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りえうばら
4 years ago
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1 酵素消化低分子化フコイダン抽出物によるガン細胞特異的アポトーシス誘導九州大学大学院農学研究院生命機能科学部門白畑實隆

800kDa) アワビグリコシダーゼ酵素消化低分子化フコイダン抽出物 (Fucoidan Extract : FE)( 平均分子量 : 約 500; 一部高分子フコイダンも含有 ) フコイダンの基本構造

2 酵素消化低分子化フコイダン抽出物についてフコイダンコンブワカメモズクなどのメカブなど褐藻類の粘質物に多く含まれる硫酸多糖の一種主に L- フコースを主成分として含み数十から数十万個に連なった化合物平均分子量 ; 約 800,000 Preparation トンガ王国産モズク有機酸抽出 / 脱塩処理トンガ王国産モズク (Cladosiphon novaecaledniae Kylin) 高分子フコイダン ( 平均分子量 : 約 800kDa) アワビグリコシダーゼ酵素消化低分子化フコイダン抽出物 (Fucoidan Extract : FE)( 平均分子量 : 約 500; 一部高分子フコイダンも含有 ) フコイダンの基本構造 Components Fucose 62.1 % Xylose 10.5 % Mannose 6.0 % Glucose 3.5 % Galactose 3.3 % Uronic acid 14.6 % Sulfate group 14.5 %

3 ガン細胞に対する酵素消化低分子化フコイダンのアポトーシス誘導効果

4 酵素消化低分子フコイダン抽出物は正常細胞の増殖は抑制せずガン細胞の増殖を抑制する Growth suppression of cancer cells ヒト正常線維芽細胞ヒト子宮ガン細胞ヒト線維肉腫細胞ヒト白血病細胞 TIG-1 HeLa HT1080 HL-60 LMWFE LMWFE LMWFE LMWFE Normal fibroblast Cervical carcinoma Fibrosarcoma Acute promyelocytic leukemia Normal Cancer

5 % of Max Control Fucoidan20% 60 1 mm H 2 O FL3 LOG: FL3 LOG 酵素消化低分子フコイダンは正常ヒト末梢血リンパ球にはアポトーシスを誘導しない

6 Control Fucoidan 10% Fuocidan 20% 酵素消化低分子フコイダンはヒト白血病細胞 HL60 にはアポトーシスを誘導する

7 アポトーシス経路種々の細胞ストレスデスリガンドデスレセプター小胞体ストレスミトコンドリア小胞体 Bcl-2 シトクロム c の放出 Caspase-12 Pro Caspase-9 Active Caspase-9 Caspase-8 Apoptosis Pro Caspase-3 Active Caspase-3

8 ヒト白血病由来 HL-60 細胞に対する酵素消化低分子化フコイダンのアポトーシス誘導効果

9 研究の背景 2010 年 ~ 世界の死因第 1 位ガン WHO 2008 三大療法 + 代替療法 = 外科的療法免疫療法放射線療法東洋医学化学療法健康食品フコイダン免疫賦活作用血管新生抑制作用アポトーシス誘導作用トンガ産モズク (Cladosiphon novae-caledniae Kylin) 有機酸抽出 / 脱塩アワビグリコシダーゼ酵素消化低分子化フコイダン抽出物 (FE) ( 分子量 :500 以下 ) 統合医療 QOL(Quality Of Life) の向上活性成分は? ヒト前骨髄性白血病細胞株 HL-60 作用機序は? アポトーシス

10 FE による Caspase-8 の活性化 ~Western blotting~ caspase-8 (kda) 57 Control 1 µm STS 280 µg/ml FE procaspase-8 Bid tbid ミトコンドリア caspase Cleaved caspase-8 β-actin caspase-3 Apoptosis FE による Caspase-8 の活性化を確認

11 FEによるデスレセプター及びデスリガンドの mrnaの発現量上昇 ~RT-PCR~ レセプター TNFR-1 Fas DR3 リガンド Treatment time of 280 μg/ml FE (h.) Treatment time of 280 μg/ml FE (h.) Control Control TNF-α FasL TWEAK DR4 DR5 DR6 GAPDH TRAIL FE 誘導アポトーシスは FasL/Fas, TRAIL/DR4 を介する可能性がある

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13 背景 ~ 作用機序解明 ~ caspase-8 Bid tbid ミトコンドリア Caspase-8 依存性は? どのデスレセプターを介するか? caspase-9 caspase-3 Apoptosis

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15 MAP キナーゼ経路の発現量変化 ~Western blotting~ phospho-jnk JNK phospho-p38 p38 phospho-erk ERK β-actin Treatment time of 280 μg/ml FE (h.) Control

16 Bcl-2 ファミリーの発現量変化 ~RT-PCR~ Bax Bcl-2 GAPDH Treatment time of 280 μg/ml FE (h.) Control Bax の発現量増加 Bcl-2 の発現量減少

17 小括 ~ 作用機序解明 ~ FasL Fas TRAIL DR4? FE Caspase-8 Bid Mitochondria Bax? tbid Caspase-9 Bcl-2 JNK p38 Caspase-3 Apoptosis

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21 総括 FE は複数の経路を介してアポトーシスを誘導する複数の作用点を有するアポトーシス誘導剤 70% エタノール抽出陽イオン交換クロマトグラフィー SP FF の NaCl 画分逆相クロマトグラフィーの Fr. 3 比活性の高い画分の回収質量分析等活性成分特定活性成分精製法の確立活性成分は陽イオン性で極性が高い

22 A 280 nm Fr Fr.2 Fr.3 Fr.4 Fr LH-20 ゲルろ過カラムによる酵素消化低分子化フコイダンの分画

23 分子量 13 min 分子量 : 約 y = e x R 2 = aprotinin insyurin insulin bradykinin maltotriose min 分子量 :180 以下 maltose 0.01 glucose Elution Time (min) Elution Time (min) 逆相カラム分画における酵素消化低分子化フコイダン中のアポトーシス誘導画分 (Fr.1) の分子量の推定 LH-20 ゲルろ過カラム使用

24 酵素消化低分子化フコイダン抽出物はカスパーゼ経路が破損している MCF-7 乳ガン細胞に対してはカスパーゼ非依存性のアポトーシス誘導経路を活性化してアポトーシスを誘導する PLoS ONE November 2011 Volume 6 Issue 11 e

25 PLoS ONE November 2011 Volume 6 Issue 11 e27441 フコイダン抽出物は ROS 依存性 JNK 活性化経路及びミトコンドリア介在経路が関与する機構を介して MCF-7 細胞にアポトーシスを誘導する要約背景 : フコイダン抽出物 (FE) 酵素消化した低分子化合物は褐藻類から抽出される種々の活性をもつ天然化合物として FE は特にアジアの国々でガン治療の治療効率と安全性を改善するために魅力あるものとなっている本研究ではヒトのガン細胞に関する抗腫瘍特性を研究しさらにその活性の基礎となっている機構を調べるために行われた方法 / 基本的発見 :FE は MCF-7 MDA-MB-231 及び HT1080 細胞の増殖を阻害する MCF-7 ガン細胞において FE が介在するアポトーシスは DNA 断片化核凝縮及びホスファチジルセリン露出を伴う FE はミトコンドリア膜電位 (DYm) の消失及び Bcl-2 ファミリー構成員の発現調節を通してミトコンドリア膜透過性 (MMP) を誘導する MMP に先行してアポトーシス誘導因子 (AIF) 及びチトクローム C の放出が起こる AIF 放出はアポトーシスの最終段階である DNA 断片化をカスパーゼ非依存性ミトコンドリア経路を介して起こす加えて FE は c-jun N- 末端キナーゼ (JNK) p38 及び細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK)1/2 のリン酸化を誘導することが見出されたアポトーシスは JNK の阻害によって減少することが明らかとなったさらに FE 介在アポトーシスは活性酸素種 (ROS) の発生を伴い ROS は DYm の減少及び JNK p38 及び ERK1/2 キナーゼのリン酸化を引き起こすことが見出された結論 / 意義 : これらのデータは FE が MCF-7 ガン細胞において ROS 介在 MAP キナーゼの活性化及び Bcl-2 ファミリータンパク質介在ミトコンドリア経路の調節を通じてカスパーゼ非依存性アポトーシス経路を活性化することを示唆する得られたデータはまた FE が天然の抗ガン及びガン抑制剤としてさらに研究する価値があるという証拠を提供する 25

26 ヒト乳ガン細胞ヒト乳腺ガン細胞ヒト子宮頸ガン細胞ヒト線維肉腫細胞正常ヒト乳腺上皮細胞低分子フコイダンによるがん細胞特異的増殖抑制

27 フコイダンはヒト乳腺ガン上皮細胞 MCF-7 にアポトーシスを誘導する

28 フコイダン処理した MCF-7 細胞は典型的な核凝縮を起こし細胞膜表面にフォスファチジルセリンを発現する (annexin-positive) アポトーシスの特徴を示す

29 Z-VAD-fmk:caspase の全体的な阻害剤 Ac-DEVD-CHO:caspase 3&9 阻害剤 Ac-IETD-CHO:caspae 及びグランザイム阻害剤 Z-LEHD-fmk:caspase 3&9 阻害剤 Caspase-3 を発現しない MCF-7 細胞では caspase 経路の諸タンパク質 (PARP Bid Caspase ) は活性化されないので caspase 非依存性アポトーシスを起こすことが推測された

30 フコイダンはミトコンドリアの膜電位の消失を誘導する

31 Bax/Bcl-2 比の増大 Bcl-2 強制発現 MCF-7 細胞での Bcl-2 タンパク質発現 Bcl-2 強制発現 MCF-7 細胞の FE によるアポトーシス抑制 Bcl2: アポトーシス抑制タンパク質 Bcl--xl: アポトーシス抑制タンパク質 Bax: アポトーシス促進タンパク質 Bad: アポトーシス促進タンパク質フコイダンは Bcl-2 ファミリータンパク質を調節する

32 フコイダンはミトコンドリアからアポトーシス誘導因子 (AIF) 及びチトクローム c を放出させ核内に移行させる

p-jnk p38 p-erk の活性化が起こる JNK インヒビター SP600125

33 p-jnk p38 p-erk の活性化が起こる JNK インヒビター SP によりフコイダンによるアポトーシスは部分的に抑制されるフコイダン誘導アポトーシスにおける MAP キナーゼの役割

34 細胞内活性酸素種発生量の経時的変化フコイダン処理 30 分で活性酸素種が発生する活性酸素種を抑制する抗酸化剤 N- アセチルシステイン処理によりフコイダンにより誘導されたアポトーシスが部分的に抑制されるフコイダンは一過性に活性酸素種を発生させアポトーシスを誘導する

ミトコンドリアの膜電位の FE による消失に対する N-acetyl cysteine および SP600125 の保護効果抗酸化剤 N-acetyl cystein

35 ミトコンドリアの膜電位の FE による消失に対する N-acetyl cysteine および SP の保護効果抗酸化剤 N-acetyl cystein で前処理した MCF-7 細胞では JNK p38 ERK の活性化が部分的に抑制されることからフコイダン処理による一過性の ROS 発生が先行して必要であることが示唆される

36 細胞代謝に及ぼすフコイダンの影響フコイダンはグルコース飢餓状態での ATP 枯渇及びアポトーシスを促進する

37 フコイダンはアポトーシス経路が壊れている乳ガン MCF-7 細胞に対して AIF や JNK を活性化しまだ良く分かっていない核内の経路で DNA 分解酵素を誘導しアポトーシスを誘導する

38 酵素消化低分子フコイダン抽出物と抗ガン剤併用による抗腫瘍効果の増強

39 抗ガン剤の副作用ガン細胞は活発に増殖をし続けるため増殖しやすい細胞に取り込まれて毒性を発揮するのが抗ガン剤であるしたがって正常細胞とくに髪の毛腸管細胞白血球や赤血球などを生み出す造血幹細胞も大きなダメージを受け重篤な副作用が生じる

40 シスプラチン白金を含む抗ガン剤がん細胞の 2 本の DNA 鎖と結合することで DNA の複製を妨げがん細胞を死滅させる適応となるがん肺がん膀胱がん前立腺がん卵巣がん食道がん胃がん子宮頸がん悪性リンパ腫など主な副作用激しい副作用があるもっとも深刻なものは腎不全などの腎臓機能の障害 40

41 マイトマイシン抗がん性抗生物質アルキル化剤と同じように DNA の分裂阻止や活性酸素による DNA 鎖切断などによって DNA の複製を阻害し抗がん作用を発揮する適応となるがん慢性骨髄性白血病慢性リンパ性白血病頭頚部がん肺がん胃がん大腸肝臓がん膵臓がん子宮頸がん主な副作用骨髄抑制腎障害 41

42 タモキシフェン乳がん細胞のエストロゲン受容体をブロックし細胞の増殖を抑制するホルモン療法として使用適応となるがん乳がんなど主な副作用強くない目のかすみなど 42

43 パクリタキセル ( タキソール ) 微小管に結合して安定化させ脱重合を阻害することで腫瘍細胞の分裂を阻害する適応となるがん卵巣がん非小細胞肺がん乳がん胃がん子宮体がんなど主な副作用発熱骨髄抑制関節や筋肉の痛み比較的軽い吐き気や嘔吐そして頭髪以外の体毛を含めた全身的な脱毛深刻なアレルギー症状が現れることもある 43

44 細胞死の割合 (%) ガン細胞 (HT1080) における酵素消化低分子化フコイダンの効果 48 時間処理顕著な細胞死誘導 (µm) Cisplatin 濃度酵素消化低分子化フコイダン抽出物が抗ガン剤 cisplatin による細胞死誘導を増強

45 細胞死の割合 (%) 正常細胞 (TIG-1) における酵素消化低分子化フコイダンの効果 48 時間処理顕著な細胞死の抑制 Cisplatin 濃度 (µm) 酵素消化低分子化フコイダン抽出物が抗ガン剤 cisplatin による細胞死誘導を抑制

46 細胞死の割合 (%) ガン細胞 (HT1080) における酵素消化低分子化フコイダンの効果 2 抗ガン剤 MitomycinC(MMC) 使用 MMC (μm) FE 280 μg/ml 酵素消化低分子化フコイダン抽出物が抗ガン剤 MitomycinC による細胞死誘導も増強

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FE plus 10 µm Tamoxifen and 200 µg/ml FE plus 2.5 nm paclitaxel).

48 Fig.2 MDA-MB-231 and MCF-7 cells were treated with FE either alone at 200µg/mL or in combination ( 200 µg/ml FE plus 5 µm Cisplatin, 200µg/mL FE plus 10 µm Tamoxifen and 200 µg/ml FE plus 2.5 nm paclitaxel). Apoptosis was evaluated by determining the percentage of annexin V-positive cells. 48

49 小括酵素消化低分子フコイダンと抗ガン剤 CDDP( シスプラチン ) MMC( マイトマイシン C) タモキシフェンまたはパクリタキセルとの併用により抗ガン剤のガン細胞死有効効果が増強された酵素消化低分子フコイダンは CDDP による正常細胞の障害を抑制した酵素消化低分子フコイダンと抗ガン剤の併用により抗ガン剤の効果を高めるとともに正常細胞に対する障害を抑制し副作用を軽減することが期待された

50 今後の予定 1. 抗ガン剤とフコイダンの組合せによるヒトガン細胞アポトーシス誘導効果に関する論文を出版する 2. 乳ガン細胞とタモフェキシンに限って作用機構を詳細に解析した論文を出版する 3. 乳ガン細胞を移植したマウスを用いてタモキシフェンとフコイダンとの併用効果に関する論文を出版する 4. フコイダン中の活性成分を精製し同定した論文を出版する 50

51 2010 年 9 月 22 日日本癌学会学術大会で口頭発表酵素消化低分子化フコイダン抽出物による癌細胞特異的細胞死及び糖鎖合成経路の改変誘導 Kiichiro Teruya 1, Sanetaka Shirahata 1, Toshihiro Yoshida 2 (1. Dept. Biosci. and Biotech., Fac. Agr., Kyushu Univ., 2. Yoshida Clinic)

52 背景細胞表面に発現している糖鎖は免疫機能や恒常性維持機能のいずれにも密接に関与している糖鎖合成の異常ガンを含む様々な疾病の一因と考えられている正常細胞ガン細胞悪性のガン細胞悪性の変化糖鎖構造の変化

53 Sub-G1 (%) Sub-G1 (%) FEと糖鎖結合タンパク質 Con Aの併用による細胞死誘導増強効果 140 μg/ml FE のみ 140 μg/ml FE + Con A FE のみ FE + Con A 0 28 FE (μg/ml) Time (h) FE 処理によりガン細胞表面の糖鎖構造に変化が起こり ConA との併用による細胞死が促進された細胞死誘導増強効果は FE 処理 24 時間以降に認められた

54 Relative GnT-V level Relative Ets-1 level FE 処理した HT1080 細胞の GnT-V 及び Ets-1 の mrna 発現量の変化 GnT-V 24 h 48 h Ets-1 24 h 48 h * ** ** * ** ** ** ** ** ** ** FE (μg/ml) *:p< 0.05 **:p< FE (μg/ml) *:p< 0.05 **:p< 0.01 FE 処理によって GnT-V 及び Ets-1 の mrna 発現量減少が確認された

Relative GnT-V level Relative Ets-1 level FE 処理したヒト正常線維芽細胞 TIG-1のGnT-V 及びEts-1のmRNA 発現量の変化 GnT-V 24 h 48 h Ets-1 24 h 48 h * ** ** * ** ** ** 0 28 140 280 FE

55 Relative GnT-V level Relative Ets-1 level FE 処理したヒト正常線維芽細胞 TIG-1のGnT-V 及びEts-1のmRNA 発現量の変化 GnT-V 24 h 48 h Ets-1 24 h 48 h * ** ** * ** ** ** FE (μg/ml) *:p< 0.05 **:p< FE (μg/ml) *:p< 0.05 **:p< 0.01 ヒト正常細胞では FE 処理 24 時間では GnT-V 及び Ets-1 の mrna 発現量に顕著な変化は認められなかった 48 時間処理ではわずかな発現量減少が確認された

56 総括 FE 処理によって Con A 反応性糖鎖の発現量増加及び PHA-L4 反応性糖鎖の発現量減少が確認された糖鎖発現量の変化には GnT-V 及び Ets-1 の発現抑制が深く関与していることが示唆された FE による ER ストレスの軽減が GnT-V の発現抑制に寄与していると推測された FE 処理 Con A GnT-V Ets-1 GnT-V Ets-1 ER ストレス GRP78/Bip XBP-1 ガン細胞 : マンノース :N-acetylglucosamine :β-1,6-glcnac ConA 誘導ガン細胞死の増強

57 今後の予定フコイダンによる細胞表面糖鎖の変化は学問的には興味ある現象であるしかしガン治療の観点から考えた場合細胞表面の糖鎖変化がフコイダンの抗腫瘍効果において種々の変化を起こす原因なのかフコイダンによるガン細胞の形質変化に伴う付随的な変化なのかを見極める必要がある付随的な変化である場合は ROS 発生抑制などガン形質の抑制の原因となるより重要な作用機構の解明に力を入れる 57

58 まとめ低分子フコイダンは濃度依存的にガン細胞の増殖及びアポトーシス死を誘導するが正常細胞には作用しない低分子フコイダンは強い活性酸素消去能を示しガン細胞の転移浸潤能及び血管新生能を抑制する腫瘍免疫も増強する低分子フコイダンはガン化の過程で生じたガン細胞表面の異常糖鎖を糖鎖合成経路に作用して変化させアポトーシスを起こしやすくする正常細胞には作用しない低分子フコイダンは抗癌剤によるガン細胞死を増強するが抗癌剤による正常細胞の死は抑制する抗酸化作用により抗癌剤の副作用を軽減することが期待される

59 ご清聴ありがとうございました

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Disclosure Information Name of Meeting Name of Speaker 酵素消化低分子化フコイダン抽出物による癌細胞特異的細胞死及び糖鎖合成経路の改変誘導 Kiichiro Teruya 1, Sanetaka Shirahata 1, Toshihiro Yoshida 2 (1. Dept. Biosci. and Biotech., Fac. Agr., Kyushu Univ., 2. Yoshida Clinic) 背景細胞表面に発現している糖鎖は免疫機能や恒常性維持機能のいずれにも密接に関与している