平成22年6月28日

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1 平 成 22 年 6 月 28 日 海 洋 深 層 水 及 びβ-グルカンを 基 材 に 用 いた 化 粧 品 の 機 能 評 価 皮 膚 における 機 能 性 の 研 究 高 知 大 学 医 学 部 看 護 学 科 臨 床 看 護 学 教 室 渡 部 嘉 哉 溝 渕 俊 二 我 々はこれまで 深 層 水 と ソフィβ グルカン(SBG) の 機 能 性 をそれ ぞれ 独 立 したテーマとして 研 究 を 行 ってきた しかし これまでの 両 者 の 研 究 結 果 を 鑑 み 2 つの 物 質 を 合 わせることによって 新 たな 機 能 性 素 材 へと 発 展 する 可 能 性 を 見 出 し 本 研 究 に 着 手 した 我 々が 行 った 深 層 水 に 関 する 研 究 では アレルギー 性 炎 症 の 病 態 を 増 悪 する と 考 えられている 白 血 球 の 好 酸 球 に 焦 点 を 絞 り 解 析 を 行 ってきた その 結 果 深 層 水 によって 好 酸 球 の 活 性 化 特 に NADPH oxidase に 由 来 する 活 性 酸 素 の 産 生 が 阻 害 される 傾 向 を 見 出 した また 本 学 の 小 児 科 のグループが 行 った 臨 床 試 験 では アトピー 性 皮 膚 炎 の 患 者 に 深 層 水 を 塗 布 することによって 症 状 を 軽 減 するとの 報 告 を 行 っている また 過 去 の シュウウエムラ 化 粧 品 の 研 究 で 深 層 水 原 水 を 用 いて 低 濃 度 では 正 常 皮 膚 細 胞 の 増 殖 を 促 進 するとの 結 果 が 報 告 されている これらの 効 果 は 深 層 水 が 持 つ 清 浄 性 が 大 きく 寄 与 していると 考 えられているが それ 以 外 にも 深 層 水 中 にはいまだ 解 明 されていない 細 胞 の 機 能 を 調 整 する 物 質 が 含 有 されている 可 能 性 は 否 定 できない シュウ ウエ ムラ 化 粧 品 の 報 告 によると 深 層 水 原 水 が 高 濃 度 になると 細 胞 の 増 殖 を 阻 害 し ており その 原 因 を 深 層 水 中 に 含 まれる 塩 による 浸 透 圧 の 上 昇 と 結 論 づけてい ることから 今 回 は RO 水 に NaCl を 添 加 し 等 張 条 件 に 調 整 した 標 品 で 試 験 を 行 った SBG は 高 知 県 仁 淀 川 町 に 本 社 を 有 する ソフィが 製 造 しており 黒 酵 母 が 産 生 する 水 溶 性 β-1,3-1,6-グルカンを 主 成 分 としている 厚 生 労 働 省 から 黒 酵 母 培 養 液 として 食 品 添 加 物 の 認 可 を 受 けており また 本 学 においても 十 分 な 毒 性 試 験 を 行 っているため その 安 全 性 は 担 保 されている SBG の 代 表 的 な 機 能 性 は 免 疫 賦 活 効 果 にある 我 々の 研 究 過 程 で 特 に 細 胞 性 免 疫 の 賦 活 効 果 を 見 出 し 積 極 的 に 学 会 等 で 発 表 してきた また 逆 に 液 性 免 疫 は 阻 害 すると のデータが 得 られていることから アレルギー 性 疾 患 に 対 しては 治 癒 方 向 に 機 能 する 可 能 性 が 高 い

2 以 上 のように 深 層 水 と SBG にはそれぞれ 細 胞 に 対 して 機 能 性 を 有 する 物 質 が 含 有 されており 深 層 水 と SBG のそれぞれの 効 果 は アレルギー 性 皮 膚 炎 の 治 癒 方 向 への 効 果 が 期 待 できるデータが 得 られている また その 作 用 機 序 は 深 層 水 と SBG の 物 性 由 来 組 成 含 有 物 の 分 子 構 造 の 違 いから 同 一 のもので あるとは 考 え 難 い そこで 両 者 を 混 和 することによって 新 たな 効 果 が 引 き 出 せ ると 考 え 本 試 験 に 着 手 した また 単 純 に 混 和 するだけではなく 本 研 究 中 に ミューズの 技 術 で SBG を 低 分 子 化 し 混 和 した 試 作 品 の 開 発 に 成 功 したので その 効 果 についても 検 討 を 行 った 今 回 は 特 にアレルギー 性 皮 膚 炎 への 塗 布 剤 を 想 定 し 以 下 の 3 項 目 について 解 析 を 行 った 1. 標 品 ( 試 作 品 )の 皮 膚 細 胞 の 増 殖 に 関 する 効 果 についての 評 価 題 目 : 正 常 繊 維 芽 細 胞 に 対 する 増 殖 効 果 2. 標 品 ( 試 作 品 )の 肥 満 細 胞 好 塩 基 性 球 の 脱 顆 粒 に 与 える 影 響 の 評 価 題 目 : 肥 満 細 胞 系 培 養 細 胞 のヒスタミン 放 出 に 与 える 効 果 3. 標 品 ( 試 作 品 )の 抗 酸 化 能 に 関 する 評 価 題 目 : 抗 酸 化 効 果 1. 正 常 繊 維 芽 細 胞 に 対 する 増 殖 効 果 アレルギー 性 皮 膚 炎 では 皮 膚 の 損 傷 が 起 こるため 病 巣 の 修 復 治 癒 には 皮 膚 細 胞 の 増 殖 が 必 須 である 今 回 はヒト 正 常 繊 維 芽 細 胞 (CCD-1056SK:Skin, fibroblast, normal control, human, 26 years, Female)に 対 する 増 殖 効 果 を 試 験 した CCD-1056SK 細 胞 は 10% fital bovine serum, 1.0 mm ピルビン 酸 0.1 mm non-essential amino acids 添 加 MEM-E 培 地 中 で 培 養 を 行 った cell/ml に 種 々の 標 品 で 懸 濁 した 細 胞 を 96 穴 プレートで 容 量 100 µlで 培 養 を 行 った 細 胞 播 種 後 24 時 間 の 前 培 養 を 行 い 付 着 していない 細 胞 を 除 去 した 後 種 々の 条 件 下 で 試 験 を 行 った なお 培 養 は 5% CO 2 37 条 件 下 で 行 った

3 ⅰ) 単 純 混 和 物 による 試 験 方 法 : 深 層 水 あるいは SBG を MEM-E 培 地 で 希 釈 し CCD-1056SK 細 胞 の 増 殖 につ いて 試 験 を 行 った なお 深 層 水 あるいは SBG の 浸 透 圧 は 1 容 のサンプルに 対 して 9 容 の 9%NaCl を 添 加 し 等 張 に 調 整 した 浸 透 圧 調 整 後 の 検 体 を 濃 度 100% と 定 義 した SBG の 混 和 はグルカン 分 子 を 損 傷 しないようにピペッティングで 緩 やかに 行 った 効 果 は Cell Counting Kit( 同 人 堂 )を 用 いて 比 色 によって 評 価 した 結 果 及 び 考 察 : 深 層 水 SBG ともに 添 加 量 3.12% 培 養 3 日 目 で 最 も 効 果 が 認 められた ( 図 1)この 結 果 は シュウウエムラ 化 粧 品 が 深 層 水 の 添 加 量 5% で 繊 維 芽 細 胞 の 増 殖 効 果 が 認 められたと 報 告 しており その 結 果 と 非 常 に 近 い 数 値 となった よって 深 層 水 の 添 加 量 には 最 適 濃 度 が 存 在 する 可 能 性 があり この 点 は 今 後 の 検 討 が 必 要 である 図 1 対 象 群 である 純 水 の 増 殖 を 100%とした 場 合 深 層 水 106.8±8.80% SBG ±6.92% 深 層 水 +SBG 94.0±2.05%であった 深 層 水 単 独 でも 増 殖 促 進 傾 向 はあるものの 統 計 的 有 意 差 は 認 められなかった (p=0.215)sbg 単 独 で 最 も 優 れた 効 果 が 認 められ 統 計 的 にも 有 意 差 が 認 められた (p=0.002)しかしなが ら 両 者 を 単 純 に 混 和 すると 増 殖 効 果 は 消 滅 した (p=0.347)この 現 象 は SBGの 凝 集 に 起 因 すると 考 察 した つまり SBGは 2 価 イオン 存 在 下 で 凝 集 する 性 質 を 有 するため 深 層 水 中 のCa 2+, Mg 2+ のような2 価 イオンとSBGが 反 応 した 結 果 凝 集 が 生 じ 細 胞 に 対 する 効 果 が 喪 失 したと 考 えた SBGが 凝 集 しない 条 件 つまり 相 加 効 果 が 得 られるための 環 境 を 作 るため ミューズが 有 するノウハ ウによってSBGの 低 分 子 化 を 含 めたサンプルの 加 工 調 整 を 試 みた

4 ⅱ) 試 作 品 による 検 討 方 法 : 培 養 方 法 評 価 方 法 は 単 純 混 和 試 験 に 準 じる SBG の 低 分 子 化 及 び 混 和 は ミューズ 中 島 らの 方 法 で 行 った 実 験 群 は 対 象 群 である 純 水 純 水 + 低 分 子 化 SBG 深 層 水 単 独 群 試 作 品 の 4 群 とした 細 胞 を 種 々の 条 件 下 に 置 いた 後 3 日 間 の 細 胞 増 殖 に 与 える 効 果 について 検 討 した 図 2 結 果 及 び 考 察 :1 日 目 は 4 群 間 で 全 く 差 は 認 められなかった 2 日 目 以 降 純 水 と 比 較 して 純 水 + 低 分 子 化 SBG 深 層 水 試 作 品 すべての 群 で 増 殖 促 進 効 果 が 認 められた またこの 差 は 統 計 学 的 にもすべての 群 間 で 有 意 であった(p<0.01) その 効 果 は 深 層 水 < 純 水 + 低 分 子 化 SBG< 試 作 品 の 順 であった ( 図 2) この 結 果 と 先 の 単 純 混 和 試 験 を 比 較 すると 非 常 に 興 味 深 い 違 いが 認 められた つまり 単 純 混 和 試 験 では 深 層 水 SBG それぞれ 単 独 添 加 では 細 胞 増 殖 効 果 が 認 められたが 混 和 することによりその 効 果 が 低 下 してしまった しかしながら ミューズが 開 発 した 試 作 品 では 両 者 が 共 存 する 状 態 で 細 胞 増 殖 能 が 保 たれ ており さらにその 効 果 は 深 層 水 と SBG それぞれの 単 独 での 効 果 より 優 れてい た つまり 試 作 品 は 相 加 的 効 果 が 認 められた

5 2. 肥 満 細 胞 系 培 養 細 胞 のヒスタミン 放 出 に 与 える 効 果 アレルギー 性 皮 膚 炎 では 痒 みが 生 じる この 痒 みは 病 巣 部 に 浸 潤 した 肥 満 細 胞 が 脱 顆 粒 で 放 出 するヒスタミンによって 誘 起 される このヒスタミンの 放 出 を 抑 制 できれば 痒 みの 軽 減 が 期 待 できると 考 え 本 実 験 を 計 画 した 本 研 究 で は P815 細 胞 (マウス 肥 満 細 胞 :Mastocytoma, DBA/2 マウス 由 来 )を 用 いて 試 験 を 行 った 指 標 はカルシウムイオノフォア A23187 刺 激 に 伴 うヒスタミン 放 出 量 を 用 い その 評 価 はヒスタミン 量 を ELISA 法 で 測 定 した 方 法 :P815 細 胞 は 10% fital bovine serumを 添 加 したDMEM 培 地 中 で 培 養 を 行 っ た 深 層 水 標 品 は ミューズによる 低 分 子 化 SBG 添 加 物 を 用 いた 実 験 群 は 対 象 群 である 純 水 純 水 + 低 分 子 化 SBG 深 層 水 単 独 群 試 作 品 の 4 群 とした 96 穴 プレートに 細 胞 を 終 濃 度 cells/mlに 種 々の 標 品 で 懸 濁 し 5% CO 2 37 で 20 分 間 の 前 培 養 を 行 った 後 5mMのA23187 で 刺 激 を 行 った A23187 刺 激 を 行 う 前 に 有 濃 度 1 mmのcacl 2 を 添 加 した さらに 5% CO 2 37 で 20 分 間 の 培 養 を 行 い 上 澄 に 含 まれるヒスタミン 量 を 測 定 した 各 々の 群 からA23187 刺 激 を 行 っていない 時 のヒスタミン 量 を 差 し 引 き 対 照 群 となる 純 水 のヒスタミ ン 量 を 100%とした 相 対 放 出 量 を 表 した ( 図 3) 結 果 及 び 考 察 : 今 回 の 試 験 ではすべての 群 でヒスタミンの 放 出 阻 害 は 認 められ なかった 純 水 を 100%とした 場 合 それぞれの 群 のヒスタミン 放 出 量 と 純 水 と 比 較 した 場 合 の p 値 は 純 水 + 低 分 子 SBG で 98.0±6.9%(p=0.694) 深 層 水 で 97.7±4.8%(p=0.808) 試 作 品 では 96.2±5.2%(p=0.618)で 統 計 的 な 差 は 無 かった 図 3

6 しかしながら 深 層 水 にはアトピー 性 皮 膚 炎 患 者 への 塗 布 によって 痒 みの 軽 減 が 報 告 されている また SBG には 細 胞 性 免 疫 を 活 性 化 する 働 きがあるため 液 性 免 疫 が 優 位 になっているアレルギー 疾 患 では 治 癒 傾 向 に 働 く 可 能 性 が 高 い 事 実 我 々はアトピー 性 皮 膚 炎 モデルマウスである Nc/Nga マウスに SBG を 経 口 投 与 することによって 末 梢 血 仲 IgE の 上 昇 を 抑 制 するデータを 得 ている 本 試 験 で 効 果 が 得 られなかった 原 因 の 一 つとして 細 胞 と 物 質 が 接 している 時 間 が 短 かったためと 予 想 している 特 に SBG による 肥 満 細 胞 への 効 果 は 受 容 体 を 介 した 反 応 であるため 脱 顆 粒 抑 制 を 来 すためには 長 期 接 触 が 必 要 である 可 能 性 が 高 い 今 後 は 前 培 養 段 階 から 種 々のサンプルを 添 加 し その 効 果 を 検 討 する 予 定 である あるいは 他 の 白 血 球 からの 肥 満 細 胞 への 効 果 も 予 想 される つ まり 深 層 水 あるいは SBG によってリンパ 球 あるいはマクロファージなどの 白 血 球 が 活 性 化 され IL-12,IFN-γのような 細 胞 性 免 疫 を 誘 起 するサイトカイン が 産 生 される 可 能 性 がある 事 実 SBG では 経 口 投 与 によって 抹 消 血 中 IFN-γ 濃 度 が 優 位 に 上 昇 するとのデータを 得 ている それらのサイトカインが 肥 満 細 胞 に 作 用 する 可 能 性 がある 以 上 のような 生 体 内 でのネットワークを 介 した 系 を 解 析 するためマウスを 用 いた 実 験 系 も 準 備 中 である

7 3. 抗 酸 化 効 果 アレルギー 性 皮 膚 炎 では 炎 症 を 伴 うことが 多 く 炎 症 を 軽 減 させることで 病 態 の 緩 和 への 寄 与 が 期 待 できる 炎 症 を 誘 起 する 分 子 の 一 つとして 活 性 酸 素 分 子 種 の 関 与 が 考 えられることから 本 試 験 では 深 層 水 あるいは SBG による 抗 酸 化 能 を 試 験 した ⅰ) 単 純 混 和 物 による 試 験 方 法 : 種 々のサンプルの 抗 酸 化 力 は SOD 活 性 を 指 標 とした SOD 活 性 は SOD assay Kit-WST( 同 人 科 学 研 究 所 )を 用 いて 測 定 した SBG の 添 加 量 は 反 応 系 の 最 大 添 加 量 である 10%とした グルカンの 混 和 は 細 胞 増 殖 試 験 と 同 様 に グルカン 分 子 を 損 傷 しないようにピペッティングで 緩 やかに 行 った 結 果 及 び 考 察 : 深 層 水 では SOD 活 性 は 認 められなかったものの SBG では 18.8 ±2.24%の 活 性 が 認 められた ( 図 4)また 深 層 水 と 混 和 してもその 効 果 は 保 持 されており その 値 は 15.0±5.35%であった 深 層 水 と SBG を 混 和 するこ とによって 若 干 の 活 性 低 下 が 認 められたが 両 群 間 に 統 計 的 有 意 差 は 認 められな かった (p=0.273) ( 図 4) 以 上 のように SBG には SOD 活 性 つまり 抗 酸 化 力 が 認 められた この 効 果 を 塗 布 剤 に 応 用 することで 皮 膚 の 炎 症 を 緩 和 する 素 材 へと 発 展 する 可 能 性 が 示 唆 さ れた

8 ⅱ) 試 作 品 による 検 討 方 法 : 評 価 方 法 は 単 純 混 和 試 験 に 準 じる SBG の 低 分 子 化 及 び 混 和 は ミューズ 中 島 らの 方 法 で 行 った 実 験 群 は 対 象 群 である 純 水 純 水 + 低 分 子 化 SBG 深 層 水 単 独 群 試 作 品 の 4 群 とした 結 果 及 び 考 察 : 加 工 により SBG による 抗 酸 化 力 は 喪 失 していた 効 果 喪 失 の 原 因 として 現 時 点 では 仮 説 であるが 加 工 によるグルカン 分 子 の 低 分 子 化 に 起 因 すると 考 えている グルカンによる 抗 酸 化 力 にはその 分 子 中 に 存 在 するリン 酸 基 が 重 要 な 役 割 をしていると 予 想 されている 低 分 子 化 処 理 によってグルカ ンの 分 子 構 造 が 変 化 し その 結 果 リン 酸 基 の 存 在 形 態 に 何 らかの 変 化 が 起 こっ たものと 考 える これは 今 回 の 加 工 は 細 胞 増 殖 を 第 一 優 先 で 行 ったことも 一 因 である 今 後 は 細 胞 増 殖 力 と 抗 酸 化 力 の 両 方 の 機 能 を 保 持 した 加 工 方 法 の 開 発 が 期 待 される あるいは 他 の 素 材 で 抗 酸 化 力 を 補 う 手 法 も 検 討 に 値 すると 考 える 結 語 以 上 のように 深 層 水 SBG ともに 非 常 に 大 きな 可 能 性 を 秘 めた 素 材 である 深 層 水 については 一 時 のブームが 去 り 過 去 のもののように 扱 われがちである が その 機 能 性 の 機 序 は 明 確 になっておらず さらに 研 究 を 進 めることで 新 し い 利 用 方 法 が 発 見 される 可 能 性 を 持 っている SBG も 飲 用 による 試 験 はヒト マ ウスで 広 く 行 われているが 塗 布 による 効 果 は 全 く 未 知 数 である 本 研 究 は 時 間 的 な 制 約 もあったため 深 く 踏 み 込 んだ 解 析 は 行 えなかった しかしながら 今 後 の 発 展 が 期 待 できる 多 くのデータが 得 られた 本 研 究 で 得 られた 情 報 をも とに アトピー 性 皮 膚 炎 をはじめとする 皮 膚 疾 患 に 対 して 機 能 性 を 有 する 素 材 の 開 発 を 続 けて 行 く 計 画 である

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