90,000 ATT Green 80,000 ATT Yellow 115,000 ATT Yellow 110,000 Alexa Fluor Yellow 81,000 ATT Yellow 115,000 ATT Rho6G Yellow 115,000 ATT range 120,000 ATT range 120,000 Alexa Fluor range 104,000 Alexa Fluor range 150,000 DyLight range 150,000 ATT range 120,000 ATT Rho3B range 120,000 ATT Rho range / Red 120,000 ATT Rho range / Red 120,000 Alexa Fluor range / Red 91,000 ATT Thio range / Red 110,000 ATT Rho range / Red 120,000 Alexa Fluor Red 73,000 ATT Red 120,000 DyLight Red 80,000 ATT Rho Red 120,000 ATT Red 120,000 Alexa Fluor Red 138,000 ATT Far Red 150,000 ATT Far Red 120,000 ATT Rho Far Red 140,000 ATT Far Red 130,000 Alexa Fluor Far Red 239,000 Alexa Fluor Far Red 140,000 DyLight ear-i70,000 ATT ear-i50, Drug Delivery ystem 32 5, 2017

3 蛍光色素極大吸収波長 (nm) 極大蛍光波長 (nm) 蛍光色モル吸光係数 ATT ear-i20,000 Alexa Fluor ear-i39,000 TELLA Fluor TM ear-i30,000 DyLight ear-i50,000 ATT xa ear-i25,000 ATT ear-i60,000 Alexa Fluor ear-i32,000 ATT ear-i25,000 IRDye 680RD ear-i65,000 IRDye 680LT ear-i50,000 Alexa Fluor ear-i84,000 IRDye 700 Phosphoramidite ear-i70,000 ATT ear-i25,000 DyLight ear-i40,000 IRDye 700DX ear-i65,000 TELLA Fluor TM ear-ir 95,000 ATT ear-i20,000 Alexa Fluor ear-i92,000 ATT ear-i20,000 TELLA Fluor TM ear-i30,000 ATT ear-i20,000 Alexa Fluor ear-i40,000 DyLight ear-i20,000 IRDye 800R ear-i00,000 Alexa Fluor ear-i70,000 DyLight ear-i70,000 IRDye 800W ear-i40,000 IRDye 800 Phosphoramidite ear-i70,000 Alexa Fluor Dyes ( alexa-fluor/alexa-fluor-dyes-acrossthe-spectrum.html) ATT-TE 蛍光色素 ( DyLight シリーズ ( protein-labeling/fluorescentprotein-labeling/dylight-fluors-technology-product-guide.html) IRDye Infrared Dyes ( TELLA Fluor TM シリーズ ( Drug Delivery ystem 32 5,

4 4. 蛍光色素の蛍光強度の変化 (1) アミノ ( 2 ) 基の標識イソチオシアネート体スクシミジルエステル体 F F F F テトラフルオロフェニル (TFP) エステル体蛍光標識試薬を標識した生体分子やポリマー材料を集合させることで蛍光波長および蛍光強度が変化することがあるこのような蛍光特性の変化は単に標識した分子の動態を観察したいときには蛍光強度が低くならないように気をつける必要があるが一方でこれら蛍光変化をうまく利用することでより高い感度で標的生体分子を生体内で観察することが可能になる最後に蛍光標識分子の集合による蛍光特性の変化について以下に記す 4 1. 蛍光標識分子の集合による蛍 (2) チオール () 基の標識 2 I ヨードアセトアミド体マレイミド体 (3) クリックケミストリーによる標識 u 図 2 蛍光標識のための反応性基の例 2 光の消光蛍光色素を高濃度に集合させることで蛍光色素の蛍光強度を大きく減じさせることがある例えばこの現象はタンパク質やポリマー材料に多数の蛍光色素を結合させた場合にも起こるため 3) 蛍光色素のラベル化数については気をつける必要があるまた逆にリポソーム中に蛍光色素を高濃度で取り込ませることで蛍光色素の蛍光強度を大きく減じて 4) リポソームが壊れることによって蛍光が上昇する蛍光変化型リポソームにも利用することができる 3 2. チオール基 ( 基 ) の標識マレイミド基やヨードアセトアミド基をもつ蛍光色素はタンパク質のシステイン側鎖のチオール基やラベル化したい分子のもつチオール基と温和な条件で共有結合を形成させることができる 3 3. クリックケミストリーアジド基とアルキン基の銅 (I) (u + ) を触媒とした環化反応はクリックケミストリーと呼ばれ温和な条件で2つの分子を共有結合的に結合させることができる例えば生体分子に組み込まれたアジド基に対してアルキン基をもつ蛍光色素を結合させることでそれら生体分子の動態を蛍光イメージングすることができる 1) 現在ではアジド基およびアルキン基のクリック反応以外にも容易に生体内で共有結合を形成する反応が開発されている 2) 4 2. 蛍光色素間のエネルギー移動 (FRET) による蛍光変化 FRET(Förster resonance energy transfer) とは蛍光色素が標識された分子同士が十分に近づいた際に片方の蛍光色素の蛍光スペクトル ( ドナー ) ともう片方の蛍光色素の吸収スペクトル ( アクセプター ) に十分な重なりがある場合ドナー側の蛍光色素を励起した際アクセプター側の蛍光が観察される現象のことであるこれを利用することで集合体の蛍光色を変化させることが 428 Drug Delivery ystem 32 5, 2017

5 できる 5) 4 3. 脂溶性環境下で蛍光特性が変化する蛍光色素 BD や Prodan といった環境感受性蛍光色素と呼ばれる蛍光色素は膜成分中といった脂溶性環境下において強い蛍光を示し極性環境下において蛍光が低くなる性質をもつものや膜成分中の疎水性の度合いに応じて吸収蛍光の特性が変化する蛍光色素であるこれによってリポソームなどの脂溶性環境部分に分布することで強い蛍光を発することやそれら部位の脂溶性に応じて蛍光色を変化させることができる 6) 文献 1)Laughlin,. T., et al., cience, 320, (2008) 2)Patterson, D. M., et al., urr. pin. hem. Biol., 28, (2015) 3)Mcann, T. E., et al., Bioconjugate hem., 22, (2011) 4)Roberts, K. E., et al., J. Fluorescence, 13, (2003) 5)Peng,., et al., hem. Rev., 115, (2015) 6)Klymchenko, A.., Acc. hem. Res., 50, (2017) Drug Delivery ystem 32 5,

11550_RKL_タグ付抗体カタログp

11550_RKL_タグ付抗体カタログp 2 3 4 5 6 8 9 10 10 11 11 12 page2 page3 page4 page5 page6 page7 DyLight 蛍光標識試薬 DyLight Blue 405 (nm) 400/420 スペクトルモル吸光係数 (M 1 cm 2 ) 30K 使用目的蛍光顕微鏡フローサイトメトリー ELISA ウエスタンブロット検出 FRET ベースの解析など類似のスペクトルをもつ色素