新技術説明会 様式例

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1 1 ファイバープローブラマン分光分析法による 脂肪 皮脂等のその場分析技術 関西学院大学理工学部生命科学科 准教授佐藤英俊

2 光分光分析の基礎 振動準位 ( 赤外 ) ( ラマン ) 仮想準位 v =3 v =2 v =1 v = 蛍光 / 励起光 =~1/1 ラマン光 / 励起光 =~1/1 7 UV-Vis J =4 J =3 J =2 J =1 J = 励起電子状態 E 2 hn Raman h(n-n R ) v =3 v =2 v =1 v = IR J =4 J =3 J =2 J =1 J = 基底電子状態 E 1 E1, E2, 電子エネルギー準位 v =, 1, 2,, v =, 1, 2, 振動エネルギー準位 J =, 1, 2,, J =, 1, 2, 回転エネルギー準位 2

3 特徴 ラマン分光分析 1. 振動分光 分子の指紋 分子を見分ける 2. 水の影響が尐ない 生体は水が多い 生体測定 3. 可視 近赤外光を利用 試料に光を当てる 異なる波長 ( エネルギー ) の光に変わる 光ファイバーが使える その場測定 蛍光 / 励起光 =~1/1 ラマン光 / 励起光 =~1/1 7 短所 : 暗い ( 光が尐ない ) 強いレーザー光が必要 イメージ測定が困難 3 3

4 4 光による生体分析システム 体内計測用ラマンプローブ 2 種 ( 世界最細径 ) 他に米国 2 機関, シンガポール 1 機関が外径約 2mm のプローブを開発.6 mm 光バイオプシーシステム ( 実験動物用として開発 ) 先端計測分析技術 機器開発事業 (JST; H16~21).62 mm Ball lens Hollow optical fiber マルチモーダル分光診断内視鏡 ( マウス用 ; オンライン分析への応用が可能 ) ラマンプローブ カメラレンズ光源 数ヶ月で発症する各種疾病モデルマウスでの研究を実現 研究の高速化 ハイパースペクトラルイメージプローブ 生きたがん組織の無標識画像化に成功

5 5 ラマン分光分析応用のターゲット 化粧品 1. リアルタイム皮膚分析によるオーダーメイド化粧品 2. 頭皮の診断, 治療 ( 皮脂分析 ) 3. 加齢臭等, 皮脂に関する分析 食品 1. 生鮮 / 冷凍の判別 2. 牛肉の品質分析 ラマン分光システム長所 : 高い分析能力短所 : 高価 高付加価値への応用 オンラインでの利用

6 6 ラマン分光法の生体応用 1. 生細胞の分析 2. 組織保存の影響の分析 3. 脂肪分析と牛肉分析への応用 4. 自家蛍光イメージングと疑似ラマンイメージング

7 Relative intensity (a.u.) 顕微ラマンによる生きた肺がん細胞の無標識 無侵襲判別分析 (532 nm) abcde a. Normal lung cell b. Adenoma (AD) c. Squamous carcinoma (SQ) a b c d d. Small cell carcinoma (SC) Excitation WL:532nm sample: 1mW Exposure:6s NC: 正常 AD: 腺腫 e. Large cell carcinoma (LC) SQ: 扁平上皮がん LC: 大細胞がん e Raman shift (cm -1 ) SC: 小細胞がん Y. Oshima, et al., J. Biomed. Opt. 15, (21). 7

8 PC 2 (2.7%) PC 3 (15.1%) 主成分分析 (PCA) による判別 a LC b AD LC SQ SQ LC LC SQ SQ AD AD SC SC AD SQ SC SC AD SC AD LC SQ AD SQ LC SQ AD LC LC SQ SQ AD SC LC SC SC SC SC AD PC 1 (44.4%) PC 1 (44.4%) AD SQ LC がん細胞種の判別に成功! SC 8

9 Intensity (a.u.) 顕微ラマンによる生きたがん細胞の無標識 無侵襲判別分析 (785nm) CT: 正常 AD: 腺 SQ: 扁平上皮 LC: 大細胞 SC: 小細胞 PC CT AD SQ LC SC PCA Score Plot (PC1 vs PC3) PC1 PC3 1 5 SQ LC Raman shift (cm -1 ) Excitation : 785nm Laser power : 5mW Expose time : 3sec 3times Normalized at 144cm PCA Score Plot (PC1 vs PC3) PC1 9

10 Intensity (a.u.) Loadings (a.u.) Intensity (a.u.) ローディングプロット : 主成分の検証 532nm 785nm PC1 PC1 PC2 PC3 PC Variables (cm -1 ) Variables (cm -1 ) Cytochrome (Resonance) PC1 多くの判別分析技術があるが, PCA および PLS のみが, ローディングプロットにより分析根拠を明らかにすることができる PC Variables (cm -1 ) 1

11 PC2 PC2 ラット脳.3 ラマン分光法による試料鮮度の分析 PC PC Fresh Frozen -8 Ethanol 4 Formalin Ethanol 25 RNAlater 1 day, 1 week PC PC PC3 ラット : 筋肉, 胃, 肝臓

12 PC2 (1.5%) 食品脂質の分析 食習慣によるがん化率の増加 乳がん疫学的調査 大腸がん日本人 < 日系ハワイ人 < アメリカ人 食習慣と脂肪と疾病の関係 牛肉の格付け分析 ( 神戸牛 = A-5) 飼料の違い ( トウモロコシ, 米, 牧草 ) 体内部位による違い格付けによる違い A5 B A3 1 1 ラマン分光法による分析結果 格付け A と B: オレイン酸 - ステアリン酸濃度の違い 脂肪 ( トリアシルグリセロール ) の構成成分による違い PC 1 (97.5%) 脂肪分析 飼料 = 食習慣 格付け = 蓄積脂肪 食習慣 疾病 12

13 Rel.Int. Rel.Int. 13 モデル皮膚内不飽和脂肪酸のラマン分析 培養皮膚モデルの真皮層のにスクアレン ( 不飽和脂肪酸 ) を注射器で注入してラマン測定を実施 87cm -1 過酸化脂質 酸化剤濃度 8mM 4mM 2mM 1mM.8mM Raman shift (cm -1 ) mm Raman shift (cm -1 ) リポソームに埋め込んだリノール酸の酸化剤による酸化と過酸化脂質の発生

14 14 蛍光イメージを用いた無染色組織観察 皮下腫瘍モデル切片 狭帯域励起 検出光を用いた蛍光イメージ

15 cm cm 自家蛍光イメージによるリアルタイム組織観測 tumor in a live mouse Interstitial fibrosis 5 4 Cytoplasmic tissue Microscope image of stained tumor tissue mm mm cm mm Fluorescent image Ex. 313 nm (sp. res. 6 nm) Obs. 5 nm (sp. res. 4 nm) Optical Biopsy System Ex (sp. res. 6 nm) Obs. 4-1 nm (sp. res. 4 nm) 2 Normal image of tumor in live mouse cm mm scale-image Selective excitation of collagen rich tissue 15

16 16 従来技術との比較 細胞 組織 脂質 免疫染色 : 侵襲性高い ターゲット以外の変化は見えない 操作が複雑で時間がかかる GFP: 遺伝子改変 ( ヒト, 食品には不可 ) 顕微鏡観察 : 固定 染色等に時間がかかる LC, GC: トリアシルグリセロールの抽出, 分解 ( 複雑操作と低精度 ) 他の分光分析技術との比較 赤外分光法 : 水分を含む試料 ( 生細胞, 組織 ) の分析が困難 ファイバプローブを用いる計測が困難 近赤外分光法 : 水分を含む試料 ( 生細胞, 組織 ) の分析がやや困難 微小試料 ( 細胞など ) の分析が困難

17 17 新技術の特徴 従来技術との比較 生体試料のラマン分光分析 高い分析 ( 判別 ) 能力リアルタイム分析無侵襲分析無標識分析微小領域 ( 試料 ) 分析 欠点 : 一点観測 自家蛍光イメージングでカバー

18 18 ラマン分光法を利用するために何が必要か 目的に応じたラマンシステムの導入 励起波長, 顕微 or ラマンプローブ, 試料ステージ, システム構成,etc. データ解析前処理 波数補正, 強度補正, バックグラウンド補正, ノイズ補正, etc. データ解析 解析に用いる技術, 検証法, データベース構築,etc.

19 19 実用化に向けた課題と企業への期待 食肉分析 : 肉の産地 等級等, 分析目的に合わせた各種試料の入手が困難 皮膚分析 専用ラマンプローブの開発が必要 ( 開発費不足 ) 装置開発 システム化が困難 ( 装置, プローブ, データ処理 )

20 2 ラマン分光法の威力 生きた細胞の無侵襲 無標識判別 分析が可能 ( 形態 + 分子組成 : 分析のマルチモダリティー化 ) 生体内分子組成変化の高精度検出 時間と共に変化する生物の分析に適する ターゲットを指定しない総合的変化の検出 ラマン分光法により可能となる分析 : 1. 生細胞の判別分析 2. 無標識 無侵襲分析 3. 皮膚の判別 定量分析 4. 組織の新鮮さ分析 5. 脂質分子組成分析

21 21 お問い合わせ先 関西学院大学 研究推進社会連携機構 TEL FAX ip.renkei@kwansei.ac.jp

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