X 線結晶学者のためのクライオ電子顕微鏡解析の手引き (2) クライオ電子顕微鏡単粒子解析の実際 ~ 試料調製から画像解析まで ~ Tsubasa HASHIMOTO, Takeshi YOKOYAMA and Yoshikazu TANAKA: Actual Situa

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しなつじゅふく
1 years ago
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1 X 線結晶学者のためのクライオ電子顕微鏡解析の手引き (2) クライオ電子顕微鏡単粒子解析の実際 ~ 試料調製から画像解析まで ~ Tsubasa HASHIMOTO, Takeshi YOKOYAMA and Yoshikazu TANAKA: Actual Situation of Cryo-Electron Microscopy Single Particle Analysis; From Sample Preparation to Image Analysis Recent marked development called Resolution revolution has made cryo-electron microscopy Cryo-EM the third method of structure determination at atomic resolution next to X-ray crystallography and NMR. In this review, actual situation surrounding Cryo-EM including an outline about the workflow from sample preparation to image analysis and differences between Cryo-EM analysis and X-ray crystallography is introduced. We hope that this review is useful for researchers particularly who will start Cryo-EM analysis. 1. はじめに X NMR 図 X ,4 X 5 図 1 PDB Change of the number of PDB depositions. PDB 89

1.22 Å 1.7 Å GABA-A 2 Å 6 52 kda 1.93 Å 7 8 X 2.

Vitrobot Leica EM GP2 グリッドグリッドスクエアカーボン膜 Top View ホール粒子氷 Side View 3 mm 図 3

1 1 試料調製 2 凍結グリッド作製 3 データ測定 4 画像解析目的分子の発現抽出目的分子の精製クロマトグラフィー限外ろ過密度勾配遠心法 etc.

2 1.22 Å 1.7 Å GABA-A 2 Å 6 52 kda 1.93 Å 7 8 X 2. クライオ電子顕微鏡単粒子解析の流れ図 2 X nm μm 9 1 μm quantifoil 図 3 Thermo Fisher Scientific Vitrobot Leica EM GP2 グリッドグリッドスクエアカーボン膜 Top View ホール粒子氷 Side View 3 mm 図 3 Schematic diagram of typical Cryo-EM grid. 1 1 試料調製 2 凍結グリッド作製 3 データ測定 4 画像解析目的分子の発現抽出目的分子の精製クロマトグラフィー限外ろ過密度勾配遠心法 etc.. 純度濃度のチェック例 : リボソームの負染色観察像精製試料 Vitrobot グリッドグリッドを凍結氷粒子 CRYO ARM 300 凍結グリッドグリッド挿入箇所顕微鏡画像粒子をピック二次元平均化三次元再構成図 2 Workflow of Cryo-EM single particle analysis

3 C Vitrobot 図 4 S/N , グリッド厚氷の厚み薄ホールの様子ホール内の粒子 100 µm 1 µm 100 nm!"" #$ 図 4 Images of a frozen grid in different magnification

橋本翼横山武司田中良和コントラストが悪い氷が厚いを行い類似した二次元画像同士を平均化した二次元コントラストが良い氷が薄い平均像を得るここで複数の粒子を平均化することにより S/N 比の高い像を取得することができ目的のもの 50 nm ではない粒子を取り除くことができる二次元分類によ 50 nm りおおまかな粒子の選別を行った後は三次元構造の再構成を行う

ことができるここまでに紹介してきた画像解析のためのさまざまなプログラムが開発されているが現在最も広く使用され 14,15 relion ているものは relion というプログラムである ①添加剤無し全体的にホールが黒く氷が厚い ②ジギトニン添加 ③Tween20添加ホールの中央が白く凹状の氷が張られている図 5 氷の厚さによるホール粒子の見え方の違い Effect of

試料中に①界面活性剤未添加 ②ジギトニン添加 ③ Tween20 添加合計 3 種類の条件で凍結グリッドを作製しクライオ電子顕微鏡で実際に観察した様子 Tween20 を添加した条件が最も氷が薄く粒子がはっきりと観察できることがわかるは単粒子解析に必要な一連の解析ができるプログラムパッケージでありユーザーフレンドリーな GUI を備え露出して変性してしまうなどの問題が生じる

析を成功させるための最も重要な要素であると言える GPU 搭載コンピュータで画像解析ができるという特徴も試料に応じた最適なグリッドを作製するためにはいくこのプログラムが広く利用される理由の 1 つと言えるつかのパラメーターを制御し氷の厚みや粒子密度を調 3 凍結グリッド作製のノウハウビームラインの高度化や構造解析技術の開発プログ節する必要があるしかし残念ながら現状では狙っ

実際にわれわれがどのように条件を詰めていくかにおいて最も重要な課題である最適な結晶化条件は複を紹介するまた良質なグリッドを再現良く作製する数のパラメーターを調整しながら探索するがタンパクために現在どのような取り組みがなされているのかに質とその結晶化条件の関係性はいまだブラックボックスついていくつかの例を紹介したいと思うであり狙って目的分子の結晶を得ることは難しいク

4 橋本翼横山武司田中良和コントラストが悪い氷が厚いを行い類似した二次元画像同士を平均化した二次元コントラストが良い氷が薄い平均像を得るここで複数の粒子を平均化することにより S/N 比の高い像を取得することができ目的のもの 50 nm ではない粒子を取り除くことができる二次元分類によ 50 nm りおおまかな粒子の選別を行った後は三次元構造の再構成を行う単粒子解析により得られた粒子は実際の分子に電子線を照射することで得られたさまざまな向きからの投影像であるため個々の粒子を逆投影して三次元構造を再構成することができる得られた初期三次元構造はその後更なる粒子の振り分けや精密化を繰り返すことで高分解能なものへと精度を高めていくそして最終的に得られた三次元再構成マップに原子モデルを当てはめることで目的分子の原子構造を決定することができるここまでに紹介してきた画像解析のためのさまざまなプログラムが開発されているが現在最も広く使用され 14,15 relion ているものは relion というプログラムである ①添加剤無し全体的にホールが黒く氷が厚い ②ジギトニン添加 ③Tween20添加ホールの中央が白く凹状の氷が張られている図 5 氷の厚さによるホール粒子の見え方の違い Effect of thickness of ice on the visual performance of the hole and particles. 試料中に①界面活性剤未添加 ②ジギトニン添加 ③ Tween20 添加合計 3 種類の条件で凍結グリッドを作製しクライオ電子顕微鏡で実際に観察した様子 Tween20 を添加した条件が最も氷が薄く粒子がはっきりと観察できることがわかるは単粒子解析に必要な一連の解析ができるプログラムパッケージでありユーザーフレンドリーな GUI を備え露出して変性してしまうなどの問題が生じるまた包ているため初心者でも比較的容易に画像解析を行うこ埋されている分子が多すぎる場合は粒子の拾い出し解とができるまた relion は GPU 処理により計算を高速析が困難になり少なすぎる場合はデータ取得効率が悪化しているため大量の CPU を搭載したスーパーコンくなるこのように凍結グリッドの作製は単粒子解ピュータを必要とせず研究室レベルでも設置が可能な析を成功させるための最も重要な要素であると言える GPU 搭載コンピュータで画像解析ができるという特徴も試料に応じた最適なグリッドを作製するためにはいくこのプログラムが広く利用される理由の 1 つと言えるつかのパラメーターを制御し氷の厚みや粒子密度を調 3 凍結グリッド作製のノウハウビームラインの高度化や構造解析技術の開発プログ節する必要があるしかし残念ながら現状では狙った氷の厚みや粒子密度のグリッドを再現良く作ることは難しくいくつもの条件を検討しなければならないラムの進歩により X 線結晶構造解析では良質な結晶がここではグリッド作製に影響を及ぼすいくつかのパラ得られれば容易に立体構造を決定することができるしメーターについて説明し最適なグリッドを作製するたたがって良質な結晶を得ることが現在の X 線結晶学めに実際にわれわれがどのように条件を詰めていくかにおいて最も重要な課題である最適な結晶化条件は複を紹介するまた良質なグリッドを再現良く作製する数のパラメーターを調整しながら探索するがタンパクために現在どのような取り組みがなされているのかに質とその結晶化条件の関係性はいまだブラックボックスついていくつかの例を紹介したいと思うであり狙って目的分子の結晶を得ることは難しいク先に述べたように凍結グリッドの作製には Vitrobot ライオ電子顕微鏡単粒子解析では結晶化することなく目という装置が広く用いられている Vitrobot でグリッドを的分子の構造を決定できるため X 線結晶構造解析にお作製する際には余分な溶液を吸い取るためのろ紙を押ける結晶化のような難しいステップが存在しないと思し当てる時間ブロットタイムや強さブロットフォーわれがちだが決してそうではないクライオ電子顕微スろ紙を押し当ててから液体エタンに沈めるまでの鏡単粒子解析において結晶化条件の探索に相当するス時間装置チャンバー内部の湿度などのパラメーターをテップが凍結グリッドの作製である先に述べたようにそれぞれ調節することができる一般的にブロットタ単粒子解析を成功させるためには試料に応じた最適なイムが長くブロットフォースが強いほどグリッドの氷厚みの氷の中に目的の分子が適切な密度で包埋されては薄くなるしかしそれぞれのパラメーターが相互にいるグリッドを作製する必要がある図 5 厚すぎる氷影響しグリッドの氷の形態は変化するため一度に多のグリッドから取得した画像の場合ノイズレベルが上くのパラメーターを変化させてしまうとグリッドの昇することにより分子像の S/N 比が低くなりその後の状態を予測しにくくなってしまうそのため例えばブ解析が困難になる一方で薄すぎる氷の場合包埋さロットタイムのみを変化させたグリッドを複数作製しれる分子の配向が固定されたり一部の領域が空気中にこれらを電子顕微鏡に挿入してスクリーニングを行い 92 日本結晶学会誌第 63 巻第 2 号 2021

5 1 図 Vitrobot 図 ,19 S/N 気液界面粒子カーボン薄膜完全な粒子を保持気液界面に面した部分が変性非晶質氷図 6 Schematic representation of particles adhering to the air-liquid interface

6 S/N S/N S/N 22 Spotiton Vitrobot Spotiton Spotiton SPT Labtech chameleon 4.X 線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡単粒子解析のタイムスケールのギャップ X 2 X 2 X X 1 29 X 1 1 X X

7 X 1 X X X 10 Thermo Fisher Scientific Titan Krios , Titan Krios X 20 1 X 5. おわりに BINDS X 文献 1 M. Adrian and J. Dubochet, et al.: Nature 308, J. Frank, et al.: Science 214, E. Cao, et al.: Nature 504, M. Liao, et al.: Nature 504, W. Kuhlbrandt: Science 343, T. Nakane, et al.: Nature 587, M. Hiraizumi: PSSJ Archives 14, e L. Yan, et al.: Cell 184, S. Brenner and R. W. Horne: Biochim. Biophys. Acta 34, M. Stabrin, et al.: Nat. Commun. 11, S. Q. Zheng, et al.: Nat. Methods 14, T. Bepler, et al.: Nat. Methods 16, T. Wagner, et al.: Commun. Biol. 2, S. H. W. Scheres: J. Mol. Biol. 415, J. Zivanov, T. Nakane and S. H. W. Scheres: IUCrJ 7, D. Kampjut, J. Steiner and L. A. Sazanov: iscience 24, E. D Imprima, et al.: elife 8, B. Xiao-Chen, et al.: elife 2, D. M. Larson, K. H. Downing and R. M. Glaeser: J. Struct. Biol. 174, N. R. Wilson, et al.: ACS Nano 3, M. Bokori-Brown, et al.: Nat. Commun. 7, E. Palovcak, et al.: J. Struct. Biol. 204, A. Patel, et al.: biorxiv A. K. Geim and K. S. Novoselov: Nat. Materials 6, T. Jain, et al.: J. Struct. Biol. 179, V. P. Dandey, et al.: J. Struct. Biol. 202, A. J. Noble, et al.: Nat. Methods 15, J. Dubochet, et al.: Q. Rev. Biophys. 21, K. Hirata, et al.: Acta Crystallogr. Sect. D Struct. Biol. 75, A. Myasnikov, et al.: Microsc. Microanal 24,

プロフィール Tsubasa HASHIMOTO Tohoku University Graduate School of Life Science 980-8577 2-1-1

ac.jp Yoshikazu TANAKA Tohoku University Graduate School of Life Science 980-8577 2-1-1 2-1-1

jp PTA Takeshi YOKOYAMA Tohoku University Graduate School of Life Science 980-8577 2-1-1 2-1-1

8 プロフィール Tsubasa HASHIMOTO Tohoku University Graduate School of Life Science Katahira, Aoba-ku, Sendai, Miyagi , Japan Yoshikazu TANAKA Tohoku University Graduate School of Life Science Katahira, Aoba-ku, Sendai, Miyagi , Japan PTA Takeshi YOKOYAMA Tohoku University Graduate School of Life Science Katahira, Aoba-ku, Sendai, Miyagi , Japan RNA

KASEAA 52(1) (2014)

KASEAA 52(1) (2014) 解説 TRP チャネルがさまざまな刺激に応答できる仕組み * 1 * 2 * * 48 1 1 1 1 49 図 2 哺乳類 TRP チャネルの構造情報 A TRPA1 の電子顕微鏡単粒子解析像, 図中破線部分は構造から予測した細胞膜の界面の位置を示す B TRPV1 のアンキリンリピート C TRPM7 の α-キナーゼドメイン D TRPM7 のコイルドコイルドメイン