Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems (PN C)

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1 試薬ガイド Applied Biosystems StepOne および StepOnePlus Real-Time PCR Systems

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3 Applied Biosystems StepOne および StepOnePlus Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

4 Copyright 2007, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved. Information in this document is subject to change without notice. Applied Biosystems assumes no responsibility for any errors that may appear in this document. APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. NOTICE TO PURCHASER: Label License The StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems are covered by US patents and corresponding claims in their non-us counterparts. No right is conveyed expressly, by implication, or by estoppel under any other patent claim, such as claims to apparatus, reagents, kits, or methods such as 5 nuclease methods. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. NOTICE TO PURCHASER: PLEASE REFER TO THE USER'S GUIDE OR PRODUCT INSERT OF THE REAGENTS NAMED HEREIN FOR LIMITED LABEL LICENSE OR DISCLAIMER INFORMATION. TRADEMARKS: Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, Primer Express, and VIC are registered trademarks, and FAM, JOE, MicroAmp, MultiScribe, NED, ROX, StepOne, StepOnePlus, TAMRA, TET, and VeriFlex are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries. AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. All other trademarks are the sole property of their respective owners. 部品番号 Rev. C 06/2010

5 目次 序章 このガイドの使用方法 vii 詳細に関する参考資料 ix サポートの受け方 xii 第 1 章 はじめに StepOne および StepOnePlus システムについて 使用可能な消耗品 実験の準備 実験タイプの選択 試薬タイプの選択 アッセイタイプの選択 第 2 章 試薬の概要 概要 TaqMan 試薬 SYBR Green 試薬 適切な試薬タイプの選択 DNA 汚染の最小限化 第 3 章 定量実験 セクション 3.1: 定量実験について 概要 定量方法の選択 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR の選択 シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択 試薬タイプの選択 アッセイタイプの選択 セクション 3.2: 設計ガイドライン Inventoried/Made to Order( 在庫 / 注文生産 ) アッセイ TaqMan Gene Expression Assays iii

6 Custom TaqMan Gene Expression Assays マスターミックスの選択 実験の設計 カスタムアッセイ Primer Express Software を使ったプライマーとプローブの設計 試薬の選択 推奨サーマルサイクリング条件の使用 プライマー濃度の最適化 プローブ濃度の最適化 詳細について 第 4 章 ジェノタイピング実験 セクション 4.1: ジェノタイピング実験について 概要 アッセイタイプの選択 セクション 4.2: 設計ガイドライン 設計済み / 検証済みアッセイ TaqMan SNP Genotyping Assays TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Pre-Developed TaqMan Assay Reagents for Allelic Discrimination マスターミックスの選択 実験の設計 カスタムアッセイ Custom TaqMan SNP Genotyping Assays マスターミックスの選択 実験の設計 第 5 章 有無実験 セクション 5.1: 有無実験について 概要 アッセイタイプの選択 セクション 5.2: 設計ガイドライン Inventoried/Made to Order( 在庫 / 注文生産 ) アッセイ TaqMan Gene Expression Assays Custom TaqMan Gene Expression Assays TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents マスターミックスの選択 実験の設計 カスタムアッセイ iv

7 付録 A 計算式 標準曲線法を用いた標準偏差の計算 A-2 比較法を用いた標準偏差の計算 A-5 比較 C T ( C T ) 実験用計算式 A-7 付録 B マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限 付録 C アッセイ設計ガイドライン 付録 D 試薬部品番号 定量実験 D-2 Inventoried/Made to Order( 在庫 / 注文生産 ) アッセイ D-2 カスタムアッセイ D-2 ジェノタイピング実験 D-5 設計済み / 検証済みアッセイ D-5 カスタムアッセイ D-5 有無実験 D-7 Inventoried/Made to Order( 在庫 / 注文生産 ) アッセイ D-7 カスタムアッセイ D-8 参考文献 用語集 索引 v

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9 序章 このガイドの使用方法 システム文書について Applied Biosystems StepOne および StepOnePlus Real-Time PCR Systems(StepOne および StepOnePlus システム ) には 以下に示したガイドが付属しています 参考 : 本ガイドで使用される Applied Biosystems StepOne および StepOnePlus Real- Time PCR Systems という表記は Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System および Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System の 2 製品を示します ガイド目的と対象 PN 日本語版 PN Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems Getting Started Guide for Genotyping Experiments Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems Getting Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative C T Experiments Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems Getting Started Guide for Standard Curve Experiments Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems Installation, Networking, and Maintenance Guide Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems Installation Quick Reference Card Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems Reagent Guide StepOne および StepOnePlus システムで実験を行う方法を解説します 各 入門ガイド には次の 2 つの機能があります Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR Software(StepOne ソフトウェア ) で提供されている実験データ例を使ったチュートリアル 実際の実験のためのガイド StepOne または StepOnePlus システムを使って実験を実施する実験室スタッフや研究者を対象に書かれています StepOne および StepOnePlus システムの設置とメンテナンスの方法を解説します StepOne または StepOnePlus システムを設置 メンテナンスする実験室スタッフを対象に書かれています StepOne および StepOnePlus システムで使用する試薬に関する情報を提供し 以下のものが含まれます TaqMan および SYBR Green 試薬に関する序論 以下の実験タイプに対する設計ガイドラインの説明 定量実験 ジェノタイピング実験 有無実験 StepOne または StepOnePlus システムを使って実験を実施する実験室スタッフや研究者を対象に書かれています vii

10 序章 ガイド目的と対象 PN 日本語版 PN Applied Biosystems StepOne and StepOnePlusô Real-Time PCR Systems Site Preparation Guide StepOne および StepOnePlus システムの受け取りと設置に向けた設置場所の準備作業を解説します StepOne または StepOnePlus システムの設置前にしておくべき設置場所の準備作業をスケジュール設定 管理 実施する担当者向けに書かれています Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR Software Help StepOne ソフトウェアを用いて以下の事項を行う方法を解説します 該当せず 該当せず StepOne および StepOnePlus システムで実験のセットアップ 測定 解析 ネットワーク上の StepOne および StepOnePlus 装置の監視 StepOne および StepOnePlus 装置のキャリブレーション RNase P 測定による StepOne および StepOnePlus 装置の性能確認 対象 : StepOne または StepOnePlus システムを使って実験を実施する実験室スタッフや研究者 StepOne または StepOnePlus システムを設置 メンテナンスする実験室スタッフ 前提条件 本書は 次のことを前提に書かれています Microsoft Windows XP オペレーティングシステムに精通している インターネットとインターネットブラウザに精通している DNAまたは RNA サンプルの取扱いおよび PCR のための調製方法に関する知識がある データ保存 ファイル転送 コピーと貼り付けを理解している 既存の実験データフローへ StepOne または StepOnePlus システムを組み込む場合 ネットワーク構築の経験がある テキスト表記法 本書では 次の表記法を採用しています 太字はユーザーが行う操作を示します 次に例を示します 0 を入力してから 残りの各フィールドで Enter を押します 斜体文字は 新規または重要な用語を示すほか 強調する際にも使われます 次に例を示します 解析前に 必ず新しいマトリックスを調製してください 右矢印記号 ( ) は ドロップダウンまたはショートカットメニューからユーザーが続けて選択すべきコマンドの区切りとして使われます 次に例を示します [File]( ファイル ) [Open]( 開く ) を選びます ユーザーの注意を促す語句 Applied Biosystems ユーザー文書では ユーザーの注意を促す 2 種類の用語が使われています 各語句は 次のような注意や対応が必要なことを示します 参考 : - 必ずしも製品の使用に不可欠というわけではありませんが 製品を使用する上で役に立つ情報です 重要! - 装置の適切な操作 試薬キットの正しい使用 化学薬品の安全な使用にとって必要な情報を提供します viii

11 序章 ユーザーの注意を促す用語の例を下記に示します 参考 :[Calibrate]( キャリブレーション ) 機能は コントロールコンソールでも利用できます 重要! クライアント接続を確認するには 有効なユーザー ID が必要です 詳細に関する参考資料 関連文書 StepOne および StepOnePlus システム文書 下表に示した文書は StepOne または StepOnePlus 装置に付属していません 以下の文書は 2007 年 7 月以降入手可能となります 文書 Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems Installation Performance Verification Protocol Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems Installation Qualification-Operation Qualification Protocol Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems Planned Maintenance Protocol PN ジェノタイピング実験関連文書 文書 Allelic Discrimination Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Quick Reference Card PN Custom TaqMan Genomic Assays Protocol Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol Ordering TaqMan SNP Genotyping Assays Quick Reference Card Performing a Custom TaqMan SNP Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card Performing a TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol ix

12 序章 有無実験関連文書 文書 DNA Isolation from Fresh and Frozen Blood, Tissue Culture Cells, and Buccal Swabs Protocol NucPrep Chemistry: Isolation of Genomic DNA from Animal and Plant Tissue Protocol PN PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent Protocol 相対標準曲線および比較 C T 実験関連文書 文書 Amplification Efficiency of TaqMan Gene Expression Assays Application Note Applied Biosystems High-Capacity cdna Reverse Transcription Kits Protocol PN 127AP Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide TaqMan Gene Expression Assays Protocol User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 標準曲線実験関連文書 文書 Amplification Efficiency of TaqMan Gene Expression Assays Application Note PN 127AP05 Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide TaqMan Gene Expression Assays Protocol User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression x

13 序章 試薬ガイド関連文書 文書 Applied Biosystems High-Capacity cdna Reverse Transcription Kits Protocol PN Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol Custom TaqMan Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol Power SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 ) Protocol TaqMan Gene Expression Assays Protocol TaqMan Gene Expression Master Mix Protocol TaqMan Genotyping Master Mix Protocol TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression Using TaqMan Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note 127AP08 参考 : その他の文書については サポートの受け方 (xii ページ ) をご参照ください ソフトウェアヘルプ情報の入手 StepOne ソフトウェアヘルプは ユーザーインターフェースの各機能の使い方を説明します ソフトウェア内のヘルプにアクセスするには 下記のいずれかを行います F1 を押します ツールバーのをクリックします [Help]( ヘルプ ) [StepOne Software Help](StepOne ソフトウェアヘルプ ) を選択します ヘルプで関心トピックを見つけるには : 目次を確認します トピックを指定して検索します アルファベット順の索引を検索します xi

14 序章 コメントの送付 Applied Biosystems は ユーザー文書を改善するために お客様のコメントやご意見をお待ちしています コメントは電子メールで以下のアドレスまでお寄せください 重要! 上記の電子メールアドレスは 文書に関するコメントおよびご意見専用です 文書のご注文や PDF ファイルのダウンロード 技術上のご質問については で [Support]( サポート ) リンクをクリックしてください ( サポートの受け方 (xii ページ ) 参照 ) サポートの受け方 最新のサービスおよびサポート情報については で [Support]( サポート ) リンクをクリックしてください カスタマーサポートページでは次のサービスをご利用いただけます Q&Aの検索 テクニカルサポートへの質問提出 Applied Biosystems ユーザー文書 MSDS その他の関連文書の注文 PDF 文書のダウンロード ユーザートレーニングに関する情報入手 ソフトウェアのアップデートやパッチのダウンロード 尚 技術的な質問を行うには Applied Biosystems メンバーシップ会員として入会し ログインしていただく必要があります 重要! 本書に指示のある場合や StepOne または StepOnePlus 装置のメンテナンス ( 年次定期メンテナンスや温度確認 / キャリブレーション ) をスケジュールする際は Applied Biosystems PCR アドミにご連絡ください PCR アドミへは お電話 までお問い合わせください xii

15 はじめに 1 本章の内容 : StepOne および StepOnePlus システムについて 使用可能な消耗品 実験の準備 実験タイプの選択 試薬タイプの選択 アッセイタイプの選択

16 第 1 章 はじめに StepOne および StepOnePlus システムについて Real-Time PCR システムには 2 つのモデルがあります システム Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System(StepOne システム ) Applied Biosystems StepOnePlus Real- Time PCR System(StepOnePlus システム ) 特徴 48 ウェルプラットフォーム 3 色システム 96 ウェルプラットフォーム 4 色システム VeriFlex サンプルブロック StepOne および StepOnePlus システムでは 蛍光ベースのポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 試薬を使って 次の機能を提供します リアルタイム解析を使ったターゲット核酸配列 ( ターゲット ) の定量検出 PCR 後 ( エンドポイント ) 解析を使ったターゲットの定性検出 PCR 生成物の定性解析 (PCR 後の融解曲線解析による ) データ収集について StepOne および StepOnePlus システムは 実施する測定タイプに応じて PCR 中に様々なポイントで生の蛍光データを収集します リアルタイム測定 測定タイプ標準曲線法相対標準曲線法比較 C T ( C T ) データ収集ポイント 装置は PCR の各伸長ステップ後にデータを収集します PCR 後 ( エンドポイント ) 測定 ジェノタイピング実験 有無実験 装置は 次のポイントでデータ収集を行います PCR 前 ( 有無実験の場合には PCR 前のデータ収集はオプションですが 推奨されています ) ( オプション )PCR 中 装置は 測定中 ( リアルタイム ) にデータを収集できます 測定中のデータ収集は トラブルシューティングに役立ちます PCR 後 測定タイプに関わらず StepOne または StepOnePlus 装置によるデータ収集ポイントまたは読取は 3 相で構成されています 1. 励起 - 装置内にある反応プレートのすべてのウェルを照射し 各反応でフルオロフォアを励起します 2. 放射 - 装置の光学系は 反応プレートのウェルから放射された残留蛍光を収集します 装置で収集されたイメージは 放射波長の範囲に対応する光だけで構成されています 3. 収集 - 装置は 一定時間内に収集された残留蛍光をデジタル表示します StepOne ソフトウェアには 解析向けに生の蛍光イメージが保存されます 1-2

17 第 1 章 はじめに 測定後 StepOne ソフトウェアは キャリブレーションデータ ( 空間 Dye Background) を使って 各読取における蛍光信号の位置と強度 各蛍光信号に関与する色素 信号の重要性を特定します フィルタについて StepOne および StepOnePlus システムでは 以下のフィルタを使用します StepOne システム StepOnePlus システム フィルタ色素フィルタ色素 1 FAM 色素 1 FAM 色素 SYBR Green 色素 SYBR Green 色素 2 JOE 色素 2 JOE 色素 VIC 色素 VIC 色素 3 ROX 色素 3 TAMRA 色素 NED 色素 4 ROX 色素 VeriFlex 技術について 詳細について StepOnePlus 装置には 個別に熱制御可能な VeriFlex ブロックが 6 個あり サーマルサイクリング条件の最適化が容易です VeriFlex ブロックは それぞれ異なる温度設定をしてサンプルに応じて最高で 6 つのゾーンを作成することも すべての VeriFlex ブロックを同じ温度にすることも可能です 本書に記載されている各トピックに関する詳細について Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Software v2.0 内のヘルプにアクセスするには F1 を押すか ツールバーのをクリックするか [Help]( ヘルプ ) [StepOne Software Help] (StepOne Software ヘルプ ) を選択します 1-3

18 第 1 章 はじめに 使用可能な消耗品 StepOne システム StepOne システムでは 以下に挙げる消耗品を使用できます これらの消耗品は 標準および高速試薬 / プロトコルの両方で使用可能です 重要! 標準試薬を用いた実験でも StepOne および StepOnePlus システムでは Fast 用消耗品 ( 反応プレート チューブストリップ チューブ ) 以外は使用しないでください 消耗品 MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmp 48-Well Optical Adhesive Film MicroAmp Fast 8-Tube Strip MicroAmp Optical 8-Cap Strip 部品番号 と MicroAmp Fast Reaction Tube with Cap MicroAmp Fast 48-Well Tray MicroAmp 48-Well Base Adaptor MicroAmp 96-Well Support Base G A C D E B H C F B H C # 消耗品 A B C D E F G H MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmp Fast 48-Well Tray MicroAmp 96-Well Support Base MicroAmp Optical 8-Cap Strip MicroAmp Fast 8-Tube Strip MicroAmp Fast Reaction Tube with Cap MicroAmp 48-Well Optical Adhesive Film MicroAmp 48-Well Base Adaptor 1-4

19 第 1 章 はじめに StepOnePlus システム StepOnePlus システムでは 以下に挙げる消耗品を使用できます これらの消耗品は 標準および高速試薬 / プロトコルの両方で使用可能です 重要! 標準試薬を用いた実験でも StepOne および StepOnePlus システムでは Fast 用消耗品 ( 反応プレート チューブストリップ チューブ ) 以外は使用しないでください 消耗品 MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode MicroAmp Optical Adhesive Film MicroAmp Fast 8-Tube Strip MicroAmp Optical 8-Cap Strip 部品番号 と と MicroAmp Fast Reaction Tube with Cap MicroAmp 96-Well Tray for VeriFlex Blocks MicroAmp 96-Well Support Base MicroAmp Adhesive Film Applicator MicroAmp Cap Installing Tool( ハンドル ) A G D E B F B C C C # 消耗品 A B C D E F G MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate MicroAmp 96-Well Tray for VeriFlex Blocks MicroAmp 96-Well Support Base MicroAmp Optical 8-Cap Strip MicroAmp Fast 8-Tube Strip MicroAmp Fast Reaction Tube with Cap MicroAmp Optical Adhesive Film 1-5

20 第 1 章 はじめに 実験の準備 一般的なワークフロー StepOne および StepOnePlus システムで実験を行う前に 以下のように実験の準備を行います 1. 実験タイプの選択 (1-7 ページ ) 2. 試薬タイプの選択 (1-8 ページ ) 3. アッセイタイプの選択 (1-9 ページ ) 本書中の情報 本章には StepOne および StepOnePlus システムで使用可能な実験タイプ 試薬タイプおよびアッセイタイプに関する一般的な情報が記載されています 続く各章には 具体的な情報が記載されています 章 説明 第 2 章 試薬の概要 TaqMan 試薬と SYBR Green 試薬に関する説明と比較 DNA 汚染を最小限に抑える方法に関する情報 第 3 章 定量実験 各実験タイプの機能に関する説明 各実験タイプに関する具体的なワークフローの説明第 4 章 ジェノタイピング実験 各アッセイタイプに関する設計ガイドラインの説明第 5 章 有無実験 1-6

21 第 1 章 はじめに 実験タイプの選択 本書では 実験という用語は StepOne または StepOnePlus システムでの測定実施のプロセス全体を指し セットアップ 測定 解析を含みます StepOne および StepOnePlus システムを用いて 以下のタイプの実験を実施できます 次の方法による定量実験 : 標準曲線法 相対標準曲線法 比較 C T ( C T ) ジェノタイピング実験 有無実験 参考 : StepOne および StepOnePlus システムを用いて 融解曲線解析も実施できます 詳細については ツールバーのをクリックするか F1 を押して StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください エンドポイント実験対リアルタイム実験 3 種類の実験タイプは 以下に示すように リアルタイム実験またはエンドポイント実験として分類できます 種類特徴実験タイプ リアルタイム 装置は PCR の進捗状況をリアルタイムで監視します データは PCR プロセス全体を通して収集されます サイクリング中にターゲットの増幅が最初に検出された時点で 反応の特徴づけが行われます 定量 エンドポイント データは PCR プロセス終了後に収集されます ジェノタイピング PCR の終了時に蓄積されたターゲット量によっ有無て 反応の特徴づけが行われます データポイントは レポーター色素のノーマライズ済み信号強度 すなわち R n です 参考 : エンドポイント実験の中には PCR 前のデータポイントを含むものもあります その場合には システムが以下の式により delta R n ( R n ) 値を計算します Rn = Rn(PCR 後読み取り ) Rn(PCR 前読み取り ) Rn は ノーマライズ済みレポーター Kwok and Higuchi, Saiki et al.,

22 第 1 章 はじめに 試薬タイプの選択 StepOne および StepOnePlus システムでは 以下の試薬タイプ ( ケミストリ ) が使用可能です TaqMan 試薬 SYBR Green 試薬 その他の蛍光ベース試薬 TaqMan 試薬 TaqMan 試薬には Applied Biosystems TaqMan アッセイ ( プローブとプライマーのセットを含む調製済みミックス ) および Applied Biosystems TaqMan マスターミックスがあります TaqMan 試薬を用いて次のタイプの実験を実施できます 次の方法による定量実験 : 標準曲線法 相対標準曲線法 比較 C T ( C T ) ジェノタイピング実験 有無実験 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます SYBR Green 試薬 SYBR Green 試薬には プライマーと SYBR Green 色素を含有するマスターミックスとが含まれています SYBR Green 試薬を用いて 定量実験が実施できます 標準曲線法 相対標準曲線法 比較 C T ( C T ) 参考 : SYBR Green 試薬を用いてマルチプレックス PCR を実施することはできません 詳細については シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択 (3-10 ページ ) をご参照ください その他の試薬 StepOne および StepOnePlus システムでは 他の蛍光ベース試薬も使用できますが StepOne ソフトウェアをご使用の際には 以下の事項にご注意ください [Design Wizard]( 設定ウィザード ) ではなく [Advanced Setup]( 高度なセットアップ ) により 実験を設計する必要があります Applied Biosystems TaqMan および SYBR Green 試薬を使用すると StepOne ソフトウェアの [Reaction Setup]( 反応セットアップ ) 画面で自動的に反応量が計算されます 1-8

23 第 1 章 はじめに アッセイタイプの選択 StepOne ソフトウェアでは 定量 有無およびジェノタイピング実験で 以下のアッセイタイプを選択できます 実験タイプアッセイタイプ参照 定量 Inventoried/Made to Order ( 在庫 / 注文生産 ) 有無 カスタムジェノタイピング 設計済み / 検証済み カスタム ユーザー設計 下記 1-10 ページ 定量実験には 標準曲線法 相対標準曲線および比較 C T 法による実験が含まれます 定量および有無実験 Inventoried/Made to Order( 在庫 / 注文生産 ) アッセイ 定量または有無実験で以下の試薬を使用している場合は StepOne ソフトウェアで Inventoried/Made to Order( 在庫 / 注文生産 ) アッセイタイプを選択します TaqMan Gene Expression Assays Inventoried - 設計済み FAM 色素ラベル化 TaqMan MGB( マイナーグルーブバインダー ) プローブとプライマーの既製品セット このアッセイミックスは 1 本の調製済み 20 チューブに入っています TaqMan Gene Expression Assays Made to Order - 設計済み FAM 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブとプライマーのセットで 注文後に製造されるもの このアッセイミックスは 1 本の調製済み 20 チューブに入っています Custom TaqMan Gene Expression Assays - FAM 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブとプライマーのセットで 提示のあった配列情報に基づいて Custom TaqMan Genomic Assays サービスが設計 合成 調製したもの このアッセイミックスは 1 本の調製済み 20 または 60 チューブに入っています 参考 : StepOne ソフトウェアでアッセイタイプを選択するには [Design Wizard]( 設計ウィザード ) または [Advanced Setup]( 高度なセットアップ ) から [Reaction Setup] ( 反応セットアップ ) 画面を開き [Assay Type]( アッセイタイプ ) ドロップダウンメニューで [Inventoried/Made to Order]( 在庫 / 注文生産 ) を選択します カスタムアッセイ Primer Express Software と TaqMan または SYBR Green 試薬を用いて独自のアッセイ ( プライマーとプローブ ) を設計している場合 定量および有無実験には StepOne ソフトウェアで [Custom]( カスタム ) アッセイタイプを選択します 独自のアッセイを設計する際には 最善の結果を得るために Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従ってください 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます 参考 : StepOne ソフトウェアでアッセイタイプを選択するには [Design Wizard]( 設計ウィザード ) または [Advanced Setup]( 高度なセットアップ ) から [Reaction Setup] ( 反応セットアップ ) 画面を開き [Assay Type]( アッセイタイプ ) ドロップダウンメニューで [Custom]( カスタム ) を選択します 1-9

24 第 1 章 はじめに ジェノタイピング実験 設計済み / 検証済みアッセイ ジェノタイピング実験では 設計済み / 検証済みアッセイタイプには 次の試薬が含まれます TaqMan SNP Genotyping Assays - 設計済みFAM 色素およびVIC 色素ラベル化 TaqMan MGB( マイナーグルーブバインダー ) プローブとプライマーのセットで TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assays として販売されています TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assays は 注文後に製造します (Made to Order) このアッセイミックスは 1 本の調製済み 20 チューブに入っています TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays - 設計済み FAM 色素および VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブとプライマーの既製品セット (Inventoried) このアッセイミックスは 1 本の調製済み 20 チューブに入っています Pre-Developed TaqMan Assay Reagents for Allelic Discrimination(TaqMan PDARs for AD)- 設計済み FAM 色素および VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブとプライマーの既製品セット (Inventoried) このアッセイミックスは 1 本の調製済み 10 チューブに入っています 参考 : StepOne ソフトウェアで SNP アッセイを選択するには [Design Wizard]( 設計ウィザード ) の [SNP Assays](SNP アッセイ ) 画面または [Advanced Setup]( 高度なセットアップ ) の [Plate Setup]( プレートのセットアップ ) 画面を開きます [SNP Assays](SNP アッセイ ) 画面または [Plate Setup]( プレートのセットアップ ) 画面で ライブラリからアッセイを選択するか または新たにアッセイを作成します カスタムアッセイ ジェノタイピング実験では カスタムアッセイタイプには Custom TaqMan SNP Genotyping Assays が含まれます Custom TaqMan SNP Genotyping Assays は FAM 色素および VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブとプライマーのセットで 提示のあった配列情報に基づいて Custom TaqMan Genomic Assays サービスが設計 合成 調製したものです このアッセイミックスは 1 本の調製済み 40 または 80 チューブに入っています 参考 : StepOne ソフトウェアで SNP アッセイを選択するには [Design Wizard]( 設計ウィザード ) の [SNP Assays](SNP アッセイ ) 画面または [Advanced Setup]( 高度なセットアップ ) の [Plate Setup]( プレートのセットアップ ) 画面を開きます [SNP Assays](SNP アッセイ ) 画面または [Plate Setup]( プレートのセットアップ ) 画面で ライブラリからアッセイを選択するか または新たにアッセイを作成します ユーザー設計アッセイ SNP アッセイ用プライマーとプローブを独自に設計したい場合には Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide をご参照ください 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます 1-10

25 試薬の概要 2 本章の内容 : 概要 TaqMan 試薬 SYBR Green 試薬 適切な試薬タイプの選択 DNA 汚染の最小限化

26 第 2 章 試薬の概要 概要 Applied Biosystems では Applied Biosystems StepOne および StepOnePlus Real- Time PCR Systems で PCR 生成物を検出するために 2 種類の試薬 ( ケミストリ ) を開発しました TaqMan 試薬 ( 下記 ) SYBR Green 試薬 (2-4 ページ ) TaqMan 試薬 実験タイプ TaqMan 試薬には Applied Biosystems TaqMan アッセイ ( プローブとプライマーのセットを含む調製済みミックス ) および Applied Biosystems TaqMan マスターミックスがあります アッセイは 目的とするターゲットに特異的です マスターミックスには PCR 反応を行うために必要なその他のコンポーネントが含まれています TaqMan 試薬を用いて次のタイプの実験が実施できます 次の方法による定量実験 : 標準曲線法 相対標準曲線法 比較 C T ( C T ) ジェノタイピング実験 有無実験 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます TaqMan 試薬の開発 当初 リアルタイム PCR 生成物を測定する際には インターカレータ色素が用いられていました この検出方法の大きな弱点は 蓄積される PCR 生成物は特異的なものも非特異的なものも 両方検出してしまうことでした そこで Taq DNA ポリメラーゼの 5 ヌクレアーゼ活性を用いた蛍光ラベルプローブを導入することによって PCR 用リアルタイムシステムの改良を行いました このような蛍光プローブが利用可能となったことにより 特異的な増幅生成物のみを検出するリアルタイム検出法が開発されたのです TaqMan 試薬の仕組み TaqMan 試薬は 蛍光プローブを使って PCR 中に蓄積する特定の PCR 生成物を検出します その仕組みは 以下のとおりです ステップ 1 - オリゴヌクレオチドの 5 末端に蛍光レポーター色素を 3 末端にはクエンチャーを結合させて オリゴヌクレオチドプローブを作成します ステップ 2 - プローブがインタクトな間は クエンチャーは その近傍では 蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET Förster 共鳴 Förster, V. T. 1948) により レポーター色素から放射される蛍光を吸収します 2-2

27 第 2 章 試薬の概要 ステップ 3 - ターゲットが存在すると プローブは プライマーサイト間でアニーリングし 伸長反応中に Taq DNA ポリメラーゼの 5 ヌクレアーゼ活性により遊離します プローブの開裂により以下のことが起こります レポーター色素は クエンチャーから遊離され レポーター色素信号が増加します ターゲット鎖からプローブが遊離され 鋳型鎖の末端までプライマー伸長が起こります このように プローブを入れても PCR プロセスの抑制は 全く起こりません ステップ 4 - 各サイクルにおいて より多くのレポーター色素分子がそれぞれのプローブから遊離するため その蛍光強度は 生成するアンプリコン量に比例して増加します 核酸ターゲットの開始コピー数が大きいほど 蛍光の大幅な上昇が早く観察されます 図 2-1 に このプロセスを図示します ステップ 1: レポーター (R) とクエンチャー (Q) が TaqMan プローブの5 およ び 3 す 末端に結合していま ステップ 2: 両ラベルがプローブに結合しているとき レポーター色素の蛍光がクエンチされます ステップ 3: 各伸長ステップの際に Taq DNA ポリメラーゼは レポーター色素をプローブから遊離させます ステップ 4: クエンチャーから遊離すると レポーター色素は 特徴的な蛍光を発します 図 2-1 TaqMan 試薬の仕組み TaqMan プローブ Applied Biosystems は 次の 2 種類の TaqMan プローブを提供しています 非蛍光クエンチャー (NFQ) を含む TaqMan MGB( マイナーグルーブバインダー ) プローブ TAMRA 色素をクエンチャーとして含む TaqMan プローブ 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます 2-3

28 第 2 章 試薬の概要 Applied Biosystems では StepOne および StepOnePlus システム用に 以下の TaqMan プローブを提供しています プローブアッセイ 5 ラベル色素 3 ラベル色素 MGB? システム TaqMan MGB プローブ TaqMan MGB プローブ Custom TaqMan MGB プローブ Custom TaqMan プローブ TaqMan Gene Expression Assays TaqMan SNP Genotyping Assays Custom TaqMan Gene Expression Assays Custom TaqMan SNP Genotyping Assays FAM 色素 NFQ あり StepOne および StepOne Plus システム FAM および VIC 色素 FAM 色素 FAM および VIC 色素 カスタムアッセイ FAM TET NED または VIC 色素 カスタムアッセイ FAM TET または VIC 色素 TAMRA 色素 なし StepOnePlus システム TaqMan MGB プローブの推奨 Applied Biosystems では 通常の TaqMan プローブでヌクレオチド数が 30 を超える場合には TaqMan MGB プローブの使用をお勧めします TaqMan MGB プローブは 以下を含みます 5 末端に結合した蛍光レポーター色素 - Taq DNA ポリメラーゼの 5 ヌクレアーゼ活性により遊離して 信号を発生します 3 末端に結合した非蛍光クエンチャー (NFQ)- クエンチャーは蛍光を発生しないため リアルタイム PCR システムにおいて レポーター色素の作用を TAMRA 色素よりも正確に測定することができます 3 末端に結合したマイナーグルーブバインダー (MGB)- プローブの長さを増すことなく 融解温度 (Tm) を高くできるため (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997) 長さが短いプローブの設計が可能となります その結果 TaqMan MGB プローブによって 一致プローブと不一致プローブで Tm 値に大きな差が生じます Tm 値の差が大きいほど 正確なジェノタイピングを行うことができます SYBR Green 試薬 実験タイプ SYBR Green 試薬には プライマーと SYBR Green 色素を含有するマスターミックスとが含まれています SYBR Green 試薬を用いて 定量実験が実施できます 標準曲線法 相対標準曲線法 比較 C T ( C T ) 参考 : SYBR Green 試薬を用いてマルチプレックス PCR を実施することはできません 詳細については シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択 (3-10 ページ ) をご参照ください 2-4

29 第 2 章 試薬の概要 SYBR Green 試薬の開発 二本鎖 DNA に結合する低分子には DNA にインターカレートするものと DNA マイナーグローブに結合するものの 2 種類があります ヒグチ (Higuchi et al., 1992) は インターカレータである臭化エチジウムを用いて PCR のリアルタイム検出を行いました Hoechst は 二本鎖 DNA に結合すると蛍光が増加するマイナーグローブ結合色素の一例です (Higuchi et al., 1993) PCR 生成物をリアルタイムで検出するために用いる DNA 結合色素に関しては 結合方法にかかわらず 少なくとも 2 つの要件があります 二本鎖 DNA に結合すると蛍光が増加すること PCR を抑制しないこと Applied Biosystems では SYBR Green I Dye を用いて PCR を抑制せず かつ臭化エチジウムよりも検出感度が高くなる条件を開発しました SYBR Green 試薬の仕組み SYBR Green 試薬は SYBR Green I Dye が PCR 中に生成する二本鎖 DNA に結合することによって PCR 生成物を検出します その仕組みは 以下のとおりです ステップ 1 - SYBR Green I Dye をサンプル中に加えると すべての二本鎖 DNA と即座に結合します ステップ 2 - PCR 中 AmpliTaq Gold DNA Polymerase は ターゲットを増幅し PCR 生成物 すなわち アンプリコン を生成します 二本鎖 DNA が変性すると 一本鎖分子となり SYBR Green I Dye が解離します ステップ 3 - プライマーは一本鎖 DNA とアニーリングして AmpliTaq Gold DNA Polymerase はターゲットを増幅し 二本鎖 DNA を生成します PCR が進行するにつれて アンプリコンが更に生成されます ステップ 4 - SYBR Green I Dye は 各 PCR サイクル中に生成した新しい二本鎖 DNA の各コピーに結合します SYBR Green I Dye は全二本鎖 DNA に結合するため その結果 生成される二本鎖 PCR 生成物の量に比例して 蛍光強度が増加します 図 2-2 に このプロセスを図示します 図 2-2 SYBR Green 試薬の仕組み 2-5

30 第 2 章 試薬の概要 適切な試薬タイプの選択 TaqMan および SYBR Green 試薬は 以下に掲げる実験タイプに使用できます 実験タイプ 試薬タイプ 定量 ( 第 3 章 ) ジェノタイピング ( 第 4 章 ) 有無 ( 第 5 章 ) SYBR Green 試薬適切推奨しない推奨しない TaqMan 試薬適切適切適切 定量実験には 標準曲線法 相対標準曲線法および比較 C T 法による実験が含まれます 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます 定量実験に際する留意事項 定量実験は TaqMan 試薬 SYBR Green 試薬のどちらでも行うことができます 2 種類の試薬タイプを選択するに当たっては 以下の事項に留意してください 試薬タイプ説明特長制限 TaqMan 試薬 TaqMan 試薬は 蛍光プローブを使って PCR サイクル中に蓄積する特定の PCR 生成物を検出します 蛍光プローブの追加による高い配列特異性 マルチプレックス法に対応 広範なサーマルサイクリング条件に最適化した 調製済みアッセイを使用可能 特異的な蛍光プローブを合成する必要あり 1 ステップおよび 2 ステップ RT-PCR 両方に利用可能 SYBR Green 試薬 SYBR Green 試薬は SYBR Green I Dye( 二本鎖 DNA 結合色素 ) を使い PCR サイクル中に蓄積する PCR 生成物を検出します 経済的 ( プローブ不要 ) 融解曲線で PCR 生成物の Tm を測定可能 1 ステップおよび 2 ステップ RT-PCR 両方に利用可能 すべての二本鎖 DNA シーケンスに非特異的に結合します 偽陽性信号の発生を避けるため 融解曲線またはゲル解析を使って 非特異的生成物の形成を確認してください 2-6

31 第 2 章 試薬の概要 DNA 汚染の最小限化 PCR プロセスには DNA 増幅作用があるため TaqMan 試薬や SYBR Green 試薬を用いて実験を行う際には 特別な配慮が必要となります DNA 濃度が高いサンプルの場合には DNA テンプレートコントロールや PCR キャリーオーバーによる汚染が発生する可能性があります 更に SYBR Green I Dye は非特異的なので 二本鎖 DNA は すべて検出されます SYBR Green 試薬を使用する際には 融解曲線またはゲル解析を使って 非特異的生成物の形成を確認してください ターゲット DNA に汚染が生じない配慮が必要です エクソン - エクソン結合部に広がる遺伝子発現アッセイは gdna( ゲノム DNA) 汚染物による影響を最小限にします UNG によるキャリーオーバー生成物再増幅の最小限化 AmpErase ウラシル -N- グリコシラーゼ (UNG) は 26-kDa の遺伝子組み換え酵素であって Escherichia coli ウラシル -N- グリコシラーゼ遺伝子でエンコードされています この遺伝子は E. coli ホストに挿入され この酵素の天然型を発現します (Kwok and Higuchi, 1989) UNG は du が含まれている一本鎖および二本鎖 DNA に作用します UNG は du を含む DNA 部位で ウラシル - グリコシド結合を加水分解します この酵素によりウラシルが遊離し DNA 中にアルカリ感受性のある無塩基部位が生成されます この酵素は RNA や dt を含む DNA には作用しません (Longo et al., 1990) TaqMan アッセイ TaqMan アッセイでは AmpErase UNG 処理により 前回行った PCR 反応からのキャリーオーバー PCR 生成物の再増幅を防止できます PCR 増幅において dttp の代わりに dutp を用いると AmpErase UNG 処理によって アンプリコンを 50 µl 反応液当たり 200,000 コピーまで除去できます 参考 : AmpErase UNG( ウラシル -DNA- グリコシラーゼ UDG とも略す ) は 一部の Applied Biosystems TaqMan マスターミックスには含まれていますが 別途購入することも可能です TaqMan マスターミックスを購入する場合には 製品情報をチェックして マスターミックスに AmpErase UNG が含まれるかどうかを確認してください SYBR Green I Dye アッセイ SYBR Green I Dye アッセイでは AmpErase UNG 処理により 前回行った PCR 反応からのキャリーオーバー PCR 生成物の再増幅を防止できます Power SYBR Green PCR Master Mix や SYBR Green PCR Master Mix には AmpErase UNG が含まれませんが dutp を含むため AmpErase UNG と互換性があります PCR キャリーオーバーによる汚染が考えられる場合には AmpErase UNG を用いて問題の解決を行ってください 参考 : AmpErase UNG は 単品でお求めになることもできますが SYBR Green PCR Core Reagents Kit にも入っています 2-7

32 第 2 章 試薬の概要 PCR 実施上の一般的留意事項 以下の事項に留意して サンプル汚染や PCR 生成物のキャリーオーバーを防止してください PCR 増幅用サンプルを調製する際には 清潔な実験着と手袋 ( 増幅 PCR 生成物を取り扱った際やサンプル調製の際に着用していなかったもの ) を着用すること 汚染が疑われる場合には 手袋を必ず交換します 以下の操作用として 専用の区域および機器類を使用すること サンプル調製 PCR セットアップ PCR セットアップ区域には増幅 PCR 生成物を決して持ち込まないこと PCR 増幅 PCR 生成物の解析 サンプルチューブの開閉は 細心の注意を払って行うこと PCR サンプルの飛沫が飛び散らないように注意すること フィルター付チップを装着するポジティブディスプレイスメントピペッターやエアーディスプレイスメントピペッターを使用すること チップは 使用のたびに交換すること 反応液やコンポーネントは できるだけ蓋をすること 実験台や装置は 10% 次亜塩素酸ナトリウム溶液または 70% エタノールで定期的に拭き取ること 2-8

33 定量実験 3 本章の内容 : セクション 3.1 定量実験について セクション 3.2 設計ガイドライン

34 第 3 章 定量実験 3-2

35 第 3 章 定量実験 セクション 3.1 定量実験について 本セクションの内容 : 概要 定量方法の選択 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR の選択 シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択 試薬タイプの選択 アッセイタイプの選択

36 第 3 章 定量実験 概要 定量実験とは? 定量実験とは ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の各増幅サイクルにおいて ターゲット核酸配列 ( ターゲット ) の量を測定するリアルタイム実験です ターゲットは DNA cdna RNA です 本書では 次の 3 タイプの定量実験について説明します 標準曲線法 (3-5 ページ ) 相対標準曲線法 (3-5 ページ ) 比較 C T ( C T ) 法 (3-6 ページ ) 定量実験の仕組み リアルタイム定量実験では 一定のサイクル終了後までに蓄積した PCR 生成物の最終量ではなく サイクル中において PCR 生成物の増幅が所定の蛍光レベルに到達した時点で反応の特徴づけが行われます 増幅プロットには 実施したサイクル数にわたって検出された蛍光度の変化が図示されます PCR の初期サイクルでは 蛍光信号は ほとんど変化しません この一定範囲の PCR サイクルを ベースラインと呼びます ソフトウェアは まず ノーマライズ済み蛍光レポーター信号 ( ベースラインサイクルに対応する Rn 値 ) に数式を当てはめることによって ベースライン差分増幅プロットを作成します 次に アルゴリズムによって ベースライン修正したノーマライズ済み蛍光レポーター信号 (delta Rn[ Rn] 値 ) が指定した閾値と増幅プロットにおいてクロスする点を検出します Rn 値が閾値とクロスするサイクル数を C T と定義します ワークフロー Applied Biosystems StepOne および StepOnePlus Real-Time PCR Systems で定量実験を行う前に 以下のように実験の準備を行います 1. 定量方法を選択します (3-5 ページ ) 2. 1 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR を選択します (3-8 ページ ) 3. シングルプレックス PCR 反応またはマルチプレックス PCR 反応を選択します (3-10 ページ ) 4. 試薬タイプを選択します (3-12 ページ ) 5. アッセイタイプを選択します (3-12 ページ ) 6. 選択したアッセイタイプに関する設計ガイドラインを確認します ( セクション 3.2 (15 ページ )) 3-4

37 第 3 章 定量実験 定量方法の選択 標準曲線実験について 標準曲線法は サンプルに含まれるターゲットの絶対量を特定する際に用います 標準曲線法では StepOne ソフトウェアにより サンプルおよびスタンダード希釈シリーズ中に含まれるターゲットの増幅を測定します 標準希釈シリーズのデータを使用して標準曲線を作成します ソフトウェアは 標準曲線を用いて サンプル中ターゲットの絶対量を外挿します コンポーネント 標準曲線実験用に PCR 反応をセットアップするには 次のコンポーネントが必要です サンプル ターゲットの量が未知のサンプル スタンダード 既知量のスタンダードを含むサンプル 定量実験で使用して標準曲線を作成します スタンダード希釈シリーズ ある範囲の既知量のスタンダードからなるセット スタンダード希釈シリーズは スタンダードを連続的に希釈して調製されます 反復 同一サンプル 同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数 ネガティブコントロール サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファーを含むウェル ターゲットの増幅は ネガティブコントロールウェルでは起こりません 相対標準曲線実験について 相対標準曲線法は サンプルに含まれるターゲットの相対量を特定する際に用います 相対標準曲線法では StepOne ソフトウェアにより サンプル リファレンスサンプル 標準希釈シリーズ中に含まれるターゲットや内在性コントロールの増幅を測定します 測定結果は 内在性コントロールによりノーマライズされます 標準希釈シリーズのデータを使用して標準曲線を作成します ソフトウェアは 標準曲線を用いて サンプルおよびリファレンスサンプル中のターゲット量を外挿します ソフトウェアは 各サンプル中のターゲット量とリファレンスサンプル中のターゲット量とを比較することにより 各サンプル中ターゲットの相対量を決定します 相対標準曲線実験は 通常以下の目的で使用します 異なる組織に含まれる遺伝子の発現レベルの比較 処置サンプルと未処置サンプルにおける遺伝子の発現レベルの比較 野生型アレルと突然変異したアレルの発現レベルの比較 コンポーネント 相対標準曲線実験用に PCR 反応をセットアップする際には 次のコンポーネントが必要です サンプル ターゲット量が未知のサンプル リファレンスサンプル 相対定量の基準として用いるサンプル 例えば 遺伝子発現に及ぼす薬剤の作用を調べる場合には 未処置の対照サンプルをリファレンスサンプルとします キャリブレータ とも呼ばれます スタンダード 既知量のスタンダードを含むサンプル 定量実験で使用して標準曲線を作成します スタンダード希釈シリーズ ある範囲の既知量のスタンダードからなるセット スタンダード希釈シリーズは スタンダードを連続的に希釈して調製されます 3-5

38 第 3 章 定量実験 内在性コントロール 実験中のすべての試験サンプルで 同様のレベルで発現するターゲットまたは遺伝子 内在性コントロールを用いて 定量するターゲットの蛍光シグナルをノーマライズします ハウスキーピング遺伝子は 内在性コントロールとして使用できます 反復 同一サンプル 同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数 ネガティブコントロール サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファーを含むウェル ターゲットの増幅は ネガティブコントロールウェルでは起こりません 比較 C T 実験について 比較 C T ( C T ) 法は サンプルに含まれるターゲットの相対量を特定する際に用います 比較 C T 法では StepOne ソフトウェアにより サンプルやリファレンスサンプル中のターゲットや内在性コントロールの増幅を測定します 測定結果は 内在性コントロールによりノーマライズされます ソフトウェアは 各サンプル中のターゲット量とリファレンスサンプル中のノーマライズ済みターゲット量とを比較することにより 各サンプル中ターゲットの相対量を決定します 比較 C T 実験は 通常以下の目的で使用します 異なる組織に含まれる遺伝子の発現レベルの比較 処置サンプルと未処置サンプルにおける遺伝子の発現レベルの比較 野生型アレルと突然変異したアレルの発現レベルの比較 コンポーネント 比較 C T 実験用に PCR 反応をセットアップする際には 次のコンポーネントが必要です サンプル - ターゲット量が未知のサンプル リファレンスサンプル - 相対定量の基準として用いるサンプル 例えば 遺伝子発現に及ぼす薬剤の作用を調べる場合には 未処置の対照サンプルをリファレンスサンプルとします キャリブレータ とも呼ばれます 内在性コントロール - 実験中のすべての試験サンプルで 同様のレベルで発現するターゲットまたは遺伝子 内在性コントロールを用いて 定量するターゲットの蛍光シグナルをノーマライズします ハウスキーピング遺伝子は 内在性コントロールとして使用できます 反復 - 同一サンプル 同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数 ネガティブコントロール - サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファーを含むウェル ターゲットの増幅は ネガティブコントロールウェルでは起こりません 3-6

39 第 3 章 定量実験 定量方法の比較 以下の記載に基づいて 標準曲線実験 相対標準曲線実験 比較 C T 実験の選択を行ってください 実験タイプ説明特長制限 標準曲線法 標準曲線を用いて サンプル中のターゲットの絶対量を決定します ウイルス量の定量が代表的な使用例です 既知のスタンダード量に対して比較を行います 標準曲線実験では 各ターゲットについて標準曲線の作成が必要となるため 反応プレートに必要となる試薬とスペースが増えます 相対標準曲線法 標準曲線を用いて リファレンスサンプル中の核酸配列に対して 試験サンプル中のターゲットの発現がどのように変化したかを決定します PCR 増幅効率が低いアッセイに最適です ターゲットと内在性コントロールとで PCR 増幅効率が等しい必要がないため 検証が容易です 相対標準曲線実験では 各ターゲットについて標準曲線の作成が必要となるため 反応プレートに必要となる試薬とスペースが増えます 比較 C T ( C T ) 数式を用いて リファレンスサンプル中の核酸配列に対して 試験サンプル中のターゲットの発現がどのように変化したかを決定します 実験サンプル数が多く 遺伝子数も多い場合に 相対発現頻度を測定するハイスループット測定に最適です ターゲットと内在性コントロールのPCR 増幅効率がほぼ等しい場合には 実験サンプル中のターゲットの相対量を 標準曲線を用いないで決定できます 試薬量を節約できます 反応プレートに空きが増えます PCR 増幅効率が低い場合には 結果が不正確になることがあります 弊社では 比較 C T 法を実施する前に ターゲットアッセイと内在性コントロールアッセイとでPCR 増幅効率がほぼ等しいことを確認されるようお勧めします 詳細について定量法の詳細については User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression をご参照ください 3-7

40 第 3 章 定量実験 1 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR の選択 逆転写 - ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) は RNA の定量に用います PT-PCR は 1 ステップおよび 2 ステップで実施できます 1 ステップ RT-PCR について 1 ステップ RT-PCR では 逆転写と PCR とを同一のバッファー系で行います ( 図 3-1) この反応では RT ステップと PCR ステップとの間に試薬を追加する必要がありません 1 ステップ RT-PCR では RT と PCR 増幅のための調製を 1 本のチューブで行えるため便利です ただし 1 ステップ RT-PCR では キャリーオーバー防止用酵素である AmpErase ウラシル -N- グリコシラーゼ (UNG) を使用できません 1 ステップ RT- PCR で UNG が存在すると cdna は 生成する一方で分解されてしまいます UNG の詳細については UNG によるキャリーオーバー生成物再増幅の最小限化 (2-7 ページ ) をご参照ください 単一チューブ 図 ステップ RT-PCR の概略図 2 ステップ RT-PCR について 2 ステップ RT-PCR では RT と PCR とを別個の反応に分けて実施します ( 図 3-2) 2 ステップ RT-PCR は 1 つの cdna 反応液から複数のトランスクリプトを検出したり 後日使用するために cdna の一部を貯蔵しておくのに便利です dutp を塩基として用いて PCR を行う場合には AmpErase UNG 酵素を用いて キャリーオーバー汚染を防止できます UNG の詳細については UNG によるキャリーオーバー生成物再増幅の最小限化 (2-7 ページ ) をご参照ください 3-8

41 第 3 章 定量実験 チューブ 1 オリゴ d(t) またはランダムヘキサマー チューブ 2 PCR ステップ 図 ステップ RT-PCR の概略図 cdna 合成に用いるプライマー 1 ステップ RT-PCR では 配列特異的リバースプライマーを cdna 合成に利用できます 2 ステップ RT-PCR では 以下のプライマーを cdna 合成に利用できます オリゴ d(t) 16 ランダムプライマー 配列特異的リバースプライマー 最適な逆転写用プライマーは これらの 3 種類のプライミングシステムを実験により評価して選ぶことができます ヘアピンループが存在しない短い RNA 配列の場合には これらの 3 種類のプライミングシステムは すべて等しい効果を示します 長い RNA トランスクリプトやヘアピンループを含む配列の場合には 以下のガイドラインに従ってください プライマー 選択ガイドライン オリゴ d(t) 16 真核生物の mrna や poly-a テールを有するレトロウイルスの逆転写のみに用いる 長い mrna トラスクリプトや poly-a 部位から上流 2 キロベースを超えるアンプリコンは避ける ランダムプライマー 先ず 長い逆転写物やヘアピンループを含む逆転写物で試してみる 全 RNA(rRNA mrna trna) の転写に用いる 配列特異的リバースプライマー RNA を含む相補的配列の逆転写のみに用いる 1 ステップ RT-PCR で用いる RT-PCR 法の比較 方法 cdna 合成に用いるプライマーコメント 1 ステップ RT-PCR 2 ステップ RT-PCR 配列特異的リバースプライマーランダムヘキサマーオリゴ d(t) 16 配列特異的リバースプライマー 単一の反応ミックスでよい AmpErase UNG は使用不可 cdna を貯蔵して 後で利用可能 AmpErase UNG を使用可能 2 つの反応ミックスが必要 3-9

42 第 3 章 定量実験 シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択 PCR 反応は 次のいずれかで実施できます シングルプレックス PCR シングルプレックス PCR では 反応チューブまたはウェルにはプライマーセットが 1 つだけ存在します 反応ごとにターゲットまたは内在性コントロールを 1 つだけ増幅できます または マルチプレックス PCR マルチプレックス PCR では 反応チューブまたはウェルにプライマーセットが複数存在します 各セットが 特定のターゲットまたは内在性コントロールを増幅します 通常は FAM 色素でラベルしたプローブは ターゲットを検出し VIC 色素でラベルしたプローブは 内在性コントロールを検出します 重要! SYBR Green 試薬は マルチプレックス PCR には使用できません 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます 図 3-3 シングルプレックス PCR 対マルチプレックス PCR マルチプレックス PCR について マルチプレックス PCR を実施する際には 次の点にご注意ください すべての条件下において 選択した内在性コントロールが定量しようとしている全てのターゲットと比較して量が多い (C T 値が低い ) ことを確認します 内在性コントロールアッセイをプライマー制限アッセイとして測定します 各反応中の内在性コントロールアッセイ ( 量が多いテンプレート ) については プライマー量を制限して 競合的 PCR によって量が少ないテンプレートの C T に影響が出ないようにしなければなりません マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限 正確なマルチプレックスアッセイを行うためには ある種類の増幅が他の種類の増幅を大きく超えないことが重要になります そうでないと 量の多い種類の増幅によって 量の少ない種類の増幅がうまく起こらなくなります 量の少ない種類がうまく増幅しない場合 実験結果が不正確になったり 最悪の場合には量の少ない種類がまったく検出されないことも起こります このような状況を防ぐには 量の多い種類を増幅するプライマー濃度を制限して C T に到達後に増幅を停止することが必要となります しかし プライマー制限アッセイは ノーマライズを行っているプライマー非制限アッセイとくらべて 反応条件が不安定になる恐れがあります 詳細については 付録 B マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限 をご参照ください 3-10

43 第 3 章 定量実験 シングルプレックス対マルチプレックス PCR 定量するターゲット数が増加するにつれて マルチプレックス PCR におけるプライマー制限の複雑さが増します 複数のターゲットを解析する際 次のような理由からシングルプレックス PCR を用いる方が効果的な場合もあります マルチプレックス PCR では 次の条件を満たす適切な内在性コントロールを見つけるのが困難です 定量しようとしているどのターゲットよりも量が多い 実験条件やサンプルの違いによって 発現レベルが変化しない 最初にマルチプレックスおよびシングルプレックスフォーマットでターゲットアッセイと内在性コントロールアッセイをすべて測定した後 両フォーマットによる C T 値の比較を行って マルチプレックスが C T 値に影響を及ぼしていないかを調べます シングルプレックス PCR では 実験条件やサンプルの違いによって発現レベルが変化しないターゲットを 内在性コントロールとして用いることができます それゆえ シングルプレックスフォーマットでターゲット数が多いほど 残りのターゲットを比ノーマライズするための適切な内在性コントロールが 1 つ以上見つかる確率が高くなります マルチプレックス PCR とシングルプレックス PCR の選択に当たっては 以下の事項に留意してください PCR 説明特長制限 シングルプレックス 反応チューブまたはウェル内で 一種類のターゲットまたは内在性コントロールの増幅が起こる反応 TaqMan アッセイに最適化は不要 実験条件やサンプルの違いによって発現レベルが変化しないターゲットを内在性コントロールとして利用可能 ターゲットと内在性コントロールとの両方にサンプルが必要 TaqMan 試薬と SYBR Green 試薬のどちらも選択できる柔軟性 マルチプレックス 反応チューブまたはウェル内で 複数のターゲットまたは内在性コントロールの増幅が起こる反応 稼働コストおよび 2 本のチューブにサンプルを分ける際の正確な分注操作に対する依存度を低減 内在性コントロールアッセイをプライマー制限アッセイとして測定する必要あり 最適化と検証の必要あり 複数のターゲットを解析する場合には シングルプレックス PCR よりも効率が悪い SYBR Green 試薬の使用は不可 3-11

44 第 3 章 定量実験 試薬タイプの選択 TaqMan 試薬対 SYBR Green 試薬 StepOne および StepOnePlus システムでは 以下の試薬を用いて定量実験を実施できます TaqMan 試薬 SYBR Green 試薬 TaqMan 試薬と SYBR Green 試薬の選択については 定量実験に際する留意事項 (2-6 ページ ) をご参照ください アッセイタイプの選択 StepOne ソフトウェアで実験を設計する場合には 定量実験として 以下のアッセイタイプを選択できます Inventoried/Made to Order( 在庫 / 注文生産 )(3-13 ページ ) カスタム (3-14 ページ ) 本セクションでは 各アッセイタイプに利用可能な製品をリストします 参考 : アッセイは 目的とするターゲットに特異的です マスターミックスには PCR 反応を行うために必要なその他のコンポーネントが含まれています 3-12

45 第 3 章 定量実験 Inventoried/Made to Order ( 在庫 / 注文生産 ) アッセイ 製品 TaqMan Gene Expression Assays TaqMan Endogenous Control Assays 参考 :FAM 色素ラベル化 TaqMan Endogenous Control Assays は Inventoried TaqMan Gene Expression Assays として含まれています Custom TaqMan Gene Expression Assays TaqMan Gene Expression Master Mix TaqMan 2 Universal PCR Master Mix (with または without AmpErase UNG) TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 ), No AmpErase UNG 属性 ヒト マウス ラット Arabidopsis Drosophila C. elegans C. familiares( イヌ ) および M. mulatta( アカゲザル ) 遺伝子用の調製済み遺伝子特異的プライマーとプローブのセット プローブは FAM 色素ラベル MGB プローブ 便利な単一の 20 チューブで提供 Inventoried( 在庫 ) または Made to Order( 注文生産 ) アッセイとして入手可能 最適化 調製済み そのまま使用可能な内在性コントロールアッセイ ヒト マウス ラット Arabidopsis Drosophila およびあらゆる真核生物種用のコスト効果が高い遺伝子発現定量 FAM 色素と VIC 色素ラベルの選択が可能 ( プライマー制限 ) あらゆる種または生物 自由にターゲットを選択 プローブは FAM 色素ラベル MGB プローブ 便利な単一の 20 チューブで提供 リアルタイム PCR により 通常の実験や特殊な実験で正確な定量を行う場合に使用 ターゲットの 1 コピーまで検出する優れた検出精度 1 回の反応中に含まれる 2 つのターゲットを一緒に増幅するマルチプレックス PCR 同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の区別が可能な高い特異性 TaqMan Gene Expression Assays により検証済み 全アッセイに同一試薬を用いることで アッセイの実施を簡素化 cdnaまたはdna をテンプレートに用いるTaqMan アッセイで最適性能を発揮 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む 全アッセイに同一試薬を用いることで アッセイの実施プロセスを簡素化 上記の TaqMan 2 Universal PCR Master Mix と同じ属性 StepOne および StepOnePlus システムで約 35 分で定量実験が終了 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます Inventoried/Made to Order( 在庫 / 注文生産 ) アッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては (3-16 ページ ) をご参照ください 3-13

46 第 3 章 定量実験 カスタムアッセイ 製品 カスタム TaqMan プローブとプライマー Primer Express Software TaqMan Gene Expression Master Mix TaqMan 2 Universal PCR Master Mix (with または without AmpErase UNG) TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 ), No AmpErase UNG Power SYBR Green PCR Master Mix SYBR Green PCR Master Mix 属性 あらゆる種または生物 色素ラベル クエンチャーおよび合成スケールを自由に選択 Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従い Primer Express Software で使用 リアルタイム PCR 用のプライマーとプローブを設計するソフトウェア リアルタイム PCR により 通常の実験や特殊な実験で正確な定量を行う場合に使用 ターゲットの 1 コピーまで検出する優れた検出精度 1 回の反応中に含まれる 2 つのターゲットを一緒に増幅するマルチプレックス PCR 同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の区別が可能な高い特異性 Custom TaqMan Gene Expression Assays により検証済み 全アッセイに同一試薬を用いることで アッセイの実施を簡素化 cdnaまたはdna をテンプレートに用いるTaqMan アッセイで最適性能を発揮 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む 全アッセイに同一試薬を用いることで アッセイの実施プロセスを簡素化 上記の TaqMan 2 Universal PCR Master Mix と同じ属性 StepOne および StepOnePlus システムで約 35 分で定量実験が終了 高感度定量法により 低コピー数の検出が可能 (2 コピーのターゲット遺伝子も検出 ) 二本鎖 DNA を検出 特異的プローブは不要 高精製 AmpliTaq Gold DNA Polymerase LD を含有し 非特異的生成物 ( プライマーダイマーを含む ) の形成を最小限化 Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従い Primer Express Software で使用 二本鎖 DNA を検出 特異的プローブは不要 高感度な検出が不要の場合には標準的に使用 AmpliTaq Gold DNA Polymerase を含有し 非特異的生成物 ( プライマーダイマーを含む ) の形成を最小限化 Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従い Primer Express Software で使用 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます カスタムアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては (3-21 ページ ) をご参照ください 3-14

47 第 3 章 定量実験 セクション 3.2 設計ガイドライン 本セクションの内容 : Inventoried/Made to Order( 在庫 / 注文生産 ) アッセイ TaqMan Gene Expression Assays Custom TaqMan Gene Expression Assays マスターミックスの選択 実験の設計 カスタムアッセイ Primer Express Software を使ったプライマーとプローブの設計 試薬の選択 推奨サーマルサイクリング条件の使用 プライマー濃度の最適化 プローブ濃度の最適化 詳細について

48 第 3 章 定量実験 Inventoried/Made to Order( 在庫 / 注文生産 ) アッセイ ワークフロー StepOne ソフトウェアで Inventoried/Made to Order アッセイタイプを選択する場合 Applied Biosystems は 以下のワークフローをお勧めします 1. アッセイを選択します TaqMan Gene Expression Assays( 下記 ) Custom TaqMan Gene Expression Assays(3-18 ページ ) 2. マスターミックスを選択します (3-19 ページ ) 3. StepOne ソフトウェアを用いて実験を設計します (3-20 ページ ) TaqMan Gene Expression Assays 製品の説明 TaqMan Gene Expression Assays は ヒト マウス ラット Arabidopsis Drosophila C. elegans C. familiares( イヌ ) および M. mulatta( アカゲザル ) 遺伝子の定量実験を行うために開発された Inventoried/Made to Order のプローブとプライマーのセットを包括的に含むアッセイです このアッセイには 次の特徴があります TaqMan 試薬を用いて cdna サンプル中のターゲットを増幅し 検出します 自動化デザインと品質管理されたパイプラインにより設計されています Inventoried アッセイは 製造後在庫管理されており Made to Order アッセイは 設計済みで注文があった後に製造されます Applied Biosystems TaqMan マスターミックスを用いて 広範なサーマルサイクリング条件により 最適な性能を発揮するように設計されています 可能な場合には エクソン-エクソン結合部とクロスするプローブを設計することにより ゲノム DNA を増幅することなくターゲット cdna の増幅が行えます ( アッセイ ID に m サフィックスが表示される ) 製品の必要条件 TaqMan Gene Expression Assays に必要なものは 以下のとおりです 次の 3 コンポーネント : ウェル当たりの cdna サンプル (RNA から変換 ) 量は 1 ~ 100 ng で 各測定ウェル中の cdna 量は同じ 20 Gene Expression Assay Mix( 各ターゲットに特異的 ) 各アッセイミックスは 調製済み 20 ミックス中に 2 つの非ラベル PCR プライマーと FAM 色素ラベル TaqMan MGB( マイナーグルーブバインダー ) プローブを含みます 1 の最終濃度は プローブが 250 nm 各プライマーは 900 nm です TaqMan Gene Expression Master Mix TaqMan Universal PCR Master Mix (with または without AmpErase UNG) または TaqMan Fast Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG 各 PCR サイクル中に必要となる PCR 増幅ステップは 1 回のみです 同時にリアルタイム読み取りを行うことにより結果を出します 3-16

49 第 3 章 定量実験 利用可能なアッセイ TaqMan Gene Expression Assays は ヒト マウス ラット Arabidopsis Drosophila C. elegans C. familiares( イヌ ) および M. mulatta( アカゲザル ) 遺伝子用に利用できます 部品番号は Inventoried アッセイは PN Made to Order アッセイは PN アッセイ名のプレフィックスは アッセイ対象種を表しています Hs は Homo sapiens ( ヒト ) Mm は Mus musculus( マウス ) Rn は Rattus norvegicus( ラット ) At は Arabidopsis thaliana Dm は Drosophila melanogaster Ce は C. elegans Cf は C. familiares( イヌ ) Rh は M. mulatta( アカゲザル ) です アッセイ名のサフィックスは 以下の表に示すようなアッセイの特徴を示します サフィックス _m _s _g _mh _sh _gh _u 説明 このアッセイのプローブはエクソン結合部に広がるため ゲノム DNA を検出しません このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用するよう設計されており ゲノム DNA を検出します このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用する可能性があり ゲノム DNA を検出する可能性があります このアッセイは 配列相同性が高い遺伝子ファミリーに属するトランスクリプト用に設計されています このアッセイでは ターゲット遺伝子と最も類似した配列相同性を有する遺伝子との間で 10 C T から 15 C T の差が出ます そのため サンプル中にターゲットトランスクリプトと最も相同性が高いトランスクリプトに同数のコピーがあった場合 最も相同性が高いトランスクリプトの 1000 から 30,000 倍の感度でターゲットトランスクリプトを検出できます このアッセイのアンプリコンはエクソン結合部に広がり プロ - ブはそのうちの一つのエクソン内に完全に配置されます TaqMan Endogenous Control Assays TaqMan Endogenous Control Assays は 以下により入手可能です Inventoried TaqMan Gene Expression Assays(PN )- 各アッセイは 1 本の調製済み 20 チューブ中に FAM 色素ラベル TaqMan MGB プローブを含みます ヒト マウスおよびラット種用個別コントロールアッセイ ( 部品番号は多岐 )- 各アッセイは FAM 色素ラベル TaqMan MGB プローブ VIC 色素ラベル TaqMan MGB プローブまたは TAMRA 色素ラベルプローブを含みます VIC 色素ラベルを含む TaqMan Endogenous Controls では プライマーが制限されます 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます 3-17

50 第 3 章 定量実験 詳細について 最新の製品および各製品の使用方法については Applied Biosystems ウェブサイトをご覧ください a. ホームページの [TaqMan Products](TaqMan 製品 ) から TaqMan Gene Expression Assays を選択します b.[gene Expression Assays & Arrays] のページで [Individual Assays]( 個別のアッセイ ) にて TaqMan Gene Expression Assays を選択します このオプションを選択すると FAM 色素ラベル化プローブを含む TaqMan Endogenous Control Assays を初めとする 全 TaqMan Gene Expression Assays へリンクされます または [Individual Control Assays]( 個別のコントロールアッセイ ) にて TaqMan Endogenous Control Assays を選択します このオプションを選択すると 個別の TaqMan Endogenous Control Assays(FAM 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブ VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブ または TAMRA 色素ラベル化プローブを含む ) へリンクされます Custom TaqMan Endogenous Control Assays についての情報は Using TaqMan Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note をご参照ください TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法については TaqMan Gene Expression Assays Protocol をご参照ください Custom TaqMan Gene Expression Assays 製品の説明 Custom TaqMan Gene Expression Assays は TaqMan プローブとプライマーのセットで お客様から提示のあった配列情報に基づいて Custom TaqMan Genomic Assays サービスが設計 合成 調製したものです Custom TaqMan Gene Expression Assays を使うと どのような生物の遺伝子やスプライシング変異でも定量実験を実施できます このアッセイには 次の特徴があります TaqMan 試薬を用いて cdna サンプル中のターゲットを増幅し 検出します 独自のアッセイ設計ソフトウェアを用いて開発されています Applied Biosystems TaqMan マスターミックスを用いて 広範なサーマルサイクリング条件により 最適な性能を発揮するように設計されています 製品の必要条件 Custom TaqMan Gene Expression Assays には 以下が必要です ターゲット配列に関する提出用ファイル 無償の File Builder ソフトウェアを使用して提出用ファイルを作成し Custom TaqMan Genomic Assays サービスに当該ファイルを提示してください 次の 3 コンポーネント : ウェル当たりの cdna サンプル (RNA から変換 ) 量は 1 ~ 100 ng で 各測定ウェル中の cdna 量は同じ 3-18

51 第 3 章 定量実験 20 Gene Expression Assay または 60 Gene Expression Assay( 各ターゲットに特異的 ) 各アッセイは 調製済み 20 または 60 ミックス中に 2 種類のターゲット特異的プライマーと FAM 色素ラベル TaqMan MGB プローブを含みます 1 の最終濃度は プローブが 250 nm 各プライマーは 900 nm です TaqMan Gene Expression Master Mix TaqMan Universal PCR Master Mix (with または without AmpErase UNG) または TaqMan Fast Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG 各 PCR サイクル中に必要となる PCR 増幅ステップは 1 回のみです 同時にリアルタイム読み取りを行うことにより結果を出します 詳細について 最新の製品および各製品の使用方法については Applied Biosystems ウェブサイトをご覧ください : a. ホームページの [TaqMan Products](TaqMan 製品 ) から TaqMan Gene Expression Assays を選択します b.[gene Expression Assays & Arrays] ページの [Individual Assays]( 個別のアッセイ ) で [TaqMan Gene Expression Assays] を選択します Custom TaqMan Gene Expression Assays の注文方法については Custom TaqMan Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines をご参照ください Custom TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法については Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol をご参照ください マスターミックスの選択 利用可能なマスターミックス Applied Biosystems の定量実験用 Inventoried/Made to Order アッセイは 以下の TaqMan マスターミックスを用いるように設計されています マスターミックス 部品番号 TaqMan Gene Expression Master Mix 1-Pack(1 5 ml) 200 反応 TaqMan Gene Expression Master Mix 10-Pack(10 5 ml) 2000 反応 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 ) No AmpErase UNG 250 反応 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix 200 反応 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix 2000 反応 Pack TaqMan 2 Universal PCR Master Mix TaqMan 2 Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG 200 反応 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG 2000 反応 10-Pack TaqMan 2 Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG

52 第 3 章 定量実験 詳細について TaqMan 試薬の使用に関しては 以下をご参照ください TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 ) Protocol TaqMan Gene Expression Master Mix Protocol TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol 実験の設計 StepOne ソフトウェアの使用 Applied Biosystems の Inventoried/Made to Order アッセイでは StepOne ソフトウェアを用いて定量実験の設計を行います StepOne ソフトウェアは 自動的に以下の量を計算します 反応ミックスコンポーネント サンプル希釈液 ( 標準曲線および相対標準曲線実験の場合のみ ) スタンダード希釈シリーズ 参考 : StepOne ソフトウェアで Inventoried/Made to Order アッセイタイプを選択するには [Design Wizard]( 設計ウィザード ) または [Advanced Setup]( 高度なセットアップ ) で [Reaction Setup]( 反応セットアップ ) 画面を開き [Assay Type]( アッセイタイプ ) ドロップダウンメニューから [Inventoried/Made to Order]( 在庫 / 注文生産 ) を選択します 詳細について StepOne および StepOnePlus システムによる定量実験の設計および実施については 以下をご参照ください Applied Biosystems StepOne および StepOnePlus Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド Applied Biosystems StepOne および StepOnePlus Real-Time PCR Systems 相対標準曲線と比較 C T 実験入門ガイド 3-20

53 第 3 章 定量実験 カスタムアッセイ ワークフロー StepOne ソフトウェアで定量実験にカスタムアッセイを選択する場合には ( すなわち 独自にプライマーとプローブを設計する場合には ) Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインのワークフローに従うことをお勧めします 1. Primer Express Software を使って プライマーとプローブを設計します ( 下記 ) 2. 適切な試薬を選択します (3-24 ページ ) 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます 3. 推奨されたサーマルサイクリング条件を用います (3-27 ページ ) 4. デフォルト設定のプライマーおよびプローブ濃度で開始します 必要に応じて プライマー濃度 (3-30 ページ ) およびプローブ濃度 (3-33 ページ ) を最適化します 重要! これらの手順に完全に従うと 本システムで迅速にアッセイを設計 最適化でき 信頼性の高い結果が得られます 実験が高いレベルで成功するために 本システムを包括的にご利用ください Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインの詳細については 付録 C をご覧ください 参考 : StepOne ソフトウェアで [Custom]( カスタム ) アッセイタイプを選択するには [Design Wizard]( 設計ウィザード ) または [Advanced Setup]( 高度なセットアップ ) から [Reaction Setup]( 反応セットアップ ) 画面を開き [Assay Type]( アッセイタイプ ) ドロップダウンメニューで [Custom]( カスタム ) を選択します Primer Express Software を使ったプライマーとプローブの設計 Primer Express Software は お客様が提示した DNA 配列に基づき 推奨パラメータを用いてプライマーとプローブを選択します ご自分でアッセイの設計を行う場合には (3-23 ページ ) にある定量実験用プライマーおよびプローブの設計ガイドラインの要約に従ってください これらのガイドラインの詳細な解説については プライマーおよびプローブ設計ガイドラインについて (3-22 ページ ) をご覧ください 重要! Applied Biosystems は TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne システムで使うことはお勧めしません TAMRA 色素は StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます 参考 : SYBR Green I Dye による検出を行う場合にはプローブは必要ありませんが SYBR Green 試薬用アッセイを設計する際に Primer Express Software によってプライマーとプローブのセットを選択することをお勧めします プローブは使用しませんが プライマーは必要とされる要件をすべて満たします 高い特異性を得るためにアッセイを TaqMan 試薬に変更する必要が生じた場合 作成した Primer Express Software ドキュメントを開いて すぐにプローブを見つけることができます 3-21

54 第 3 章 定量実験 定量アッセイ用アンプリコン部位の選択 アンプリコン部位を適切に選択することで ゲノム配列 偽遺伝子やその他の関連遺伝子の共増幅を起こすことなく ターゲット mrna / cdna の増幅を行えます SYBR Green 試薬は 遺伝子発現用アンプリコン部位をスクリーニングするのに有用です ガイドライン アンプリコンは ゲノム DNA 中のターゲット遺伝子の増幅を防止するために 1 つ以上のイントロンに及ぶスパンが必要です プライマーペアは 偽遺伝子やその他の関連遺伝子の増幅を防止するために ターゲット遺伝子に特異的であることが必要です プライマーを設計する際には Primer Express Software ガイドラインを用います 適当な配列が見つからない場合には 配列を検討してアンプリコンの再設計を行うか あるいは他の部位のスクリーニングを行う必要があります 試験中の遺伝子にイントロンが含まれない場合には ゲノム配列を増幅することなく mrna 配列を増幅するアンプリコンの設計はできません その場合には 逆転写を行っていない RNA サンプルをコントロールとして測定してください (RT マイナスコントロール ) プライマーおよびプローブ設計ガイドラインについて 短いアンプリコンの選択 Primer Express Software パラメータのデフォルト設定で重要な点は レンジが 50 から 150 塩基対のアンプリコンが選択されていることです 短いアンプリコンには 効率の高い増幅ができるという利点があります また 効率の高いアッセイにより 比較 C T ( C T ) 法を用いた相対定量を行うことができます (Livak and Schmittgen, 2001) この方法では 標準曲線の必要がないため サンプルスループットが高くなります G/C 含量 できる限り G/C 含量が 30 から 80% の領域で プライマーとプローブを選択してください G/C 含量が >80% の領域は サーマルサイクリング中に十分な変性が起こらず 反応効率の低下につながります G/C 含量が高い配列は 非特異的相互作用の影響により 反応効率が低下し SYBR Green 試薬を用いたアッセイで非特異的信号が発生する可能性があります G 塩基が 4 個以上連続しているプライマーやプローブは避けてください 融解温度 推奨融解温度 (Tm) を有するプライマーやプローブを選択した場合には 広範囲なサーマルサイクリング条件を使用できます Applied Biosystems は プローブ Tm がプライマー Tm より 10 C 高いことをお勧めします プローブの 5 末端 Primer Express Software では 5 末端に G があるプローブは選択されません この位置にある G 塩基のクエンチ作用は プローブ開裂後も残ります G 塩基の存在により 蛍光値 ( Rn) が低下し アッセイ性能に影響が出ます 5 末端近傍 ( 末端以外 ) の位置にある G 塩基では アッセイ性能の低下は認められていません 3-22

55 第 3 章 定量実験 プライマーの 3 末端 非特異的生成物が形成される可能性を抑えるため プライマーの 3 末端側の最後の 5 塩基には C や G 塩基が 3 個以上含まれないようにしてください G/C 含有率が高いテンプレートの場合など一定の条件下では アンプリコンの長さが 150 塩基対以下という推奨条件を緩和する必要がある場合もあります 一般論として 3 末端に G や C 塩基を極端に多く含むプライマーは避けてください プライマーおよび MGB プローブ設計ガイドラインの要約 プローブガイドライン プライマーガイドライン プローブを最初に選び 次にプローブに重ならない範囲でできるだけプローブに近いプライマーを設計します (50 から 150 塩基対のアンプリコンを強くお勧めします ) G/C 含量を 30 から 80% の範囲とします 同一のヌクレオチド 特にグアニンが連続しないようにし G が 4 個以上連続するのは避けてください Primer Express Software を使用する場合には Tm を 68 から 70 C とします G が 5 末端に来てはいけません ヌクレオチドが 13 個より短くならない範囲で TaqMan MGB プローブをできるだけ短くします Primer Express Software を使用する場合には Tm を 58 から 60 C とします 3 末端側の 5 個のヌクレオチドには G や C 塩基が 3 個以上含まれてはいけません 3-23

56 第 3 章 定量実験 試薬の選択 定量実験用に 数種類の TaqMan および SYBR Green 試薬が利用可能です 使用する試薬は ターゲットに応じて変わります DNA または cdna 定量 ( 下記 ) 1 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量 (3-25 ページ ) 2 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量 (3-26 ページ ) 参考 : SYBR Green 試薬を用いる場合には Applied Biosystems は Power SYBR Green 色素の使用を強くお勧めします DNA または cdna の定量 試薬キット部品番号 TaqMan 試薬 TaqMan Gene Expression Master Mix 1-Pack(1 5 ml) 200 反応 TaqMan Gene Expression Master Mix 10-Pack(10 5 ml) 2000 反応 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 ) No AmpErase UNG 250 反応 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix 200 反応 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix 2000 反応 Pack TaqMan 2 Universal PCR Master Mix TaqMan 2 Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG 200 反応 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG 2000 反応 10-Pack TaqMan 2 Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG TaqMan PCR Core Reagents Kit 200 反応 N

57 第 3 章 定量実験 試薬キット部品番号 SYBR Green 試薬 Power SYBR Green PCR Master Mix(1 ml) 40 反応 Power SYBR Green PCR Master Mix(5-mL) 200 反応 Power SYBR Green PCR Master Mix (10 5-mL) 2000 反応 Power SYBR Green PCR Master Mix(50 ml) 2000 反応 SYBR Green PCR Master Mix(1-mL) 40 反応 SYBR Green PCR Master Mix(5-mL) 200 反応 SYBR Green PCR Master Mix(50-mL) 2000 反応 SYBR Green PCR Core Reagents 200 反応 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量 TaqMan 試薬 試薬キット部品番号 TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents 参考 : 高温 RT ステップが必要な場合には TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents を使用してください N SYBR Green 試薬 Power SYBR Green RT-PCR Reagents Kit SYBR Green RT-PCR Reagents

58 第 3 章 定量実験 2 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量 TaqMan 試薬 試薬ステップキット部品番号 PCR ステップのみ TaqMan Gene Expression Master Mix, 1-Pack(1 5 ml) 200 反応 RT ステップのみ TaqMan Gene Expression Master Mix 10-Pack(10 5 ml) 2000 反応 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2 ) No AmpErase UNG High-Capacity cdna Reverse Transcription Kit TaqMan Reverse Transcription Reagents N SYBR Green 試薬 RT ステップと PCR ステップの両方 PCR ステップのみ TaqMan Gold RT PCR Kit N Power SYBR Green PCR Master Mix SYBR Green PCR Master Mix RT ステップのみ High-Capacity cdna Reverse Transcription Kit TaqMan Reverse Transcription Reagents N RT ステップと PCR ステップの両方 Power SYBR Green RT-PCR Reagents Kit SYBR Green RT-PCR Reagents AmpliTaq Gold DNA Polymerase について ホットスタート酵素である AmpliTaq Gold DNA Polymerase の使用は TaqMan および SYBR Green 試薬に関する Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインの重要事項です AmpliTaq Gold DNA Polymerase によって 確実な反応が行われ 生じる非特異的生成物の量を大幅に低減できます また アッセイのセットアップが簡素化され 室温で測定可能であることも利点に数えられます 参考 : TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2 ) No AmpErase UNG に含まれている DNA ポリメラーゼは 迅速なホットスタート PCR が可能です 性能は AmpliTaq Gold DNA Polymerase に劣りません MultiScribe Reverse Transcriptase について MultiScribe Reverse Transcriptase は RNA を相補 DNA(cDNA) に逆転写する 遺伝子組み換え Moloney マウス白血病ウイルス (MuLV) 逆転写酵素です 3-26

59 第 3 章 定量実験 推奨サーマルサイクリング条件の使用 サンプルに応じて推奨されるサーマルサイクリング条件を用います DNAまたは cdna 定量 (3-28 ページ ) 1 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量 (3-28 ページ ) 2 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量 (3-29 ページ ) 参考 : Fast 試薬用のサーマルサイクリング条件は 標準試薬用のサーマルサイクリング条件と異なります VeriFlex 技術について StepOnePlus 装置には 個別に熱制御可能な VeriFlex ブロックが 6 個あり サーマルサイクリング条件の最適化が容易です StepOnePlus 装置で実験を測定するときに VeriFlex ブロックは それぞれ異なる温度設定をしてサンプルに応じて最高で 6 つのゾーンを作成することも すべての VeriFlex ブロックを同じ温度にすることも可能です VeriFlex サンプルブロックの使用に関する詳細については ツールバーのをクリックするか F1 を押して StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください 3-27

60 第 3 章 定量実験 DNA または cdna の定量 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2 ) No AmpErase UNG については 以下の条件に従います 時間と温度 初期ステップ PCR(40 サイクル ) AmpErase UNG の活性化 活性化融解アニール / 伸長 ホールドホールドサイクル 50 C で 2 分 95 C で 20 秒 95 C で 1 秒 60 C で 20 秒 AmpErase UNG を反応に加えた場合にのみ必要 TaqMan Gene Expression Master Mix TaqMan 2 Universal PCR Master Mix および Power SYBR Green PCR Master Mix については 以下の条件に従います 時間と温度 初期ステップ PCR(40 サイクル ) AmpErase UNG の活性化 AmpliTaq Gold DNA Polymerase の活性化 融解 アニール / 伸長 ホールドホールドサイクル 50 C で 2 分 95 C で 10 分 95 C で 15 秒 60 C で 1 分 AmpErase UNG を反応に加えた場合またはマスターミックスに含まれている場合にのみ必要 1 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量 TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit および Power SYBR Green RT-PCR Reagents Kit については 以下の条件に従います 時間と温度 初期ステップ PCR(40 サイクル ) 逆転写 AmpliTaq Gold DNA Polymerase の活性化 融解 アニール / 伸長 ホールドホールド 40 サイクル 48 C で 30 分 95 C で 10 分 95 C で 15 秒 60 C で 1 分 参考 : この条件は TaqMan EZ RT-PCR Kit 用ではありません 適切な条件については TaqMan EZ RT-PCR Kit Protocol をご覧ください 3-28

61 第 3 章 定量実験 2 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量 High-Capacity cdna Reverse Transcription Kit については 以下の条件に従います ステップ 時間と温度 ステップ 1 ステップ 2 1. RT ステップ ホールド ホールド 25 C で 10 分 37 C で 120 分 RNA を cdna に逆転写した (RT ステップ ) 後 サンプルを貯蔵したり 続いて行う PCR ステップ ( 下記 ) に使うことができます 重要! ほとんどの使用例や大量の cdna が必要な場合 Applied Biosystems は 最適な変換が行われるよう 37 C で 120 分 逆転写を行うことをお勧めします TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2 ) No AmpErase UNG については 以下の条件に従います ステップ 時間と温度 初期ステップ PCR(40 サイクル ) 2. PCR ステップ AmpErase UNG の活性化 AmpliTaq Gold DNA Polymerase の活性化 融解 アニール / 伸長 AmpErase UNG を反応に加えた場合にのみ必要 ホールドホールドサイクル 50 C で 2 分 95 C で 20 秒 95 C で 1 秒 60 C で 20 秒 TaqMan Gene Expression Master Mix TaqMan 2 Universal PCR Master Mix (with AmpErase UNG) および Power SYBR Green PCR Master Mix については 以下の条件に従います ステップ 時間と温度 初期ステップ PCR(40 サイクル ) 2. PCR ステップ AmpErase UNG の活性化 AmpliTaq Gold DNA Polymerase の活性化 融解 アニール / 伸長 ホールドホールドサイクル 50 C で 2 分 95 C で 10 分 95 C で 15 秒 60 C で 1 分 3-29

62 第 3 章 定量実験 プライマー濃度の最適化 フォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度を個別に変更することによって 最適なアッセイ性能が得られる濃度を特定することができます プライマーは PCR 増幅の指数関数的領域では モル数が常に大幅な余剰の状態にあります TaqMan Gene Expression Master Mix または TaqMan 2 Universal PCR Master Mix を使用する場合には Applied Biosystems は プライマー濃度を下記の プライマー濃度のデフォルト値 に示す濃度とすることをお勧めします 次の事項に関する詳細な説明を以下に記します プライマー最適化マトリックス ( 下記 ) TaqMan 試薬 ( 下記 ) SYBR Green 試薬 (3-31 ページ ) プライマー濃度のデフォルト値 下記の表に示した推奨開始プライマー濃度は DNA および cdna 定量アッセイ用です 濃度 (nm) 試薬フォワードプライマーリバースプライマー TaqMan 試薬 SYBR Green 試薬 プライマー最適化マトリックス プライマー最適化マトリックスを行うと 最小の C T 値と最大の R n 値を生じる最小のプライマー濃度を決定することができます プライマー最適化マトリックスによって 非特異的プライマー結合の補正を行います 非特異的結合は 特定の部位に結合するプライマー量を低下させる可能性があります TaqMan 試薬 TaqMan 試薬を用いた定量アッセイでは 一定量のターゲットテンプレートに対して最小の C T 値と最大の Rn 値を生じるプライマー濃度を選択することによって 最適な性能が得られます 参考 : C T 値はリアルタイム定量アッセイにおいて数値で表されるパラメータですが Rn 値も最大の感度と再現性を得る上で重要です TaqMan 試薬プライマー最適化マトリックスによる実験結果の具体例を図 3-4(3-31 ページ ) に示します 図 3-4a には 各プライマー濃度の組み合わせに対する増幅プロットを線形表示で示しました 図 3-4b には 同じデータを対数表示で示しました フォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ 50nM である組み合わせ ( プロットグループ C) の場合に Rn が最小で C T が最大になっています フォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれかが 150nM の組み合わせ ( プロットグループ B) でも Rn 値が低下しています フォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ少なくとも 300nM の組み合わせ ( プロットグループ A) の場合に Rn が最大で C T が最小になっています 結果として プロットグループ A または B の組み合わせのときに 最適性能が得られます 3-30

63 第 3 章 定量実験 a) 線形表示 プロットグループ A プロットグループ B プロットグループ C サイクル b) 対数表示 プロットグループ A プロットグループ B プロットグループ C サイクル 図 3-4 プライマー濃度を組み合わせて行ったプライマー最適化実験による増幅結果のプロット ( 線形および対数表示 ) プロットグループ名 : A: フォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ少なくとも 300nM 含む組み合わせ B: フォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ少なくとも 150nM 含む組み合わせ C: フォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ少なくとも 50nM 含む組み合わせ SYBR Green 試薬 SYBR Green 試薬を用いた定量アッセイの場合には プライマー濃度の最適化は 若干複雑になります TaqMan 試薬と同じプライマー最適化マトリックスを行いますが SYBR Green 試薬の場合にはネガティブコントロールを加えなければなりません 選択するプライマー濃度は ターゲットテンプレートに対して低い C T 値と高い Rn 値を示す必要がありますが ネガティブコントロールに対して非特異的生成物が形成してはいけません 3-31

64 第 3 章 定量実験 SYBR Green 試薬を用いた定量アッセイに最適なプライマー濃度を選択する場合 融解曲線やゲル解析が極めて有用になります 図 3-5(3-32 ページ ) に 900nM のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー最適化マトリックスの結果を示します 図 3-5a では ネガティブコントロールウェルで強い増幅が起こっています これは 非特異的増幅がかなりの程度発生していることを表します 図 3-5b では テンプレートを加えずに得られた生成物の融解温度が テンプレートを加えて得られた生成物の融解温度よりも低くなっています これは 非特異的増幅がかなりの程度発生していることを表します 図 3-5 に示した結果は プライマーダイマー形成に典型的なものです これらの結果から プライマー濃度が低いと一層最適な結果が得られることがわかります また 目的とするターゲットに対して別のプライマーセットを再設計することもできます a) 増幅プロット ( 線形表示 ) ターゲット増幅 NC( 非特異的増幅 ) b) 融解曲線解析 NC ( 非特異的増幅 ) ターゲット増幅 図 3-5 SYBR Green 試薬を用いた増幅データ (a) ネガティブコントロール (NC) ウェルで非特異的増幅が起こっている可能性があることを示す増幅プロット ( 線形表示 ) (b)nc ウェル中の生成物が特定の生成物とは異なる融解温度を有することを表す融解曲線解析 3-32