活 環 境 を 築 くための 科 学 的 基 礎 資 料 を 提 供 したいと 考 えている 2. 研 究 実 施 内 容 目 的 都 市 大 気 浮 遊 粒 子 状 物 質 の 約 40%はディーゼル 排 気 由 来 であることから 本 研 究 では (1)ディーゼル 排 ガス(DE)に 含 まれ

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1 内 分 泌 かく 乱 物 質 平 成 12 年 度 採 択 研 究 代 表 者 武 田 健 ( 東 京 理 科 大 学 薬 学 部 教 授 ) 大 気 中 に 存 在 する 新 しいタイプの 内 分 泌 撹 乱 物 質 1. 研 究 実 施 の 概 要 我 々は 本 プロジェクトにおいて 大 気 中 に 存 在 する 内 分 泌 撹 乱 物 質 に 注 目 した 都 市 大 気 浮 遊 粒 子 状 物 質 の 約 40%はディーゼル 排 気 由 来 であることから 本 研 究 では(1) ディーゼル 排 ガスに 含 まれる 様 々な 内 分 泌 かく 乱 物 質 を 同 定 し その 作 用 について 分 子 レベルで 解 析 する (2)ディーゼル 排 ガスの 生 殖 機 能 への 影 響 を 系 統 種 暴 露 時 期 を 変 えて 評 価 する また (3)ディーゼル 排 ガスを 妊 娠 期 に 曝 露 し 胎 仔 の 性 分 化 脳 神 経 系 及 び 生 殖 系 の 発 達 に 対 する 影 響 を 病 理 学 的 分 子 生 物 学 的 及 び 行 動 薬 理 学 的 手 法 を 駆 使 して 検 討 することを 計 画 した 以 下 プロジェクト 毎 にその 成 果 を 示 す (1) ディーゼル 排 気 微 粒 子 (DEP)には 性 ステロイドホルモンレセプターmRNA 発 現 を 抑 制 する 活 性 や 抗 アンドロゲン 様 作 用 を 示 す 活 性 があることが 明 らかになった 本 年 度 原 因 物 質 の 探 索 に 着 手 し DEP 抽 出 物 分 画 物 を 用 いて 検 討 したところ 中 性 画 分 に 原 因 物 質 が 含 まれていることが 判 明 した (2) ディーゼル 排 ガス (DE)の 胎 仔 期 曝 露 により 雄 性 マウス 胎 仔 性 分 化 関 連 因 子 (Ad4BP/SF-1 MIS) mrnaの 発 現 が 低 下 すること さらに 雌 性 マウス 胎 仔 BMP-15 mrnaの 発 現 が 低 下 することが 明 らかになった 本 年 度 胎 仔 期 にDEを 曝 露 したマウ スの 出 生 後 の 雄 性 生 殖 系 への 影 響 を 検 討 したところ 血 中 テストステロン 値 の 変 動 精 巣 組 織 像 の 変 化 および 一 日 精 子 生 産 量 の 低 下 など 悪 影 響 が 認 められ さらにその 影 響 はDEをフィルターろ 過 したガス 成 分 を 曝 露 した 場 合 でも 残 存 していた (3) DEのマウス 胎 仔 期 または 新 生 仔 期 曝 露 により 成 長 後 の 学 習 記 憶 能 力 の 低 下 が 起 こることが 示 唆 されている 本 年 度 新 生 仔 脳 内 遺 伝 子 発 現 を 検 討 した 結 果 両 曝 露 ともCYP1A1mRNA 発 現 量 の 上 昇 を 引 き 起 こし DE 中 の 成 分 が 脳 内 へ 移 行 している 可 能 性 が 示 唆 された さらに 電 子 顕 微 鏡 を 用 いた 検 討 でも 脳 内 組 織 にDEPと 推 定 される 粒 子 が 認 められている これらの 成 果 を 踏 まえ 今 後 原 因 物 資 の 同 定 作 業 を 進 め また 生 体 内 でのDEPの 取 り 込 み 移 行 蓄 積 機 構 の 解 明 を 進 めるとともに 胎 児 期 ~ 成 長 期 までの 全 域 DE 曝 露 を 実 施 して その 雄 性 生 殖 系 および 脳 神 経 系 におよぼす 影 響 を 検 討 し 安 全 で 健 康 な 生

2 活 環 境 を 築 くための 科 学 的 基 礎 資 料 を 提 供 したいと 考 えている 2. 研 究 実 施 内 容 目 的 都 市 大 気 浮 遊 粒 子 状 物 質 の 約 40%はディーゼル 排 気 由 来 であることから 本 研 究 では (1)ディーゼル 排 ガス(DE)に 含 まれる 様 々な 内 分 泌 かく 乱 物 質 を 同 定 し その 作 用 に ついて 分 子 レベルで 解 析 する (2)DE 曝 露 の 雄 性 生 殖 機 能 への 影 響 を 解 析 する (3)DE 曝 露 の 脳 神 経 系 の 発 達 に 対 する 影 響 を 病 理 学 的 分 子 生 物 学 的 及 び 行 動 薬 理 学 的 手 法 を 駆 使 して 検 討 することを 目 的 とした 方 法 1. ディーゼル 排 気 微 粒 子 (DEP)に 含 まれる 様 々な 内 分 泌 かく 乱 物 質 の 同 定 とその 作 用 機 序 1.1 エストロゲンレセプターmRNA(ERmRNA) 発 現 低 下 に 関 与 する 物 質 の 同 定 精 巣 ライディッヒ 細 胞 株 TM3 細 胞 にDEP 分 画 試 料 を 処 理 し ERmRNA 発 現 量 を 定 量 的 に 解 析 した 1.2 抗 アンドロゲン 物 質 の 同 定 酵 母 ハイブリッド 法 を 用 いてDEP 分 画 試 料 の 抗 アンドロゲン 作 用 の 評 価 を 行 な った ソックスレー 抽 出 法 で 得 られたDEP 抽 出 物 を 水 溶 性 強 酸 性 脂 溶 性 強 酸 性 弱 酸 性 フェノール 性 中 性 塩 基 性 の 六 画 分 に 分 画 し 検 討 した 2. DE 曝 露 による 雄 性 生 殖 系 への 影 響 ICR 系 妊 娠 マウスに 妊 娠 2 日 目 から16 日 目 までの 期 間 1 日 12 時 間 1.0 mg DEP/m 3 の 濃 度 でDEおよびfiltered-DE (0.30 µm 以 上 の 粒 子 状 物 質 を99.97% 除 去 するフィ ルターを 使 用 ) を 曝 露 した 妊 娠 17 日 目 以 降 は 清 浄 大 気 下 で 出 産 飼 育 し 対 照 群 は 全 期 間 清 浄 大 気 下 で 飼 育 した 雄 性 出 生 仔 を8 16 日 齢 および 週 齢 で 麻 酔 下 に 心 採 血 し 生 殖 器 を 摘 出 して 重 量 を 測 定 した 各 臓 器 をホルマリンで 固 定 後 HE 染 色 し 光 学 顕 微 鏡 下 に 組 織 学 的 検 討 を 行 なった DSPは 精 巣 をホモジナイ ズして 精 子 濃 度 を 求 め 重 量 換 算 して 算 出 した また ELISA 法 で 血 清 中 総 テストステロン 濃 度 を 測 定 した さらに 定 量 的 PCR 法 で 精 巣 におけるテストステロン 分 泌 を 調 節 するホ ルモンのレセプターおよびテストステロン 産 生 に 関 与 する 性 ステロイドホルモン 合 成 関 連 因 子 の 各 mrna 発 現 量 を 測 定 した 3. 曝 露 による 脳 神 経 系 の 発 達 に 対 する 影 響 3.1 各 種 遺 伝 子 発 現 に 対 する 影 響 ICR 系 マウスにDEを mgdep/m 3 の 濃 度 で 曝 露 し 対 照 群 は 清 浄 大 気 下 で 飼 育 した 暴 露 時 期 は 以 下 のように 設 定 した 1 胎 仔 期 DE 暴 露 : 妊 娠 2 日 目 から 妊 娠 16 日 目 まで 母 体 曝 露 2 新 生 仔 期 DE 暴 露 : 出 生 日 から16 日 目 まで 母 仔 共 に 曝 露 仔 マウスを 日 齢 の 時 点 で 解 剖 し 脳 および 血 液 を 採 取 した 前 脳 部

3 を 材 料 とし 定 量 的 PCR 法 を 用 いて 性 ステロイドホルモン 関 連 遺 伝 子 群 甲 状 腺 ホルモン 関 連 遺 伝 子 群 ストレス 応 答 遺 伝 子 群 の 発 現 量 を 測 定 した 3.2 脳 神 経 組 織 の 病 理 学 的 解 析 ICR 系 妊 娠 マウスに 妊 娠 2 日 目 から16 日 目 まで 胎 仔 期 曝 露 を 行 い その 出 生 仔 脳 組 織 を8 週 および11 週 齢 時 に 採 取 し 光 学 顕 微 鏡 および 電 子 顕 微 鏡 を 用 いた 組 織 学 的 検 討 を 行 なった 結 果 考 察 1. ディーゼル 排 気 微 粒 子 (DEP)に 含 まれる 様 々な 内 分 泌 かく 乱 物 質 の 同 定 とその 作 用 機 序 1.1 ERmRNA 発 現 低 下 に 関 与 する 物 質 の 同 定 DPE 抽 出 物 分 画 物 を 用 いてERmRNA 発 現 量 への 影 響 を 検 討 した 結 果 中 性 物 質 画 分 (N)にERmRNA 発 現 量 を 低 下 させる 原 因 物 質 が 含 まれていることが 推 察 された N 画 分 のカラムクロマト 分 画 物 には 複 数 の 画 分 に 低 下 活 性 が 認 められた また CYP1A1mRNA 発 現 誘 導 が 種 々の 画 分 で 認 められたことからAhレセプター 刺 激 物 質 は 多 数 存 在 することが 示 唆 された 1.2 抗 アンドロゲン 物 質 の 同 定 得 られた 六 画 分 は いずれの 画 分 もアンドロゲン 作 用 は 示 さなかったが 弱 酸 性 フェノール 性 中 性 の 各 画 分 に 抗 アンドロゲン 作 用 が 認 められた これらの 物 質 についてさらに 分 画 し 最 終 的 にLC/MSを 行 なったところ 分 子 量 259 及 び 212の 物 質 が 含 まれることが 明 らかとなった 2. DE 曝 露 による 雄 性 生 殖 系 への 影 響 胎 仔 期 DE 曝 露 では 体 重 が8 日 齢 および5 週 齢 で 有 意 に 低 下 し 16 日 齢 で 低 下 傾 向 を 示 した 一 方 体 重 換 算 した 副 生 殖 腺 重 量 は 8および16 日 齢 で 有 意 に 増 加 し 5 週 齢 で 低 下 傾 向 を 示 した また DSPが5および12 週 齢 で 有 意 に 低 下 した DSP 低 下 の 原 因 を 検 討 する 目 的 で テストステロンおよび 同 合 成 関 連 因 子 の 遺 伝 子 レベル での 解 析 を 行 なった その 結 果 血 清 中 テストステロン 濃 度 は 3 週 齢 で 有 意 に 減 少 し 12 週 齢 で 有 意 に 上 昇 した また テストステロン 合 成 関 連 因 子 mrna 発 現 量 では 5 週 齢 でFSHRが 有 意 な 増 加 ARが 増 加 傾 向 を 示 し 12 週 齢 でStARが 有 意 に 増 加 ERおよび17β-HSDが 減 少 傾 向 を 示 した 一 方 胎 仔 期 filtered-de 曝 露 では 体 重 換 算 した 精 巣 重 量 が16 日 齢 で 有 意 に 低 下 し 8 日 齢 で 低 下 傾 向 を 示 した また DE 曝 露 群 と 同 様 にDSPが12 週 齢 で 有 意 に 低 下 した さらに 血 清 中 テストステロン 濃 度 が5 週 齢 で 有 意 に 上 昇 した mrna 発 現 量 では 5 週 齢 でFSHRが 有 意 に 増 加 し LHRが 増 加 傾 向 を 示 し 12 週 齢 でLHR P450c17および17β-HSDが 有 意 に 増 加 し StARが 増 加 傾 向 を 示 した さらに 精 巣 組 織 の 観 察 の 結 果 両 曝 露 とも 減 数 分 裂 異 常 像 である 多 核 巨 細 胞 が 多 く 認 められたほか 精 細 管 内 空 胞 化 や 分 裂 停 止 像 の 増 加 などの 異 常 所 見 が 認 められた したがって DEあるいはfiltered-DEの 胎 仔 期 曝 露 はともに 血 清 中 テストステロ

4 ン 濃 度 の 変 動 および 精 巣 組 織 細 胞 の 異 常 像 を 惹 起 しており その 結 果 精 子 形 成 を 抑 制 している 可 能 性 が 示 唆 され 出 生 仔 の 精 巣 機 能 に 有 害 な 影 響 を 与 えることが 示 された 3. 曝 露 による 脳 神 経 系 の 発 達 に 対 する 影 響 3.1 各 種 遺 伝 子 発 現 に 対 する 影 響 1 胎 仔 期 DE 暴 露 :DE 暴 露 により2 日 齢 におけるCYP 1A1 mrna 発 現 量 が 増 加 した が その 後 の 発 現 上 昇 は 確 認 できなかった また 2 日 齢 雌 および5 日 齢 雄 で ER α horumrna ER β mrna Aromatase mrna 発 現 量 が 増 加 した 2 新 生 仔 期 DE 暴 露 :DE 暴 露 により5 日 齢 におけるCYP 1A1 mrna 発 現 量 が 増 加 し た また 雄 の 新 生 仔 におけるHO-1 mrna 発 現 量 が 増 加 したが 雌 では 確 認 できなかった 2 日 齢 におけるER α mrna 発 現 量 が 雌 雄 ともに 増 加 し とく に 雌 では5および16 日 齢 においても 増 加 した 以 上 周 産 期 のDE 暴 露 は 新 生 仔 の 脳 の 成 熟 や 性 分 化 に 重 要 な 遺 伝 子 の 発 現 に 影 響 を 与 える 可 能 性 が 示 唆 され 今 後 これらの 変 動 により 血 中 ホルモン 値 や 行 動 へ 影 響 が 与 えられるのかどうかを 検 討 する 必 要 があると 思 われた 3.2 脳 神 経 組 織 の 病 理 学 的 解 析 曝 露 群 において 大 脳 皮 質 小 脳 海 馬 にcaspase3 陽 性 細 胞 が 散 在 して 認 めら れた 電 子 顕 微 鏡 的 にもapoptosis 小 体 形 成 過 程 の 特 徴 的 所 見 であるクロマチン の 不 均 一 な 凝 集 やCrescent-Shaped Spacesを 伴 った 核 不 整 を 呈 する 細 胞 が 確 認 さ れた また 末 梢 微 小 血 管 周 囲 にある 清 掃 細 胞 数 が 減 少 傾 向 にあり その 細 胞 質 内 顆 粒 に 変 性 像 やDE 粒 子 と 疑 われる 沈 着 物 質 が 観 察 された さらに 血 管 周 囲 に あるアストロサイトの 膨 潤 化 および 微 小 血 管 狭 窄 が 各 部 位 に 散 在 的 に 認 められた これらの 結 果 より 母 体 のDE 曝 露 がその 出 生 仔 の 脳 組 織 に 対 して 病 理 学 的 影 響 を 与 えた 可 能 性 が 高 く 学 習 記 憶 および 行 動 におよぼす 影 響 が 推 定 されることから 今 後 それらに 対 する 詳 細 な 検 討 が 必 要 であると 考 えられた 3. 研 究 実 施 体 制 In vitroグループ 1 研 究 分 担 グループ 長 : 武 田 健 ( 東 京 理 科 大 学 薬 学 部 教 授 ) DEPに 含 まれる 化 学 物 質 の 内 分 泌 かく 乱 作 用 の 解 析 In vivoグループ 1 研 究 分 担 グループ 長 : 武 田 健 ( 東 京 理 科 大 学 薬 学 部 教 授 ) 胎 仔 期 ディーゼル 排 ガス 暴 露 による 雌 性 雄 性 生 殖 系 内 分 泌 系 免 疫 系 への 影 響

5 In vivoグループ 1 究 分 担 グループ 長 : 武 田 健 ( 東 京 理 科 大 学 薬 学 部 教 授 ) ディーゼル 排 ガス 胎 仔 期 暴 露 の 脳 神 経 系 におよぼす 影 響 の 解 析 4. 主 な 研 究 成 果 の 発 表 ( 論 文 発 表 および 特 許 出 願 ) (1) 論 文 ( 原 著 論 文 ) 発 表 Takeda, K., Tsukue, N., and Yoshida, S.: Endocrine-disrupting activity of chemicals in diesel exhaust and diesel exhaust particles. Environmental Science.11,1, ,2004 Tsukue, N., Yoshida, S., Sugawara, I., and Takeda, K.: Effect of Diesel Exhaust on Development of Fetal Reproductive Function in ICR Female Mice. Journal of Health Science, 50 (2), ,2004 (2) 特 許 出 願 なし

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