Microsoft Word - TN_Inf200_Quant_PicoGreen_395180_V1_0_j.doc

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なおえいさか
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PicoGreen dsdna 定量試薬および RiboGreen RNA 定量試薬を用いた高速かつ簡単な DNA および RNA の定量 Infinite F2 および Infinite M2 を用いた蛍光強度測定はじめに DNA 定量微量の DNA を検出定量することはライブラリーを作成するための cdna 作成製剤工程での DNA 不純物の検出など

1 に相当する約 5 g/ml dsdna であるという制約があるさらにこの測定法では RNA ssdna dsdna を区別することができないほかの DNA 測定法は DNA 分子に対して蛍光色素が結合することを利用しているビスベンズイミド 33258 のような Hoechst 色素であれば DNA 濃度を 1 ng/ml まで検出定量することができる [1]

1 PicoGreen dsdna 定量試薬および RiboGreen RNA 定量試薬を用いた高速かつ簡単な DNA および RNA の定量 Infinite F2 および Infinite M2 を用いた蛍光強度測定はじめに DNA 定量微量の DNA を検出定量することはライブラリーを作成するための cdna 作成製剤工程での DNA 不純物の検出などさまざまな分野での生物学的応用にきわめて重要である核酸の濃度を測定する技術で最もよく使用されているのが 26 nm(a 26 ) の吸光度測定によるものであるしかしこの方法には相対が A 26 の.1 に相当する約 5 g/ml dsdna であるという制約があるさらにこの測定法では RNA ssdna dsdna を区別することができないほかの DNA 測定法は DNA 分子に対して蛍光色素が結合することを利用しているビスベンズイミドのような Hoechst 色素であれば DNA 濃度を 1 ng/ml まで検出定量することができる [1] もうひとつ別の蛍光色素結合法に Quant-iT TM PicoGreen dsdna 試薬を用いたものがあるこれは Hoechst 色素を用いた測定法の 4 倍以上のを有する [2] 本稿では蛍光マイクロプレートリーダー Tecan Infinite TM F2 または M2 を用いて測定溶液 2 l 中の dsdna わずか 2 pg を検出したことを報告する RNA 定量 cdna ライブラリーの作成逆転写 PCR Differential Display PCR のような最新の分子レベル技術には微量の RNA を高で検出できることが必要になる 26 nm での吸光度によって RNA を検出定量しようとするとシグナルに対するタンパク質の相対的寄与率や遊離ヌクレオチド操作に起因する汚染物質など DNA と同じ問題が浮かび上がってくる溶液中の RNA 濃度 4 g/ml に相当する 26 nm での OD は.1 であるこれと比較すると RiboGreen 試薬を用いた蛍光定量法では 1 ng/ml の RNA まで検出することが可能である代表的な蛍光マイクロプレートリーダーを使用すれば測定溶液 2 l 中の RNA 2 pg を検出することも可能である [3] RiboGreen キットの場合 2 種類の色素濃度を用いることによって直線範囲は 1 ng/ml から 1 g/ml までとなっている high-range 測定でおよそ 2 ng/ml から 1 g/ml まで low-range 測定で 1 ng/ml から 5 ng/ml までを検出する 1

2 上記のような希釈液を Tecan Infinite 2 シリーズで容易に測定可能である最適なゲイン関数を利用すると RNA 濃度 1 g/ml から 1 ng/ml までをひとそろいの希釈系列と同じ測定手順とを用いて測定することができ検出可能な RNA を最小にできる材料と方法 Infinite F2 フィルター方式検出システム (Tecan オーストリア ) Infinite M2 Quad4 Monochromator TM 検出システム (Tecan オーストリア) マイクロプレート 96 ウェル平底型黒色ポリスチロールマイクロプレート (Greiner Bio-One ドイツ ) 試薬および測定法試薬 Quant-iT PicoGreen 定量試薬 (Invitrogen カリフォルニア州 ) RiboGreen RNA 定量試薬およびキット (Invitrogen カリフォルニア州 ) 2 TE(Invitrogen カリフォルニア州) ラムダ-DNA 1 g/ml(invitrogen カリフォルニア州 ) ヌクレアーゼフリー水 (Fluka BioChemika スイス) 試薬調製 Quant-iT PicoGreen ヌクレアーゼフリー水で 2 TE バッファーを 1 TE バッファーに希釈するこの 1 TE バッファーを Quanto-iT PicoGreen 試薬ラムダ -DNA の希釈に用いるほかそれ自体も測定に用いたその都度調製する Quant-iT PicoGreen 試薬は 1 TE バッファーで 2 倍に希釈し室温暗所で保管する RiboGreen RNA を扱うにあたっては RNase フリーの作業環境が必要である RNase の混入を予防するため取り扱い時や全調製作業には清潔なディスポーザブル手袋と RNase フリー滅菌ディスポーザブルプラスチック製品を用いた RiboGreen RNA 定量キットのなかの 2 TE バッファーをヌクレアーゼフリー水で 1 TE バッファーに希釈した RiboGreen 試薬の希釈については実施するアッセイに応じたものとした具体的には low-range アッセイには RiboGreen 試薬原液を 2, 倍に希釈し high-range アッセイには RiboGreen 試薬原液を 2 倍に希釈して調製したどの溶液も光分解を避けるため数時間以内に使用することとするアッセイプロトコール Quant-iT PicoGreen DNA 定量法ラムダ-DNA 希釈系列を表 1 のとおりに作成したどの濃度のものも 1 l をウェルに分注し Quant-iT PicoGreen 水溶液 1 l を加えて最終的にアッセイ容積が 2 l となるようにしたブランクには TE バッファー 1 l と Quant-iT PicoGreen1 l との混合液を使用した測定不成功を回避するため希釈系列のそれぞれについて 3 つのレプリカを作成した室温暗所で 5 分放置したのち Infinite F2 および Infinite M2 でプレートを測定した # DNA 濃度 / ml DNA 濃度 / アッセイ (2 l) 1 1 µg 2 ng 2 5 ng 1 ng 3 25 ng 5 ng 4 5 ng 1 ng 5 1 ng 2 ng ng 5 pg 7 15 pg 3 pg 8 25 pg 5 pg 9 1 pg 2 pg 1 25 pg 5 pg 11 [ ブランク ] [ ブランク ] 表 1 1 TE バッファーによるラムダ -DNA の希釈系列 1-11 およびアッセイ容積 2 l あたりの DNA 量 RiboGreen RNA 定量法高濃度 RNA サンプルおよび低濃度 RNA サンプル (1 g/ml から 1 ng/ml までの ) を定量するためそれぞれにリボソーム標準 RNA 希釈系列を 1 TE を用いて作成した ( 表 2) 濃緑色の行は high-range RNA 濃度であることを示しており 2 倍希釈の RiboGreen を用いた一方淡緑色の行は low-range RNA 濃度であることを示しており 2, 倍希釈の RiboGreen 試薬を用いた各 RNA 希釈溶液 1 l に RNA 濃度に応じて対応する RiboGreen 試薬希釈液 1 l を加えた 2

3 # RNA 濃度 RNA 濃度 [ng/2 l アッセイ ] [ ブランク ] [ ブランク ] 表 2: 1 TE バッファーによるリボソーム標準 RNA の希釈系列 1-9 およびアッセイ容積 2 l あたりの RNA 量測定測定の設定 DNA の定量 RNA の定量のいずれも Infinite F2 および M2 とも同じ測定パラメータを選択した Infinite F2 については最適のゲイン関数を選択したためサンプルに応じて最高濃度の RNA/DNA が最大蛍光強度となった Measurement Infinite F2 パラメータ Ex wavelength Ex bandwidth Em wavelength Em bandwidth 設定 485 nm 2 nm 535 nm 25 nm Lag time µs Integration time 2 µs Number of reads 25 Measurement Infinite M2 パラメータ Ex wavelength Ex bandwidth Em wavelength Em bandwidth 設定 485 nm 9 nm 535 nm 2 nm Lag time µs Integration time 2 µs Number of reads 25 結果 Quant-iT PicoGreen dsdna 試薬を用いた DNA 定量 R 2 = DNA (ng/ml) DNA ,5,25,1, 図 1: Infinite F2 を用いて測定した 25 pg/ml から 1 g/ml の DNA 濃度は 3 反復の平均値からブランクを差し引いたものである R 2 = DNA (ng/ml) DNA ,5,25,1, 図 2: Infinite M2 を用いて測定した 25 pg/ml から 1 g/ml の DNA 濃度は 3 反復の平均値からブランクを差し引いたものである High low range pg/ml Infinite F2 1 ng/ml 1 2 Infinite M2 1 ng/ml 1 2 pg/ アッセイ表 2: Tecan i-control TM ソフトウェアを用いた Infinite F2 および Infinite M2 での蛍光強度測定パラメータ表 3: high-low range の DNA 測定をめぐる Infinite M2 および F2 のを pg/ml と pg/ アッセイ容積 (2 l) で表示した 3

4 RiboGreen 試薬を用いた RNA 定量 5 RNA R 2 =, RNA 図 3: Tecan Infinite F2 を用いた高濃度および低濃度からなる希釈系列ひと揃いの RNA 濃度 1 ng/ml から 1 ng/ml までの RNA を測定した表のは 3 反復の平均値からブランクを差し引いたものである 5 RNA R 2 = RNA 図 4: Tecan Infinite M2 を用いた高濃度および低濃度からなる希釈系列ひと揃いの RNA 濃度 1 ng/ml から 1 ng/ml までの RNA を測定した表のは 3 反復の平均値からブランクを差し引いたものである High low range pg/ml pg/ アッセイ Infinite F2 1 ng/ml 15 3 Infinite M2 1 ng/ml 2 4 表 4: High-low range をめぐる RNA 測定に対する Infinite M2 および F2 のを pg/ml と pg/ アッセイ容積 (2 l) で表示した考察微量の DNA や RNA を検出定量することがさまざまな生物学的応用に必要となっているしかし最もよく用いられている吸光度測定法には検出限界がおよそ 5 g/ml であるという欠点がある微量の RNA および DNA を測定鑑別するため蛍光核酸結合色素を用いた 2 種類の検出法を試験した Quant-iT PicoGreen 試薬を用いて DNA を RiboGreen 試薬を用いて微量の RNA を測定したのである Invitrogen によれば Quant-iT PicoGreen の検出限界は代表的な蛍光マイクロプレートリーダーを使用した場合アッセイ容積 2 l で DNA 25 pg であるとしているさらに有意性の高い結果を得るには DNA の高濃度域と低濃度域とを別に測定することを推奨しているしかし Tecan Infinite F2 および Tecan Infinite M2 Quant-iT PicoGreen キットを組み合わせて使用したところ DNA の高濃度域から低濃度域にまたがるひと揃いの希釈系列で DNA を容易に測定することができた Inifinite 2 のいずれの機種も記載されているよりもが高くアッセイ容積 2 l で DNA 2 pg であったさらにこのふたつのは 1 g/ml から低いものでは 1 ng/ml までのひと揃いの希釈系列のみによりごく微量の RNA を測定したところアッセイ容積あたり RNA 3-4 pg のを得たのである一連の測定操作のみにより高濃度域から低濃度域までの DNA や RNA を検出することができるという Tecan Infinite 2 シリーズのこのような長所によって貴重な作業時間や一層重要な RNA や DNA のサンプルを節約することが可能となる結論幅広い濃度で微量の dsdna や RNA を検出定量するため Tecan Infinite 2 シリーズを用いて蛍光強度測定を実施したところ高で正確な測定結果が得られた略語の一覧 FI ds ss 蛍光強度二本鎖一本鎖相対蛍光単位 2 TE 2 mm トリス塩酸 2 mm EDTA ph 7.5 4

5 参考文献 [1] Labarca C and Paigen K: A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure. Analytical Biochemistry, 12, (198) [2] Singer VL et al.: Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry, 249, (1997) [3] Jones LJ et al.: RNA quantitation by fluorescence-based solution assay: RiboGreen reagent characterization. Analytical Biochemistry, 265, (1998) Tecan Group Ltd. は本稿に正確かつ最新の情報を記載するよう努力していますが遺漏や誤りがないとは限りませんこのため本稿にある情報の正確性完全性について Tecan Group Ltd. は明示的であれ黙示的であれ一切の言明も保証も致しません本稿を随時予告なく変更することがありますこのなかで言及した商標はいずれも法律により保護されています本稿に記載されている仕様の技術的詳細および操作の詳細については最寄の Tecan 販売店にご連絡ください本稿は市場によっては入手できない製品について記載することがあります最寄の販売店にご確認ください 27, Tecan Trading AG, スイス著作権所有 Tecan は主要諸国でスイス Männedorf の Tecan Group Ltd. の登録商標です Infinite Quad4 Monochromators i-control はスイス Männedorf の Tecan Group Ltd. の商標です Molecular Probes はアメリカの Invitrogen Corporation の商標です PicoGreen および RiboGreen はアメリカの Invitrogen Corporation の登録商標です Austria T Belgium T China T Denmark France Germany Italy Japan Netherlands Portugal Singapore Spain Sweden Switzerland UK USA ROW J V.1., 訂正 5

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