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1 写 食 安 監 発 0515 第 1 号 平 成 24 年 5 月 15 日 都 道 府 県 各 保 健 所 設 置 市 特 別 区 衛 生 主 管 部 ( 局 ) 長 殿 厚 生 労 働 省 医 薬 食 品 局 食 品 安 全 部 監 視 安 全 課 長 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O26 O111 及 び O157 の 検 査 法 について 食 品 からの 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O157 及 び O26 の 検 査 法 については 平 成 18 年 11 月 2 日 付 け 食 安 監 発 第 号 により 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O111 の 検 査 法 につ いては 平 成 23 年 6 月 3 日 付 け 食 安 監 発 0603 第 2 号 ( 最 終 改 正 : 平 成 23 年 10 月 3 日 )により 通 知 しているところです 今 般 一 斉 試 験 法 について 検 討 を 行 った 結 果 別 添 のとおり 食 品 からの 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O26 O111 及 び O157 の 検 査 法 を 定 めたので 検 査 を 行 う 場 合 は この 方 法 により 実 施 されるようお 願 いします 平 成 18 年 11 月 2 日 付 け 食 安 監 発 第 号 及 び 平 成 23 年 6 月 3 日 付 け 食 安 監 発 0603 第 2 号 は 廃 止 します なお VT 遺 伝 子 検 出 法 によるスクリーニング 法 については 引 き 続 き 検 討 中 であり 確 認 でき 次 第 改 めて 通 知 することとしています

2 ( 別 添 ) 食 品 からの 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O26 O111 及 び O157 の 検 査 法 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O26 O111 及 び O157 の 試 験 を 以 下 の 方 法 によって 行 う ベロ 毒 素 (VT) 遺 伝 子 検 出 法 を 行 うための 設 備 を 整 えることができない 場 合 については 培 養 法 のみを 行 って 差 し 支 えない 1. 検 体 の 採 取 食 品 検 体 200g 以 上 を 採 取 する なお 表 面 汚 染 が 考 えられる 食 品 は 表 面 部 を 厚 さ cm に 削 り これを 検 体 とする 2. 試 料 の 調 製 採 取 した 検 体 の 全 体 を 細 切 混 和 後 その 25gをストマッカー 袋 に 秤 量 して これを 試 料 とする 3. 増 菌 培 養 以 下 の 増 菌 培 養 液 を 培 養 法 及 び VT 遺 伝 子 検 出 法 に 供 試 する ただし VT 遺 伝 子 検 出 法 の 場 合 は 別 に 10 ml を 分 離 培 養 用 として 試 験 が 終 了 するまで 冷 蔵 保 存 する ストマッカー 袋 中 の 試 料 に 225 ml の 増 菌 培 地 ( 室 温 程 度 )を 加 え1 分 間 以 内 のストマッカー 処 理 などを 行 った 後 42±1 で 22±2 時 間 培 養 する 4. 増 菌 用 培 地 1)mEC 培 地 ( 日 水 製 薬 オキソイド 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 極 東 製 薬 工 業 栄 研 化 学 メルク 等 ) ペプトン 20.0 g 胆 汁 酸 塩 1.12 g ラクトース 5.0 g K 2 HPO g KH 2 PO g NaCl 5.0 g ph 6.9±0.1 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 冷 却 し そのまま 使 用 する 2)mEC 培 地 (USDA 法 )( 自 家 調 製 ) トリプトン 20.0 g 胆 汁 酸 塩 (Bile salts No.3) 1.12 g - 1 -

3 ラクトース 5.0 g K 2 HPO g KH 2 PO g NaCl 5.0 g ph 6.9±0.1 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 冷 却 し そのまま 使 用 する ただし 凍 結 等 によって 菌 の 損 傷 が 考 えられる 場 合 は 各 試 験 検 査 機 関 において 本 通 知 法 に 示 す 増 菌 培 養 法 と 同 等 であると 判 断 した 上 で mec 培 地 において 36±1 培 養 など 選 択 性 を 弱 めた 増 菌 培 養 法 の 使 用 を 推 奨 する その 他 の 培 地 についても 各 試 験 検 査 機 関 で 同 等 性 について 評 価 を 行 い 使 用 しても 良 い また 検 体 中 の 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 以 外 の 菌 の 増 殖 が 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 の 増 殖 を 妨 げると 考 えら れる 場 合 は ノボビオシン 加 mec 培 地 において 42±1 培 養 など 選 択 性 を 高 めた 増 菌 培 養 法 も 考 慮 する 5.DNA 抽 出 法 (VT 遺 伝 子 検 出 法 を 行 わない 場 合 は7へ) 使 用 する DNA 抽 出 法 に 必 要 な 培 養 液 量 から DNA 抽 出 を 行 ない それを 試 料 として6の VT 遺 伝 子 検 出 を 行 う DNA 抽 出 法 としては 以 下 のものが 利 用 できる キットについては 各 添 付 文 書 を 参 照 すること 抽 出 DNA は 氷 上 で 取 り 扱 い 保 存 は 凍 結 が 望 ましい なお 培 養 液 の 加 熱 による 単 純 な DNA 抽 出 法 は 検 出 感 度 が 優 れないため 使 用 しない 可 能 であれば1 検 体 につき2 本 のマイクロチューブを 用 いて DNA を 抽 出 する 1)アルカリ 熱 抽 出 法 培 養 液 0.1 ml をマイクロチューブにとり 10,000Xg 10 分 間 遠 心 し 上 清 を 取 り 除 いた 沈 渣 に 滅 菌 した 50 mm NaOH 85 l を 添 加 して 100 で 10 分 間 加 熱 処 理 する その 処 理 液 に 滅 菌 した1 M Tris-HCl(pH 7.0)15 l を 加 えて 中 和 し 遠 心 上 清 (2,000~10,000Xg 10 分 間 )を 検 体 とす る また VT 遺 伝 子 検 出 キットに 含 まれる DNA アルカリ 抽 出 試 薬 を 使 用 できる(ただし 上 記 と 同 等 のアルカリ 液 及 び 中 和 液 の 組 成 及 び 容 量 に 限 る) 抽 出 後 は 氷 上 で 静 置 し 直 ちに(60 分 以 内 ) 検 出 試 験 に 使 用 する 直 ちに 使 用 しない 場 合 には0~4 で 保 存 し 4 時 間 以 内 に 使 用 する 2)PrepMan Ultra Sample Preparation Regent(アプライド バイオシステムズジャパン) 3)DNeasy Tissue Kit(キアゲン) 4)High Pure PCR Template Preparation Kit(ロシュ ダイアグノスティックス) その 他 同 等 品 も 使 用 できる ただし 脂 肪 の 多 い 食 品 については 食 品 成 分 が 遺 伝 子 増 幅 に 影 響 を 及 ぼすため 1)に 示 すア ルカリ 熱 抽 出 法 を 使 用 する 6.VT 遺 伝 子 検 出 法 - 2 -

4 抽 出 した DNA テンプレートを 用 いて VT 遺 伝 子 の 検 出 試 験 を 実 施 する VT 遺 伝 子 検 出 の 結 果 陰 性 であった 場 合 は 試 験 を 終 了 する 陽 性 であった 場 合 は 当 日 中 に 血 清 群 O26 O111 及 び O157 を 対 象 とした 分 離 培 養 を 行 う VT 遺 伝 子 検 出 法 では 感 度 が 1X10 4 cfu/ml( 検 体 の 増 菌 培 養 液 )より 優 れるものを 使 用 すること とし 方 法 として 以 下 のものがあげられる なお 感 度 の 確 認 が 必 要 な 場 合 には 各 機 関 にて 後 述 の 方 法 を 参 照 し 行 う 試 験 には 陽 性 コントロールを 設 定 する 1)PCR 法 市 販 の VT 遺 伝 子 検 出 キット 又 は 公 表 されているプライマーを 各 試 験 検 査 機 関 で 合 成 調 製 し 市 販 の 遺 伝 子 増 幅 酵 素 にてリアクションを 行 う これについては 以 下 のものが 利 用 できる また PCR 産 物 の 電 気 泳 動 においては 1,000 bp 以 下 の 核 酸 分 離 に 対 応 した 低 分 子 用 アガロースゲルを 使 用 する (1) 市 販 のキットを 使 用 する 場 合 1 O-157(ベロ 毒 素 遺 伝 子 )PCR Screening Set(タカラバイオ) 94 で1 分 55 で 1 分 72 で 1 分 を 35 サイクル 72 で 10 分 を1サイクル 行 う 増 幅 DNA の 大 きさは 171 bp である (2) 公 表 されているプライマーを 各 試 験 検 査 機 関 で 合 成 調 製 し 市 販 の 遺 伝 子 増 幅 酵 素 を 使 用 す る 場 合 下 記 に 示 す 例 以 外 にも 反 応 条 件 を 検 討 し 同 等 であると 判 断 されたプライマー 及 び PCR 酵 素 が 使 用 できる 1 Lin et al. Microbiol. Immunol. 37: , ( 使 用 方 法 例 ) 表 1に 示 した 反 応 液 を 調 製 する 表 1 反 応 液 の 調 製 試 薬 容 量 Template 滅 菌 精 製 水 5.0 l l 10 X Ex Taq Buffer 5.0 l dntp mixture ( 各 2.5 mm) Takara Ex Taq (5U/ l) 5pmol/ l プライマー 4.0 l 0.25 l Sense: 0.5 l Antisense: 0.5 l 計 50.0 l Sense: 5 -GAA CGA AAT AAT TTA TAT GT-3 Antisense: 5 -TTT GAT TGT TAC AGT CAT-3-3 -

5 94 で1 分 43 で 1.5 分 72 で 1.5 分 を 40 サイクル 行 う 増 幅 DNA の 大 きさは 905 bp である 2)Loop mediated isothermal amplification(lamp) 法 以 下 のキットが 利 用 できる (1)Loopamp 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 検 出 試 薬 キット( 栄 研 化 学 ) 対 応 機 種 :Loopamp リアルタイム 濁 度 測 定 装 置 (LA-320C 及 び RT-160C: 栄 研 化 学 販 売 ) その 他 同 等 の 機 能 を 有 する 機 器 が 使 用 できる 付 属 の DNA 抽 出 試 薬 の 他 に 5.に 示 した DNA 抽 出 方 法 による DNA 抽 出 液 も 使 用 できる 3)Real-time PCR 法 市 販 の VT 遺 伝 子 検 出 キット 又 は 公 表 されているプライマー 及 びプローブを 各 試 験 検 査 機 関 で 合 成 調 製 し 市 販 の Master Mix にてリアクションを 行 う これについて 下 記 のものが 利 用 できる (1) 市 販 キットを 使 用 する 場 合 1 CycleavePCR O-157(VT gene) Screening Kit(タカラバイオ) 対 応 機 種 : Thermal Cycler Dice Real Time System(タカラバイオ) ABI PRISM 及 び 7900(アプライド バイオシステムズ ジャパン) LightCycler Ver その 他 同 等 の 機 能 を 有 する 機 器 が 使 用 できる (2) 公 表 されているプライマー 及 びプローブを 合 成 調 製 し 市 販 の Master Mix を 使 用 する 場 合 下 記 に 示 す 例 以 外 にも 反 応 条 件 を 検 討 し 同 等 であると 判 断 されたプライマー プローブ Master Mix Real-time PCR 機 器 が 使 用 できる 1 Nielsen et al. J. Clin. Microbiol. 41: , ( 使 用 方 法 例 ) 機 器 ABI PRISM 及 び 7900 が 使 用 できる 試 薬 TaqMan Environmental Mater Mix 2.0 (アプライド バイオシステムズ Product No ) TaqMan プローブ プライマー 滅 菌 精 製 水 反 応 液 の 準 備 表 2に 示 した 反 応 液 を 調 製 する 反 応 プレートのウェル 又 は 反 応 チューブに 45.0 l ずつ 反 応 液 を 入 れる 検 体 DNA 5 l を 加 えて 試 験 を 行 う 増 幅 反 応 は 50 で2 分 95 で 10 分 を1サイクル 次 いで 95 で 15 秒 60 で 1 分 を 40 サイクルに 設 定 し ランを 開 始 する - 4 -

6 ランが 終 了 したら データ 解 析 をする Auto 解 析 又 は Threshold を 0.2 に 設 定 して 解 析 する Baseline については 安 定 した 部 分 ( 目 安 として 3-10 cycle)に 手 動 設 定 による 解 析 を 行 う 各 検 体 につき Ct 値 が 得 られている 場 合 を 陽 性 とする 表 2 反 応 液 の 調 製 試 薬 VT 滅 菌 精 製 水 TaqMan Environmental Mater Mix l 25.0 l 10 pmol/ l プライマー VT1-F 3.0 l VT1-R VT2-F VT2-R 3.0 l 3.0 l 3.0 l 5pmol/ l プローブ VT1-P 2.0 l VT2-P 2.0 l 計 45.0 l VT1-F: 5 -GGA TAA TTT GTT TGC AGT TGA TGT C-3 VT1-R: 5 -CAA ATC CTG TCA CAT ATA AAT TAT TTC GT-3 VT1-P: 5 -FAM-CCG TAG ATT ATT AAA CCG CCC TTC CTC TGG A-TAMRA-3 VT2-F: 5 -GGG CAG TTA TTT TGC TGT GGA-3 VT2-R: 5 -GAA AGT ATT TGT TGC CGT ATT AAC GA-3 VT2-P: 5 -FAM-ATG TCT ATC AGG CGC GTT TTG ACC ATC TT-TAMRA-3 2 Bellin et al. J. Clin. Microbiol. 39: , ( 使 用 方 法 例 ) 機 器 LightCycler Ver. 2.0(LightCycler Capillaries 100 l 用 )が 使 用 できる 試 薬 LightCycler FastStart DNA Master HybProbe プローブ プライマー 滅 菌 精 製 水 反 応 液 表 3に 示 した 反 応 液 を 調 製 する 反 応 液 45.0 l と 検 体 DNA 5 l をキャピラリーにアプライする 増 幅 反 応 は 95 で 10 分 を 1 サイクル 次 いで 95 で 10 秒 60 で5 秒 (55 まで 0.5 ずつタッチダウン) 72 で20 秒 を45サイクル 40 で 30 秒 を 1 サイクル 行 う - 5 -

7 ランを 開 始 する ランが 終 了 したら データ 解 析 をする 表 3 反 応 液 の 調 製 試 薬 容 量 滅 菌 精 製 水 10 LC-DNA Master 25mM MgCl l 5.0 l 6.0 l 10 pmol/ l プライマー VT1 StxA l StxA l VT2 StxA l StxA l 3pmol/ l プローブ VT1 StxA1 FL l StxA1 LC l VT2 StxA2 FL l StxA2 LC l 計 45.0 l StxA1 598: 5 -AGT CGT ACG GGG ATG CAG ATA AAT-3 StxA1 1015: 5 -CCG GAC ACA TAG AAG GAA ACT CAT-3 StxA1 FL724: 5 -CTG TCA CAG TAA CAA ACC GTA ACA TCG CTC-FITC-3 StxA1 LC693: 5 -Red705-TGC CAC AGA CTG CGT CAG TGA GGT-3 StxA2 679: 5 -TTC CGG AAT GCA AAT CAG TC-3 StxA2 942: 5 -CGA TAC TCC GGA AGC ACA TTG-3 StxA2 FL769: 5 -MAG AGC AGT TCT GCG TTT TGT CAC TGT CA-FITC-3 StxA2 LC799: 5 -Red640-AGC AGA AGC CTT ACG CTT CAG GC-3 その 他 同 等 品 も 使 用 できる VT 遺 伝 子 検 出 法 の 感 度 確 認 が 必 要 な 場 合 は 血 清 群 O26 O111 又 は O157(VT 陽 性 株 )の 菌 濃 度 が 約 1X10 4 cfu/ml( 検 体 の 増 菌 培 養 液 )を 作 製 し 試 験 する 血 清 群 O26 O111 又 は O157(VT 陽 性 株 )を Tryptic soy broth( 栄 研 化 学 日 水 製 薬 オキソイド 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 日 本 ベクトン ディッキンソン 等 )(10 ml)に 接 種 し 36±1 で 18±1 時 間 培 養 する( 約 5X10 8 cfu/ml) この 培 養 液 を 対 象 検 体 の mec 培 養 液 9ml を 用 いて 10-4 倍 希 釈 する この 10-4 倍 希 釈 液 1ml を さらに4 ml の 対 象 検 体 の mec 培 養 液 で 希 釈 した 菌 液 を 試 料 とする この 希 釈 菌 液 は 約 1X10 4 cfu/ml( 検 体 の 増 菌 培 養 液 )とし 試 験 に 用 いる 菌 液 調 製 について 各 機 関 であらかじめ 菌 株 の 増 殖 程 度 を 確 認 - 6 -

8 し 必 要 ならば 希 釈 倍 率 の 変 更 を 行 う 7. 免 疫 磁 気 ビーズ 法 血 清 群 O26 O111 又 は O157 の 分 離 を 目 的 に 増 菌 培 養 液 を 免 疫 磁 気 ビーズ 法 に 供 試 する 免 疫 磁 気 ビーズとしては 以 下 のものが 利 用 できる 各 社 ビーズの 仕 様 に 合 わせた 各 ビーズ 液 量 を 別 々の 1.5 ml チューブに 入 れ 各 々に1ml ずつ 培 養 液 を 加 え 濃 縮 する この 際 異 なる 血 清 群 のビーズを 混 合 して 用 いてはならない また 濃 縮 操 作 は 各 社 製 ビーズの 仕 様 に 合 わせ 0.05% Tween20 加 PBS 又 は 滅 菌 生 理 食 塩 水 を 使 用 し 最 終 的 に 0.1 ml に 懸 濁 する 詳 細 な 試 験 方 法 は 各 仕 様 書 を 参 照 する 交 差 汚 染 を 避 けるためにマイクロチューブの 蓋 をあける 際 は 固 く 絞 ったアルコール 綿 で 蓋 を 覆 うな どの 配 慮 が 必 要 である また ビーズ 吸 着 操 作 後 の 培 養 液 や 洗 浄 液 を 取 り 除 く 際 には ディスポー サブルのスポイトの 使 用 やマイクロピペットの 汚 染 防 止 などを 配 慮 する 1) 血 清 群 O26 (1) 免 疫 磁 気 ビーズ O26 生 研 (デンカ 生 研 ) (2)Dynabeads EPEC/VTEC O26(ダイナル 製 造 ;ベリタス 販 売 ) 2) 血 清 群 O111 (1) 免 疫 磁 気 ビーズ O111 生 研 (デンカ 生 研 ) (2)Dynabeads EPEC/VTEC O111(ダイナル 製 造 ;ベリタス 販 売 ) 3) 血 清 群 O157 (1) 免 疫 磁 気 ビーズ O157 生 研 (デンカ 生 研 ) (2)Dynabeads anti-e.coli O157(ダイナル 製 造 ;ベリタス 販 売 ) その 他 同 等 品 も 使 用 できる 8. 分 離 培 養 法 分 離 培 養 は 増 菌 培 養 液 の 直 接 塗 抹 及 び 免 疫 磁 気 ビーズ 濃 縮 液 の 塗 抹 によって 行 う 直 接 塗 抹 法 につ いては 増 菌 培 養 液 10 l 免 疫 磁 気 ビーズ 法 については 免 疫 磁 気 ビーズ 濃 縮 液 10~20 l を 各 種 分 離 平 板 培 地 1 枚 あたりに 画 線 塗 抹 し 36±1 で 18~24 時 間 培 養 後 疑 われるコロニーを 分 離 する 多 く の 単 離 コロニーが 出 現 するように 1 種 類 につき2 枚 以 上 の 分 離 平 板 培 地 を 用 いる 二 分 画 培 地 の 場 合 は 相 当 の 面 積 に 塗 抹 する また 増 菌 培 養 液 を 希 釈 したものを 塗 抹 するなどの 操 作 を 必 要 に 応 じて 行 う 1 検 体 につき 典 型 的 コロニーをできる 限 り5 個 以 上 釣 菌 する なお 凍 結 等 によって 菌 の 損 傷 が 考 えられる 場 合 は セフィキシム 亜 テルル 酸 カリウム(CT)に 感 受 性 が 高 いことが 考 えられるの で CT 非 添 加 の 分 離 平 板 培 地 も 使 用 する 1) 直 接 塗 抹 法 セフィキシム 亜 テルル 酸 カリウム 添 加 ソルビトールマッコンキー(CT-SMAC) 寒 天 培 地 及 び 2) 免 疫 磁 気 ビーズ 塗 抹 法 に 示 す 血 清 群 O111 用 の 酵 素 基 質 培 地 を1 種 類 について 各 1 枚 ずつ を 使 用 する CT-SMAC 寒 天 培 地 では O157 はソルビトール 非 分 解 又 は 遅 分 解 の 無 色 透 明 コロニー - 7 -

9 O26 及 び O111 は ソルビトール 分 解 の 赤 色 コロニーを 形 成 する それぞれの 典 型 的 コロニーを 釣 菌 して 血 清 凝 集 にて 血 清 群 O26 O111 及 び O157 の 確 定 を 行 う 酵 素 基 質 培 地 では それぞれの 培 地 での 典 型 的 な 血 清 群 O111 のコロニー また 血 清 群 O26 及 びO157については 大 腸 菌 コ ロニーを 各 培 地 上 での 特 徴 に 従 って 釣 菌 し 9.の 方 法 に 従 い 血 清 凝 集 反 応 にて 血 清 群 O 及 び O157 の 確 定 を 行 う 2) 免 疫 磁 気 ビーズ 塗 抹 法 (1) 血 清 群 O26 セフィキシム 亜 テルル 酸 カリウム 添 加 ラムノースマッコンキー(CT-RMAC) 寒 天 培 地 を 必 ず 使 用 し CT-Vi RX O26 寒 天 培 地 CT-クロモアガーO26/0157 培 地 CT-SMAC 寒 天 培 地 CT-ColiID 寒 天 培 地 等 の 大 腸 菌 が 鑑 別 できる 培 地 を1 種 類 以 上 併 用 することとする セフィキシム 及 び 亜 テ ルル 酸 カリウム 等 の 添 加 によって 選 択 性 の 高 まることが 期 待 できるため 分 離 平 板 培 地 にはこれ らを 添 加 する 1 CT-RMAC 寒 天 培 地 ( 自 家 調 製 MacConkey Agar Base( 日 本 ベクトン ディッキンソン 等 )の 使 用 又 は 市 販 生 培 地 :デンカ 生 研 日 水 製 薬 ) 基 礎 培 地 ペプトン 20.0 g 胆 汁 酸 塩 (Bile salts No.3) 1.5 g ラムノース 10.0 g NaCl 5.0 g ニュートラルレッド 0.03 g クリスタルバイオレット g 寒 天 15.0 g ph 7.2±0.1 備 考 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 50 以 下 に 冷 却 し 以 下 に 示 す 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたの ち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 典 型 的 な 血 清 群 O26 はラムノース 非 分 解 又 は 遅 分 解 コロニーであり 無 色 透 明 コロニーを 形 成 する ラムノース 分 解 性 の 他 の 大 腸 菌 は 赤 色 コロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 2 CT-Vi RX O26 寒 天 培 地 ( 栄 研 化 学 ) 基 礎 培 地 ペプトン 15.0 g NaCl 5.0 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g - 8 -

10 L-ラムノース 10.0 g フェノールレッド 0.03 g 発 色 基 質 0.3 g 寒 天 15.0 g ph 7.0±0.2 備 考 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 50~60 に 冷 却 し 以 下 に 示 す 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたの ち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 典 型 的 な 血 清 群 O26 は 青 紫 ~ 黒 色 コロニーを 形 成 する O26 以 外 の 血 清 群 の 大 腸 菌 は 黄 緑 ~ 青 緑 色 を また 大 腸 菌 以 外 の 腸 内 細 菌 は 緑 黄 色 又 は 赤 色 のコロニーを 形 成 する ブドウ 球 菌 などの 腸 内 細 菌 以 外 の 菌 はほとんど 発 育 しない 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 3 CT-クロモアガーO26/0157 培 地 (クロモアガー 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 ) ペプトン 及 び 酵 母 エキス 8.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 選 択 剤 発 色 基 質 混 合 物 23.0 g 寒 天 15.0 g ph 7.0±0.2 備 考 : 培 地 は 加 熱 溶 解 後 (オートクレーブ 不 可 過 度 の 加 熱 も 避 けること)50 以 下 に 冷 却 し 以 下 に 示 す 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたのち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 とし て 使 用 する 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は 2~8 で 30 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O26 は 緑 色 コロニーを 血 清 群 O157 は 赤 色 コロニーを 形 成 す る その 他 の 大 腸 菌 は 赤 紫 ~ 紫 色 のコロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 える 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 4 CT-ColiID 寒 天 培 地 (ボトル 培 地 ; 日 本 ビオメリュー) 基 礎 培 地 ゼラチンペプトン 7.0 g NaCl 5.0 g 酵 母 エキス 3.0 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g 活 性 化 剤 混 合 物 0.3 g - 9 -

11 発 色 基 質 混 合 物 0.3 g 寒 天 15.0 g ph 7.2 備 考 : 加 温 溶 解 後 50 以 下 に 冷 却 し 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたのち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが,その 保 存 期 間 は2~ 8 で7 日 以 内 とする 典 型 的 な O26 及 びその 他 の 血 清 群 (O157 を 除 く)はピンク~ 赤 紫 色 のコロニーを 形 成 する 血 清 群 O157 及 び 大 腸 菌 群 は 灰 色 ~ 青 色 を また 他 のグラ ム 陰 性 菌 は 無 色 のコロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 日 本 ビオメリュー(200 ml 培 地 用 ) 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 5 CT-SMAC 寒 天 培 地 ( 前 述 ) その 他 同 等 の 大 腸 菌 が 鑑 別 できる 培 地 も 使 用 できる (2) 血 清 群 O111 セフィキシム 亜 テルル 酸 カリウム 添 加 ソルボースマッコンキー(CT-SBMAC) 寒 天 培 地 又 は CT-SMAC のうち 1 種 類 を 必 ず 使 用 する CT-SBMAC 寒 天 培 地 では 典 型 的 な 血 清 群 O111 の 形 成 す るソルボース 非 分 解 又 は 遅 分 解 の 無 色 透 明 コロニー CT-SMAC 寒 天 培 地 では 典 型 的 な 大 腸 菌 コ ロニーを 釣 菌 して O111 血 清 凝 集 にて 血 清 群 O111 の 確 定 を 行 う また 酵 素 基 質 培 地 として ク ロモアガー STEC 培 地 CIX 寒 天 培 地 Vi EHEC 培 地 XM-EHEC 寒 天 培 地 等 のうち1 種 類 以 上 を 併 用 することとする 1 CT-SBMAC 寒 天 培 地 ( 市 販 生 培 地 : 日 水 製 薬 極 東 製 薬 工 業 等 ; 自 家 調 製 又 は 基 礎 培 地 使 用 (マッ コンキー 基 礎 培 地 を 用 いる 場 合 : 日 本 ベクトン ディッキンソン 等 )) 基 礎 培 地 ペプトン 20.0 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g ソルボース 10.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g ニュートラルレッド 0.03 g クリスタルバイオレット g 寒 天 15.0 g ph 7.2±0.1 又 は マッコンキー 基 礎 培 地 40.0 g

12 ソルボース 10.0 g ph 7.1±0.2 備 考 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 50 以 下 に 冷 却 し 以 下 に 示 す 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたの ち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 典 型 的 な 血 清 群 O111 はソルボース 非 分 解 又 は 遅 分 解 コロニーであり 無 色 透 明 コロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 2 クロモアガーSTEC 培 地 ( 市 販 生 培 地 又 は 粉 末 培 地 使 用 :クロモアガー 社 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 ) 基 礎 培 地 ペプトン 及 び 酵 母 エキス 8.0 g 塩 化 ナトリウム 5.2 g 特 殊 酵 素 基 質 混 合 物 2.6 g 寒 天 15.0 g ph 7.0±0.2 備 考 : 基 礎 培 地 は 加 熱 溶 解 後 (オートクレーブ 不 可 過 度 の 加 熱 も 避 けること)50 以 下 に 冷 却 してから 添 付 のクロモアガーSTEC サプリメント( 選 択 剤 混 合 物 25 mg/バイアル) を2 本 加 え 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 を 作 製 する なお 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は 2~8 で 30 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O111 は 藤 色 コロニーを 形 成 する また 血 清 群 O26 O157 O121 などの 一 部 血 清 群 の 大 腸 菌 も 藤 色 コロニーを 形 成 する 3 CIX 寒 天 培 地 ( 市 販 生 培 地 : 極 東 製 薬 工 業 ) カゼインペプトン 9.7 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g 糖 類 10.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 寒 天 15.0 g 酵 素 基 質 2 種 0.2 g 選 択 剤 混 合 物 2.55 mg ph 指 示 薬 0.03 g ph 7.5±0.1 備 考 : 保 存 期 間 は 2~10 で3ヶ 月 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O111 は 群 青 色 ~ 濃 紫 色 コ

13 ロニーを 形 成 する また 血 清 群 O26 も 群 青 色 ~ 濃 紫 色 コロニーを 形 成 する 血 清 群 O157 は 青 ~ 青 緑 色 のコロニーを 形 成 する 4 Vi EHEC 培 地 ( 市 販 生 培 地 : 栄 研 化 学 ) ペプトン 13.5 g 胆 汁 酸 塩 1.2 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 酵 素 基 質 混 合 物 6.1 g 選 択 剤 g 寒 天 19.0g ph 7.2±0.2 備 考 : 保 存 期 間 は 2~10 で2ヶ 月 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O111 はえんじ 色 コロニー を 形 成 する また 血 清 群 O26 は 緑 色 O157 は 無 色 透 明 で 中 心 部 褐 色 のコロニーを 形 成 する 5 XM-EHEC 寒 天 培 地 ( 市 販 生 培 地 : 日 水 製 薬 ) ペプトン 15.0 g 塩 化 ナトリウム 3.0 g 胆 汁 酸 塩 1.8 g ソルビトール 15.0 g 発 色 酵 素 基 質 混 合 物 0.24 g 選 択 剤 5.05 mg 寒 天 13.0 g ph 7.2±0.2 備 考 : 保 存 期 間 は4~10 で 2.5 ヶ 月 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O111 は 白 濁 した 赤 紫 ~ 紫 色 コロニーを 形 成 する また 血 清 群 O26 は 青 紫 色 コロニーを 血 清 群 O157 は 赤 紫 ~ 紫 色 コロニーを 形 成 する その 他 血 清 群 O111 を 鑑 別 できる 酵 素 基 質 培 地 同 等 品 も 使 用 できる (3) 血 清 群 O157 セフィキシム 亜 テルル 酸 カリウム 添 加 ソルビトールマッコンキー(CT-SMAC) 寒 天 培 地 を 必 ず 使 用 し 酵 素 基 質 培 地 として BCM O157 寒 天 培 地 クロモアガー O157 培 地 クロモアガー O157TAM 培 地 CT-O157:H7ID 寒 天 培 地 レインボーアガー0157 培 地 のうち1 種 類 以 上 を 併 用 することと する

14 1 CT-SMAC 寒 天 培 地 ( 市 販 生 培 地 自 家 調 製 又 は 基 礎 培 地 使 用 :オキソイド 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 日 水 製 薬 メルク 栄 研 化 学 日 本 ベクトン ディッキンソン 等 ) 基 礎 培 地 ペプトン 20.0 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g ソルビトール 10.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g ニュートラルレッド 0.03 g クリスタルバイオレット g 寒 天 15.0 g ph 7.2±0.1 備 考 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 50 以 下 に 冷 却 し 以 下 に 示 す 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたの ち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 典 型 的 な 血 清 群 O157 はソルビトー ル 非 分 解 又 は 遅 分 解 コロニーであり 無 色 透 明 コロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 2 BCM O157 寒 天 培 地 ( 栄 研 化 学 ) 基 礎 培 地 トリプトン 6.0 g ポリペプトン 12.0 g 糖 類 ( 単 糖 類 二 糖 類 )40.0 g 発 色 基 質 0.4 g グラム 陽 性 菌 抑 制 剤 1.5 g フェノールレッド 0.1 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 寒 天 15.0 g 添 加 剤 亜 テルル 酸 カリウム 0.5 mg ph 6.8±0.1 備 考 : 基 礎 培 地 を 加 熱 溶 解 する(オートクレーブ 不 可 ) これを 50 以 下 に 冷 却 した 後 亜 テルル 酸 カリウムを 加 えてから 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 を 作 製 する なお, 選 択 性 を 高 めるには ノボビオシンナトリウムを 目 的 にあわせて(10 mg/1,000 ml) 添 加 す るとよい 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は 2~10 で 90 日 以 内 と する 典 型 的 な 血 清 群 O157 は 黒 ~ 濃 緑 色 コロニーを 形 成 する

15 3 クロモアガーO157 培 地 (クロモアガー 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 ) ペプトン 5.0 g 酵 母 エキス 3.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 選 択 剤 発 色 基 質 混 合 物 1.0 g 寒 天 15.0 g ph 6.8±0.1 備 考 : 培 地 は 加 熱 溶 解 後 (オートクレーブ 不 可 過 度 の 加 熱 も 避 けること)50 以 下 に 冷 却 してから 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 を 作 製 する なお 選 択 性 を 高 めるには 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 える 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は 2~8 で 30 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O157 は 藤 色 コロニーを 形 成 する 4 クロモアガーO157 TAM 培 地 (クロモアガー 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 ) ペプトン 5.0 g 酵 母 エキス 3.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 選 択 剤 発 色 基 質 混 合 物 1.0 g チオ 硫 酸 ナトリウム 鉄 混 合 物 5.0 g 寒 天 12.0g ph 6.8±0.1 備 考 : 培 地 は 加 熱 溶 解 後 (オートクレーブ 不 可 過 度 の 加 熱 も 避 けること)50 以 下 に 冷 却 してから 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 を 作 製 する なお 選 択 性 を 高 めるには 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 える 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は 2~8 で 30 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O157 は 藤 色 コロニーを 形 成 する 5 CT-O157:H7ID 寒 天 培 地 (ボトル 培 地 ; 日 本 ビオメリュー) 基 礎 培 地 ゼラチンペプトン 7.0 g NaCl 5.0 g

16 酵 母 エキス 6.0 g 炭 酸 ナトリウム 0.13 g ニュートラルレッド 0.01 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g 炭 水 化 物 混 合 物 24.0 g 活 性 混 合 物 0.25 g 発 色 基 質 混 合 物 0.25 g 寒 天 12.5 g ph 7.1 備 考 : 加 温 溶 解 後 50 以 下 に 冷 却 し 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたのち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが,その 保 存 期 間 は2~ 8 で7 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O157 は 青 緑 色 その 他 の 血 清 群 の 大 腸 菌 は 紫 色 のコロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 日 本 ビオメリュー(200 ml 培 地 用 ) 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 6 レインボーアガーO157 培 地 (バイオログ 製 造 ;GSI クレオス 販 売 ) ペプトン 6.0 g 糖 類 g 発 色 基 質 0.4 g 3-indoxyl-β-D-galactoside 0.25 g 3-indoxyl-β-D-glucuronide 0.12 g 寒 天 14.0 g ph 6.8±0.1 備 考 : 培 地 は 加 熱 溶 解 又 は 121 で5 分 間 滅 菌 した 後 50 以 下 に 冷 却 してから 滅 菌 シ ャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 を 作 製 する なお 選 択 性 を 高 めるためには ノボビオシンナ トリウムを 目 的 にあわせて 培 地 1,000 ml あたり 100 mg 添 加 するとよい ただし 血 清 群 O157 以 外 の 大 腸 菌 も 生 育 させる 場 合 は 10 mg の 添 加 とする 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は2~8 で 14 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O157 は 黒 ~ 灰 色 コロニーを 形 成 する 9. 血 清 型 別 試 験

17 各 分 離 平 板 培 地 から 血 清 群 O26 O111 及 び O157 と 疑 われるコロニーを 釣 菌 し 普 通 寒 天 培 地 等 にて 純 培 養 する( 培 養 条 件 :36±1 で 18~24 時 間 ) 免 疫 血 清 及 び 抗 体 を 感 作 したラテックスを 使 用 した 凝 集 試 薬 が 市 販 されている 試 験 方 法 は 仕 様 書 を 参 照 する 生 菌 を 用 いた 場 合 は 誤 判 定 となる 場 合 が あるため 最 終 判 定 には 加 熱 死 菌 を 用 いる 1) 血 清 群 O26 (1) 病 原 大 腸 菌 免 疫 血 清 O26 (デンカ 生 研 ) (2) E. coli O26-F 生 研 (デンカ 生 研 ) 2) 血 清 群 O111 1) 病 原 大 腸 菌 免 疫 血 清 O111 (デンカ 生 研 ) 2)E. coli O111-F 生 研 (デンカ 生 研 ) 3) 血 清 群 O157 (1) 病 原 大 腸 菌 免 疫 血 清 O157 (デンカ 生 研 ) (2) 大 腸 菌 O157 検 出 試 薬 UNI (オキソイド 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 ) (3)E. coli O157-F 生 研 (デンカ 生 研 ) 各 血 清 群 につき その 他 同 等 品 も 使 用 できる 10. 生 化 学 的 性 状 試 験 血 清 群 O26 O111 及 び O157 と 疑 われるコロニーについては 生 化 学 的 性 状 を 確 認 する TSI 寒 天 培 地 LIM 培 地 CLIG 培 地 各 種 キット 等 から 選 択 して 使 用 できる( 培 地 使 用 における 培 養 条 件 : 36±1 で 18~24 時 間 ) 1)TSI 寒 天 培 地 ( 日 水 製 薬 栄 研 化 学 メルク オキソイド 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 他 ) ペプトン 20.0 g 肉 エキス 3.0 g 酵 母 エキス 3.0 g NaCl 5.0 g 乳 糖 10.0 g ショ 糖 10.0 g ブドウ 糖 1.0 g クエン 酸 鉄 アンモニウム 0.2 g チオ 硫 酸 ナトリウム 0.2 g フェノールレッド 24 mg 寒 天 12.0 g ph 7.4±

18 備 考 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に3ml ずつ 分 注 し 121 で 15 分 間 滅 菌 後 斜 面 寒 天 ( 半 高 層 ) として 使 用 する また 市 販 品 を 使 用 してもよい TSI 寒 天 培 地 での 大 腸 菌 は 高 層 部 黄 変 斜 面 部 黄 変 硫 化 水 素 非 産 生 ガス 産 生 を 示 す 2)LIM 培 地 ( 日 水 製 薬 極 東 製 薬 工 業 栄 研 化 学 他 ) ペプトン 12.8 g 酵 母 エキス 3.0 g ブドウ 糖 1.0 g L-リジン 塩 酸 塩 10.0 g L-トリプトファン 0.5 g ブロムクレゾールパープル 0.02 g 寒 天 2.7 g ph 6.8 備 考 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に 約 5ml ずつ 分 注 し 121 で 15 分 間 滅 菌 後 急 冷 し 高 層 培 地 とする 多 くの 大 腸 菌 は 高 層 部 紫 色 変 運 動 性 陽 性 インドール 産 生 を 示 すが 高 層 部 黄 色 変 ( 血 清 群 O111 の 多 くの 株 ) 運 動 性 陰 性 など 非 定 型 の 性 質 を 持 つ 場 合 もあることから これらにつ いても 大 腸 菌 の 性 状 として 検 査 する 3)CLIG 培 地 ( 極 東 製 薬 工 業 ) カゼインペプトン 7.5 g 肉 ペプトン 2.5 g ラクトース 1.0 g セロビオース 10.0 g トリプトファン 0.1 g MUG 0.02 g NaCl 5.0 g フェノールレッド g 寒 天 14.9 g ph 7.4 備 考 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に 約 3ml ずつ 分 注 し 115 で 15 分 間 滅 菌 後 斜 面 寒 天 ( 半 高 層 ) 培 地 とする 大 腸 菌 は 高 層 部 黄 変 斜 面 部 赤 変 を 示 す 典 型 的 な 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O157 は 紫 外 線 照 射 下 で 蛍 光 を 示 さないが それ 以 外 の 血 清 型 は 蛍 光 を 示 す

19 11.VT 確 認 試 験 血 清 群 O26 O111 又 は O157 と 疑 われるコロニーについては VT 遺 伝 子 又 は VT 産 生 性 を 以 下 の 方 法 で 確 認 する 1)PCR 法 (1)O-157(ベロ 毒 素 遺 伝 子 )PCR Screening Set(タカラバイオ) (2)O-157(ベロ 毒 素 1 型 2 型 遺 伝 子 )PCR Typing Set(タカラバイオ) その 他 6.VT 遺 伝 子 検 出 法 で 使 用 した VT 遺 伝 子 検 出 法 及 び 同 等 品 も 使 用 できる 2) 逆 受 身 ラッテクス 凝 集 反 応 (RPLA) 法 (1)VTEC-RPLA 生 研 (デンカ 生 研 ) その 他 同 等 品 も 使 用 できる なお 増 菌 培 養 液 での VT 遺 伝 子 検 出 試 験 の 代 替 には 使 用 でき ない 3)イムノクロマトグラフィー 法 等 (1)デュオパス ベロトキシン(メルク 製 造 : 極 東 製 薬 工 業 販 売 ) (2)キャピリア VT(タウンズ) (3)ラインジャッジ(タウンズ) (4)NH イムノクロマト VT1/2( 日 本 ハム 製 造 : 日 水 製 薬 和 光 純 薬 工 業 極 東 製 薬 工 業 コスモ バイオ 販 売 ) (5)RIDA スクリーン ベロトキシン(アヅマックス) その 他 同 等 品 も 使 用 できる なお 増 菌 培 養 液 での VT 遺 伝 子 検 出 試 験 の 代 替 には 使 用 で きない 12. 判 定 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 血 清 群 O26 O111 又 は O157 が 分 離 されたことをもって 陽 性 とする VT 遺 伝 子 検 出 法 によって 陽 性 であったが 血 清 群 O26 O111 又 は O157 の 分 離 ができなかった 場 合 は 陰 性 とする

20 食 品 からの 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O26, O111, O157 検 査 法 ( 参 考 ) 食 品 検 体 25 g+mec 培 地 225 ml 増 菌 培 養 (42±1 22±2 時 間 ) 遺 伝 子 検 出 法 培 養 法 * 培 養 液 培 養 液 分 離 培 養 DNA 抽 出 直 接 法 免 疫 磁 気 ビーズ 法 (O26, O111, O157) VT 遺 伝 子 検 出 判 定 陰 性 終 了 VT 遺 伝 子 陽 性 CT-SMAC 1 枚 O111 用 酵 素 基 質 培 地 1 種 類 1 枚 O26 CT-RMAC 2 枚 O26 用 酵 素 基 質 培 地 など a 1 種 類 2 枚 O111 CT-SBMAC またはCT-SMAC 2 枚 O111 用 酵 素 基 質 培 地 b 1 種 類 2 枚 O157 CT-SMAC 2 枚 O157 用 酵 素 基 質 培 地 c 1 種 類 2 枚 a-c 培 地 の 詳 細 については 通 知 文 を 参 照 すること 普 通 寒 天 培 地, TSI, LIM 等 *ベロ 毒 素 (VT) 遺 伝 子 検 出 法 を 行 う ための 設 備 を 整 えることができない 等 諸 般 の 事 情 がある 場 合 について は 培 養 法 を 行 って 差 し 支 えない 血 清 型 別 試 験 生 化 学 的 性 状 試 験 VT 確 認 試 験 判 定 陰 性 陽 性