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1 第 4 回 ひびき 耐 性 菌 研 究 会 RAISUSの 基 質 特 異 性 拡 張 型 β- lactamase (ESBLs) に 関 する 評 価 ひびき 耐 性 菌 研 究 会 生 野 陽 子 江 村 佳 香 村 谷 哲 郎 右 田 忍 小 林 とも 子 和 田 明 子

2 目 的 基 質 特 異 性 拡 張 型 β- β-lactamase(esbl)は ペニシリンおよび 第 一 世 代 セファロスポリンのみならず 第 二 世 代 以 降 のセファロスポリンおよび モノバクタムを 分 解 可 能 な 外 来 性 のβ- lactamase のことであり TEM SHV type type に 加 え -M type type を 含 めた めたClass A およびOXA type type に 代 表 される Class D β- β-lactamase などがある また 院 内 感 染 を 引 き 起 こしやすい 耐 性 菌 でもあり 臨 床 検 査 科 で 早 急 に 検 出 報 告 することで 院 内 伝 播 防 止 のためにも 重 要 である そこで 今 回 国 内 で 分 離 され ひびき 耐 性 菌 研 究 会 にて にて 収 集 されたESBL 産 生 菌 について 同 定 感 受 性 測 定 装 置 イサス RAISUS ( ( 日 水 製 薬 )を )を 用 いた いた 薬 剤 感 受 性 試 験 測 定 をおこない CLSIに 準 拠 したESBL 産 生 菌 のスクリーニング 判 定 と 確 定 判 定 の 精 度 を 確 認 した また ライサス 迅 速 法 における 迅 速 判 定 時 間 も 合 わせて 検 討 した

3 ライサス 感 受 性 測 定 法 ( 迅 速 法 18 時 間 法 )の 原 理 迅 速 法 3R 法 18 時 間 法 cfu/ml 菌 液 対 数 増 殖 期 でMIC SIR 判 定 cfu/ml 菌 液 定 常 期 でSIR 判 定 CLSI 準 拠 培 養 時 間 でMIC 判 定 cfu/ml 菌 液 CLSI 準 拠 培 養 時 間 でMIC SIR 判 定 パネル 名 称 スクリーニング 用 RSCN2 確 定 試 験 用 HRGN1 研 究 用 菌 数 cfu/ml ( ) ( ) ( ) 測 定 モード 増 殖 期 CLSI 準 拠 (18 時 間 ) 迅 速 法 対 数 増 殖 (3~8 時 間 ) 定 常 増 殖 期 (5~12 時 間 ) 3R 法 18 時 間 法

4 ライサス 操 作 菌 液 調 整 (1) 菌 液 濃 度 の 調 整 フォトメーターによる 厳 密 な 菌 液 調 整 透 過 率 83±1% マクファーランド 0.5 相 当

5 ライサス 操 作 菌 液 調 整 (2)

6 ライサス 感 受 性 測 定 比 色 法 酸 化 還 元 色 素 (REDOX) 細 菌 の 還 元 作 用 水 溶 性 ホルマザン ( 黄 色 )

7 対 象 株 対 象 ひびき ひびき 耐 性 菌 研 究 会 で 収 集 され され 構 造 遺 伝 子 の 配 列 が 決 定 された された5 菌 種 株. E.coli E.coli 株 K.pneumoniae K.pneumoniae 株 P.mirabilis P.mirabilis 株 C.koseri C.koseri 株 C.freundii C.freundii 4 株 を を 用 いた. いた. ESBLのtypeは ESBLのtypeは-M type74 type74 株 SHV SHV type20 type20 株 TEM TEM type5 type5 株 である. である. E.coli 40 株 -M-2 10 株 -M-3 10 株 UOE-2 10 株 SHV-12 5 株 TEM-6 1 株 TEM-28 1 株 TEM-29 1 株 TEM-6 1 株 TEM-29like 1 株 K.pneumoniae 30 株 SHV-12 9 株 -M-2 6 株 -M-3 5 株 DHA-1 5 株 UOE-2 3 株 -M-24 1 株 SHV-12 1 株 P.mirabilis 15 株 -M-2 15 株 C.freundii 4 株 -M-2 2 株 C2 2 株 C.koseri 10 株 -M-2 10 株

8 ライサス スクリーニング 用 コンビパネル RSCN2 陰 性 菌 同 定 基 質 陰 性 菌 同 定 基 質 ABPC CEZ CFPM FMOX AZT GM LVFX ABPC CEZ CFPM FMOX AZT GM LVFX A URE 4BGL 4GLC 4SUL B PRO 4GLU 4NGL ODC C PYR 4ARA ADH PHE D 4AGL LDC 4NGU ACEA E CIT 4XYL MAL ESC 薬 剤 希 釈 系 列 16 8 CFPM FMOX AZT GM MINO CFPM FMOX AZT AMK MINO ABPC /SBT 16/ ABPC /SBT 8/ PIPC CFPM FMOX AZT AMK MINO PIPC AMK F ART 2KEG MAS RHA CONT PIPC IPM IPM IPM IPM CPFX G ARA SOR L-S CEL CONT2 1 薬 剤 希 釈 系 列 FOM FOM FOM ST ST ST CPFX H GLCA MAN NAG GLU CONT /76 2/38 1/19 1

9 ライサス 薬 剤 感 受 性 用 パネル HRGN1 研 究 用 A B C D E F G H / CVA CPR / CVA CMZ CPR / CVA CTRX /CVA cont cont 1 2 cont 3

10 スクリーニングパネル(RSCN2)での 結 果 菌 種 名 耐 性 型 別 株 数 最 終 判 定 AZT 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R E. coli -M-2 -M-3 UOE SHV TEM TEM TEM TEM-29 like TEM

11 スクリーニングパネル(RSCN2)での 結 果 菌 種 名 耐 性 型 別 株 数 K. pneumoniae -M-2 -M-3 最 終 判 定 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R M DHA SHV UOE P. mirabilis -M AZT C. freundii C M C. koseri -M

12 スクリーニングパネル(RSCN2) いずれかの 薬 剤 が 陰 性 の 株 菌 種 名 耐 性 型 別 株 数 最 終 判 定 AZT 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R -M M TEM-29 1 E. coli TEM-29 like UOE M M-3 1 K. pneumoniae - + -M SHV P. mirabilis -M C. freundii -M C. koseri -M 合 計 株 数 %

13 スクリーニングパネル(RSCN2) 菌 種 名 耐 性 型 別 株 数 最 終 判 定 AZT 迅 速 3 R 迅 速 3 R 迅 速 3 R 迅 速 3 R 迅 速 3 R E. coli TEM-29 like K. pneumoniae SHV >4 4 8 P. mirabilis -M >32 > >4 >4 合 計 株 数 %

14 確 認 パネル(HRGN1 研 究 用 )の 結 果 E.coli (1) 耐 性 型 別 CPR CPR -M-2 -M-3 > > > > > > >64 1 > > > > > > > > > > > >64 2 > > >64 1 > > >64 1 > > > > >64 1 > > > > > > > > > > > > > >64 > > > >

15 確 認 パネル(HRGN1 研 究 用 ) の 結 果 E.coli (2) 耐 性 型 別 CPR CPR UOE-2 > > > > > > >64 1 > > >64 1 > > >64 1 > >64 1 > > > > > > > SHV TEM TEM > TEM TEM-29 like TEM

16 確 認 パネルの 結 果 K.pneumoniae 耐 性 型 別 CPR CPR > > > M > > > > > > M > > > > M >32 >64 > DHA >32 64 > >32 64 > > >32 64 > >32 >64 > SHV UOE > > >32 >64 > * * * * * * * 誘 導 型 ClassCβラクタマーゼ( 産 生 *

17 確 認 パネルの 結 果 P.mirabilis 耐 性 型 別 -M-2 CPR CPR > > > > > > > > > >

18 確 認 パネルの 結 果 Citrobacter 耐 性 型 別 C. freundii C2 -M-2 CPR CPR > >64 >8 > >64 > > > > C. koseri -M-2 > >64 4 > > >64 4 > > >64 8 >128 8 > >64 4 > > >64 8 >128 1 > > > > >64 1 > > >

19 誘 導 型 ClassCβラクタマーゼ 産 生 株 耐 性 型 別 CPR CPR DHA >32 >64 > >32 64 > >32 64 > > >32 64 > SHV >32 >64 > UOE >32 >64 > 菌 種 名 耐 性 型 別 株 数 最 終 判 定 AZT 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R 迅 速 3R K. pneumoniae DHA UOE

20 確 認 パネル(HRGN1) 薬 剤 組 合 せよる 検 出 率 CPR CPR (99 株 ) (100%) 92 株 93% 92 株 93% 90 株 91% 95 株 96% CPR CPR 97 株 98%

21 迅 速 法 (RSCN2) 判 定 までの 時 間 迅 速 法 (RSCN2) 判 定 までの 時 間 E.coli 7 100% 頻 度 6 累 積 % 90% 80% 5 70% 4 60% 50% 3 40% 2 30% % 10% 判 定 時 間 :4h~8h15m 平 均 時 間 :6.5h 0% (80% 7h15m)

22 迅 速 法 (RSCN2) 判 定 までの 時 間 迅 速 法 (RSCN2) 判 定 までの 時 間 E.coli Citrobacter 7 100% % 頻 度 6 累 積 % 90% 3 80% 頻 度 累 積 % 90% 80% % 判 定 時 間 :4h~8h15m 60% 平 均 時 間 :6.5h 50% (80% 7h15m) 40% % 判 定 時 間 :3h45m~7h15m 60% 平 均 時 間 :5.0h 50% (80% 6h) 40% 2 30% 1 30% 20% % 20% 10% 0 0% 0 0% K.pneumoniae 頻 度 累 積 % 60% 判 定 時 間 :4h15m~8h45m 50% 平 均 時 間 :5.4h 100% 90% 80% 70% 40% (80% 5h4m) 30% 20% 10% 0% P.mirabilis 頻 度 累 積 % 100% 90% 80% 70% 60% 判 定 時 間 :5h15m~6h45m 50% 平 均 時 間 :6.3h 40% (80% 30% 6h30m) 20% 10% 0%

23 考 察 (ESBLsスクリーニング 判 定 について) 1) ライサスによるESBLsスクリーニング 判 定 性 能 3~4 剤 をスクリーニングパネル(RSCN2プレート)に 搭 載 することにより 5 剤 全 てで 行 う 場 合 と 同 等 の 成 績 が 得 られた したがって 今 回 の 評 価 結 果 から 日 常 検 査 においてESBLsをスクリーニン グする 際 CLSI 収 載 の 全 ての 薬 剤 を 測 定 することは 困 難 であるが プレート 構 成 薬 剤 のカスタマイズにより 特 定 の3~4 薬 剤 を 組 み 合 わせることによっ て ライサスでは 確 度 の 高 いスクリーニングが 可 能 である 事 が 示 唆 された 2) ライサスによるESBLsスクリーニング 判 定 時 間 迅 速 法 において 3.75~8.75 時 間 で100%の 検 出 感 度 で 判 定 できた したがって ライサスを 用 いる 事 により ESBLsスクリーニング 判 定 の 迅 速 性 においても 優 れた 結 果 が 得 られ より 検 査 報 告 時 間 短 縮 に 繋 がるものと 思 われた

24 考 察 (ESBLs 確 認 試 験 について) 3) ライサスによるESBLs 確 認 試 験 性 能 CLSI 準 拠 法 でESBLsと 確 認 できなかった K.pneumoniae 7 株 は ESBLs 産 生 と 同 時 に 誘 導 型 Class C βラクタマーゼを 産 生 している 菌 株 であった CVAによるβラクタマーゼ 誘 導 作 用 が 阻 害 効 果 を 上 回 ったものであると 考 えられる したがって ライサスは ESBLs 産 生 と 同 時 に 誘 導 型 Class C βラクタマー ゼを 産 生 している 菌 株 を 除 けば 検 出 感 度 100%でESBLsの 確 認 判 定 が 可 能 であった また CLSIでは 推 奨 されていないが CPRとCVA 合 剤 の 試 験 が 加 わることで 誘 導 型 Class C β lactamase 同 時 産 生 株 7 株 中 5 株 はMIC3 管 以 上 2 株 は2 管 の 低 下 が 認 められた したがって もしくはCPRとCVA 合 剤 のESBLs 確 認 試 験 を 加 える 事 で ライサスにおいて 誘 導 型 Class C β lactamase 同 時 産 生 ESBLs 検 出 の 可 能 性 が 示 唆 された

25 当 院 におけるESBLの 検 出 手 順 と 報 告 E. coli 7 時 間 判 定 (80%の 株 ) コロニー 不 足 E. coli 9 時 間 判 定 (100%の 株 ) 培 養 2 日 目 時 同 定 開 始 17 時 疑 い 報 告 確 認 試 験 10 時 増 菌 14 時 同 定 開 始 19 時 疑 い 報 告 確 認 試 験 10 時 同 定 開 始 19 時 疑 い 報 告 3 日 目 時 判 定 9 時 判 定 9 時 疑 い 報 告 9 時 疑 い 報 告 確 認 試 験 4 日 目 時 判 定 9 時 判 定

26 当 院 におけるESBLの 検 出 状 況 平 成 18 年 1 月 2 月 3 月 4 月 5 月 6 月 7 月 8 月 9 月 10 月 11 月 12 月 合 計 E. coli 尿 以 外 K. pneumoniae 尿 以 外 P. mirabilis 尿 以 外 1 1 C. koseri 尿 以 外 合 計 尿 以 外

27 当 院 におけるESBLの 検 出 状 況 平 成 18 年 1 月 2 月 3 月 4 月 5 月 6 月 7 月 8 月 9 月 10 月 11 月 12 月 合 計 E. coli 尿 以 外 K. pneumoniae 尿 以 外 P. mirabilis 尿 以 外 1 1 C. koseri 尿 以 外 合 計 尿 以 外

28 当 院 におけるESBLの 検 出 状 況 9 月 1 日 10 日 20 日 30 日 患 者 A ドレーン 先 端 からMRSA 患 者 B ドレーン 廃 液 からMRSA 患 者 C ドレーン 先 端 からMRSA 患 者 D 創 部 からESBL PFGEでアウトブレイク 判 明

29 当 院 におけるESBLの 検 出 状 況 7 月 8 月 9 月 10 月 11 月 12 月 E. coli 尿 以 外 K. pneumoniae 尿 以 外 P. mirabilis 尿 以 外 1 MRSAのPFGE 解 析 9 月 にMRSAの 院 内 感 染 を 認 めた 同 一 病 棟 で 創 部 から E. coli ESBL 検 出 C. koseri 尿 以 外 2 1 合 計 ICTの 積 極 的 介 入

30 課 題 ー 院 内 感 染 予 防 対 策 特 異 性 の 検 討 耐 性 菌 検 出 時 の 効 率 的 な 運 用 ユーザー 担 当 者 技 術 の 研 鑽 知 識 の 習 得 ( 細 菌 検 査 技 師 のレベルが 施 設 のレベル) 管 理 者 細 菌 担 当 者 の 負 担 の 少 ないシステム 構 築 メーカー 耐 性 菌 検 出 のためのパネル 作 製 ClassC β- lactamase 産 生 菌 メタロβ- lactamase 産 生 菌 新 たな 耐 性 菌 情 報 提 供

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