ラット褐色脂肪細胞培養キット（製品コード MK422）、ラット褐色／白色脂肪細胞専用培地セット（製品コード MK423）、ラット褐色脂肪前駆細胞（製品コード MK424）

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えのほうねん
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1 研究用製品コード MK422/MK423 MK424 ラット褐色脂肪細胞培養キット ( 製品コード MK422) ラット褐色 / 白色脂肪細胞専用培地セット ( 製品コード MK423) ラット褐色脂肪前駆細胞 ( 製品コード MK424) 説明書 v201406

2 褐色脂肪組織は褐色脂肪細胞を主な構成細胞とし肩甲骨間腋窩後頚部心臓腎周囲に存在しています交感神経系の支配のもとに組織内で脂肪を酸化分解して熱を発生させ寒冷から臓器を守ったり過食後の余分なエネルギーを熱として体外へ放散するラジエーターとして働いています一般に脂肪組織というと皮下や内臓周囲などに広く分布している白色脂肪組織 ( 過剰なエネルギーを中性脂肪として貯蔵しエネルギー不足状態に応じてそれを脂肪酸に分解し血中に放出する機能をもつ ) をさす場合が多いのですが褐色脂肪組織はそれとは機能的に大きく異なりますまた両者の細胞は形態学的にも異なります白色脂肪細胞は単房性の大脂肪滴で満たされており核や細胞質は細胞周辺へおしつけられています一方褐色脂肪細胞は多房性の脂肪滴と豊富なミトコンドリアで満たされています過食がエネルギーの過剰摂取となり白色脂肪細胞に脂肪として蓄積され肥満を引き起こすことはよく知られていますがエネルギーの過剰摂取がなくても肥満が起こる場合があることが小型齧歯類 ( ラットやマウス ) を使った実験で明らかになってきましたこれは褐色脂肪組織の機能が低下している場合ですこの状態では褐色脂肪細胞によるエネルギーの熱への変換が低下し消費されなかった余剰エネルギーが脂肪として蓄積するため肥満が起こると考えられましたしかしヒトの場合では褐色脂肪細胞が新生児には確認されても成人ではほとんど確認できないくらいにしか存在していないため褐色脂肪細胞と肥満との結びつきが疑問視されることも少なくありませんでしたところが最近になって小型齧歯類の褐色脂肪細胞に存在する熱産生分子 uncoupling protein(ucp; 酸化的リン酸化を脱共役する機能をもち化学エネルギーを ATP ではなく熱に変換する ) と類似のタンパク質がヒトの骨格筋などに多量に発現していることが明らかになりましたまた褐色脂肪細胞と白色脂肪細胞を選択的に活性化させる肥満の特効薬として注目を集めている β3-adrenoreceptor (β 交感神経系受容体 )agonist が発見されさらにこの受容体がヒトの腸管や胆嚢骨格筋にも存在することが明らかにされましたこのように肥満に関する研究の材料として褐色脂肪細胞が最近注目されるようになってきましたしかし褐色脂肪細胞は株化細胞として ATCC などから容易に入手できないためラットなどの齧歯類から褐色脂肪組織を分離しそれを培養して褐色脂肪細胞を調製する必要がありましたそこで弊社では SD ラットの肩甲骨間より褐色脂肪前駆細胞を分離し細胞と専用培地をキットにしました本キットを用いればキットに含まれる前駆細胞を専用培地中で継代培養し手順に従って分化させるだけで褐色脂肪細胞を調製することができますまた専用培地セットのみの販売も行っておりますので脂肪組織に関わる生理活性の探索や肥満や糖尿病に対する特効薬のスクリーニング熱産生分子に関する実験などにも利用することができます I. 製品内容 MK422; ラット褐色脂肪細胞培養キット 1. ラット褐色脂肪前駆細胞 ( 凍結細胞 )> cells/vial 1 本マイコプラズマ検査済継代保証回数 1 回 2. 基本培地 (DMEM 高グルコース) 500 ml 1 本培地添加試薬 3. アスコルビン酸 1 ml 1 本 4. ビオチン 1 ml 1 本 5. パントテン酸 1 ml 1 本 6. トリヨードチロニン 0.5 ml 1 本 7. オクタン酸 1 ml 1 本 8. 牛胎児血清 50 ml 1 本 9. 抗生物質 5 ml 1 本 10. インシュリン 1 ml 2 本 10. インシュリン 1 ml 1 本 11. デキサメタゾン 0.5 ml 1 本イソブチル -1- メチルキサンチン 0.1 ml 1 本基本培地用添加試薬 ( 培地 500 ml 分 ) 維持培地用添加試薬 ( 培地 200 ml 分 ) 分化培地用添加試薬 ( 培地 100 ml 分 ) 2

3 MK423; ラット褐色 / 白色脂肪細胞専用培地セット ( 細胞は含まれておりません ) 2. 基本培地 (DMEM 高グルコース) 500 ml 1 本 3 ~ 培地添加試薬各 1 本 10. 培地添加試薬 3 本 MK424; ラット褐色脂肪前駆細胞 ( 培地セットは含まれておりません ) 1. ラット褐色脂肪前駆細胞 ( 凍結細胞 )> cells/vial 1 本マイコプラズマ検査済継代保証回数 1 回 II. 保存 1. ラット褐色脂肪前駆細胞 : 液体窒素保存 * 2. 基本培地 :4 保存 3. ~ 12. 培地添加試薬 :- 20 保存 *: 製品到着後ただちに液体窒素中で保存してください適切に保存し受取り後 1 年を目途にご使用くださいなお液体窒素保存のできない場合はただちに細胞を融解し培養を行ってください III. その他必要な試薬および器具 ( 主なもの ) 滅菌済み PBS(-):Phosphate Buffered Salts( 製品コード T900) トリプシン溶液 :0.1% トリプシン 0.02% EDTA を含む PBS(-) 培養用のディッシュフラスコマルチプレート類滅菌済みピペット 3

4 IV. フローチャートラット褐色脂肪細胞は継代を繰り返すと分化能が低下しますご購入いただいた凍結細胞 ( 初代細胞 ) を培養した 2 代目細胞または 1 回だけ継代した 3 代目の細胞で分化を誘導してください 2 代目の細胞で分化を誘導する場合増殖継代して 3 代目を分化誘導する場合増殖凍結保存後 3 代目で分化誘導する場合凍結細胞 ( 初代細胞 ) を融解 2.5~ cells/cm 2 密度で接種 ( 増殖培地 ) 2 代目で分化誘導する場合はここで目的の容器に接種する 1~ cells/cm 2 密度で接種 ( 増殖培地 ) 翌日培地を交換 ( 増殖培地 ) 90% コンフルエンスで分化誘導 ( 分化培地で 48 時間 ) 70 ~ 90% コンフルエンスでサブカルチャー目的の培養容器に継代凍結保存 ( 増殖培地 ) 維持培地に交換 5 ~ 7 日に一度培地交換 (2 ~ 3 日後から分化した細胞が観察される ) 90% コンフルエンスで分化誘導 ( 分化培地で 48 時間 ) 維持培地に交換 5 ~ 7 日に一度培地交換 (2 ~ 3 日後から分化した細胞が観察される ) 融解接種 (3 代目 ) 培地交換 ( 増殖培地 ) 90% コンフルエンスで分化誘導維持培地に交換 5 ~ 7 日に一度培地に交換各種実験に使用サブカルチャーや凍結保存する前の細胞が過剰に増殖している状態の場合その後の細胞の増殖や分化能が落ちますのでご注意ください 4

5 V. 細胞培養方法の手順ラット褐色脂肪前駆細胞は凍結保存培地 (10% FCS 10% DMSO を添加した培地 ) 中に凍結保存されたままドライアイス (- 80 ) 詰めにされてお手元に届きます製品が到着しましたらただちに液体窒素中で保存してください液体窒素保存のできない場合はただちに細胞を融解し細胞培養を行ってください A. 培地の準備培養セットの中の添加試薬 (3. ~ 11.) を自然解凍または 37 のインキュベーターで解凍してください 12. は必要に応じて解凍してください解凍後の試薬に析出物がみられた場合はさらに 37 に保温して完全に内容物を溶解してください基本培地も 37 に一時保温してください 1. 培地と添加試薬を 37 のインキュベーターから取り出しチューブまたはボトルの表面を 70% エタノールで拭くまたは噴霧して殺菌する 2. クリーンベンチ内で培地 500 ml に 10. インシュリン 11. デキサメタゾン ( イソブチル -1- メチルキサンチン ) を除くすべての添加試薬 (3. ~ 9.) を添加して増殖培地をつくる 3. そこから滅菌した 100 ml 容ボトル 2 本にそれぞれ増殖培地を 100 ml ずつ移しかえ 1 本のボトルに分化培地用の添加試薬 [10. インシュリン 1 本と 11. デキサメタゾン ( イソブチル -1- メチルキサンチン )] を添加しもう 1 本のボトルには維持培地用の添加試薬 (10. インシュリン 1 本 ) を添加しておく冷えた培地に添加試薬を投入すると成分が析出する場合があります万一析出物がみられた場合は混合物をいったん 37 に保温して完全に溶解してください ( 完全融解後には析出はみられません ) イソブチル -1- メチルキサンチンは褐色脂肪細胞の分化に必須ではありませんが分化培地に添加するとより確実に分化を誘導することができます必要に応じてご使用ください分化培地維持培地がそれぞれ 100 ml ずつ必要のない場合は必要時に増殖培地 10 ml 当たり分化用であれば 10. インシュリン 100 μl と 11. デキサメタゾン 50 μl( イソブチル -1- メチルキサンチン 10 μl) を添加し維持用であれば 10. インシュリン 100 μl のみを添加してください添加因子を加えた培地は 4 で約 2 ヶ月保存可能ですラット褐色脂肪細胞は温度変化の影響を受けやすいため培地は必ず室温または 37 に保温してから使用してください B.2 代目の細胞で分化を誘導する場合 1. 培養容器の準備ラット褐色脂肪前駆細胞の培養にはコラーゲンコートされたディッシュフラスコプレートが適している 1-1. 細胞接種密度は 2.5 ~ cells/cm 2 が望ましいため凍結バイアルに記載されている細胞数 (> cells/vial) をもとに培養したい容器を準備する 10 cm ディッシュであれば 5 ~ 8 枚 60 mm ディッシュまたは T-25 フラスコであれば 12 ~ 20 枚 ( 個 ) 24 well プレートであれば 6 ~ 10 枚用意する上記以外の容器を分化誘導に使用する場合は面積に応じて必要な枚数を準備する ( 参考 )10 cm ディッシュ ( 約 55 cm 2 ) 60 mm ディッシュ ( 約 21 cm 2 ) 6 well プレート (9.5 cm 2 /well) 12 well プレート (3.8 cm 2 /well) 24 well プレート (1.9 cm 2 /well) 96 well プレート (0.32 cm 2 /well) 5

6 1-2. 無菌的に培地のボトルを開けて培養面積 4 cm 2 に対して 1 ml の割合で培地を加える 60 mm ディッシュまたは T-25 フラスコであれば約 5 ml の培地を 10 cm ディッシュであれば約 15 ml の培地を加える 1-3. 培地を加えた培養容器を 37 5% CO2 インキュベーターに入れ使用時までインキュベートすることが望ましい 2. 推奨する細胞の融解方法細胞は非常にデリケートなので細胞を融解してから新しい培地に接種するまでの時間はできるだけ短くするようにしなければなりません融解した細胞は過激な遠心を避けてください 2-1. 凍結細胞バイアルを液体窒素から取り出すバイアル表面を 70% エタノールで拭くかまたは噴霧して滅菌するクリーンベンチ内でバイアルの蓋を少しまわして内圧を抜き再び閉めるの恒温槽に細胞バイアルの 3/4 を浸し中身が融解するまでバイアルを約 1 ~ 2 分ゆっくりまわして混ぜる ( バイアルの口は浸さないこと ) 最後の氷の固まりが溶ける直前で恒温槽から取り出す ( 細胞が融解した状態で恒温槽の中に放置すると細胞は死んでしまう ) 2-3. バイアルを出したらすぐに周囲の水を拭き取り 70% エタノールで拭くかまたは噴霧で滅菌しクリーンベンチ内に移す 3. 細胞の接種 3-1. バイアルの蓋をとるバイアルの口に触れないこと ml 容の細い滅菌ピペットでバイアルの中に入れてなるべくゆっくりと 1 ~ 2 回ピペッティングして吸い上げるピペッティングし過ぎたり泡立てないよう気をつける % CO2 インキュベーターであらかじめ温めておいた培地の入った培養容器に細胞を等量ずつ加える % CO2 インキュベーターで再び培養する 4. 培地の交換細胞を培地に接種した次の日は DMSO および未接着の細胞をのぞくために培地を交換しその後は細胞の状態をチェックしながら培地を交換する 90% コンフルエンス注の状態になるまで培養する注意 : 過剰に増殖させてしまうと分化能が落ちますので注意してください 5. 分化誘導 5-1. 分化培地を用意する増殖培地 10 ml に対してインシュリン 100 μl とデキサメタゾン 50 μl を添加しておく ~ 95% コンフルエンス状態になった細胞の培地を除去する 5-3. 分化培地を入れ 2 日 (48 時間 ) 培養する 5-4. 分化培地を除去した後維持培地に交換して 5 ~ 10 日間培養する 5 ~ 7 日に一度培地交換する徐々に細胞内に脂肪が蓄積されていくのが観察できる C. 増殖継代して 3 代目を分化誘導する場合 1. [B. 2 代目の細胞で分化を誘導する場合 ] の 1. ~ 3. の手順に従い細胞を融解接種する 6

7 2. 培地の交換細胞を培地に接種した次の日は DMSO および未接着の細胞をのぞくために培地を交換するその後は細胞の状態をチェックしながら培地を交換する細胞を維持するには 70 ~ 90% コンフルエンスの状態で植え継ぐ必要がある細胞が過剰に増殖すると接着阻害が起こり培養容器から細胞が剥がれてしまったりトリプシンが作用しにくくなる 3. 細胞の植え継ぎ : サブカルチャー 10 cm ディッシュを使用する場合の例を示します他のサイズの容器を使用する場合は適宜変更してください 3-1. 試薬の準備をする ( 室温に戻しておく ) トリプシン溶液 (0.1% トリプシン / 0.02% EDTA in PBS) 滅菌 PBS 増殖培地 3-2. クリーンベンチ内でセミコンフルエンス (70 ~ 90% コンフルエンス ) になった培養容器を取り出し培地を吸引除去する 3-3. 室温に戻した滅菌済み PBS 5 ~ 10 ml で細胞の表面を洗浄する 3-4. 洗浄した PBS を吸引除去する 3-5. 室温に戻したトリプシン溶液をすべての細胞が覆われるように入れる (10 cm ディッシュの場合は 2 ~ 3 ml 程度 ) トリプシンが全体に行き渡ったらできるだけ余分なトリプシンは吸引除去しておく 3-6. 細胞が丸くなっていく様子を顕微鏡で観察して 90% 以上が丸くなったことを確認してディッシュを手のひらまたは固いものに打ちつけて細胞の剥がれ具合を見るディッシュを少し斜めにして表面から大部分の細胞が剥がれて流れ落ちるまでトリプシン処理をつづける剥がれない場合は再び手のひらまたは固いものに打ちつけてみる 3-7. 細胞が剥がれたのを確認できたら直ちに増殖培地 5 ml をディッシュに加えてトリプシンを中和する ml の滅菌遠心チューブに細胞をすばやく移しディッシュに残っている細胞を滅菌 PBS 5 ml で洗って遠心チューブに加えて 1,000 ~ 1,500 rpm で 5 分間遠心する上清を除去して増殖培地 5 ml を入れて静かにピペッティングする 3-9. 細胞懸濁液の一部をとりヘマトメーターで細胞数をカウントする実験に必要な培養容器 ( ディッシュプレート ) に細胞を希釈して播く翌日コンフルエンスになるように細胞数を調整するたとえば 24 well プレート (1.9 cm 2 /well) を使用した場合 cells/well で播くとほぼ 1 日でコンフルエンスに近い状態になる ( 参考 )10 cm ディッシュ ( 約 55 cm 2 ) 60 mm ディッシュ ( 約 21 cm 2 ) 6 well プレート (9.5 cm 2 /well) 12 well プレート (3.8 cm 2 /well) 96 well プレート (0.32 cm 2 /well) 4. 分化誘導 4-1. 分化培地を用意する増殖培地 10 ml に対してインシュリン 100 μl とデキサメタゾン 50 μl を添加しておく ~ 95% コンフルエンス状態になった細胞の培地を除去する 4-3. 分化培地を入れ 2 日 (48 時間 ) 培養する 4-4. 分化培地を除去した後維持培地に交換して 5 ~ 10 日間培養する 5 ~ 7 日に一度培地交換する徐々に細胞内に脂肪が蓄積されていくのが観察できる 7

8 D. 増殖凍結保存後 3 代目で分化誘導する場合 1. [B. 2 代目の細胞で分化を誘導する場合 ] の 1. ~ 3. の手順に従い細胞を融解接種するただし細胞接種密度は 1 ~ cells/cm 2 にする 2. [C. 増殖継代して 3 代目を分化誘導する場合 ] の 2. ~ 3-9. の手順に従い細胞を剥がし細胞数を計測する 3. 細胞の凍結保存 3-1. 細胞数を計測したら再び 1,000 ~ 1,500 rpm で 5 分間遠心し上清を除去する 3-2. 凍結培地 ( 増殖培地に 10% DMSO を添加したもの ) を凍結バイアルあたり約 cells( 約 2 ml) になるように加え細胞を懸濁する 3-3. 細胞懸濁液を凍結バイアルに入れさらにバイアルをスチロールの箱に入れて - 80 のフリーザー中に一晩置き凍結させる 3-4. 翌日凍結バイアルを液体窒素中に移して保存する 4. [B. 2 代目の細胞で分化を誘導する場合 ] の手順に従い細胞を融解接種分化させる褐色脂肪前駆細胞をより確実に分化誘導させる方法分化培地添加試薬 10. インシュリン 11. デキサメタゾンに加えてイソブチル -1- メチルキサンチンを添加することによってより確実に分化誘導できます株化細胞マウス胎仔由来の 3T3-L1(ATCC Catalog No. CL-173) を分化させて脂肪細胞にすることが知られていますこの細胞は休止期に入ると脂肪細胞へと分化する性質をもっていますが分化を促進させるものとしてインシュリンがありますしかしインシュリンのみを用いると分化させるためには長期間かかり分化誘導率もよくありませんそこでインシュリンデキサメタゾン 3- イソブチル -1- メチルキサンチンなどいくつかの薬剤を添加して分化誘導率を高めている報告がありますこれと同様にラット褐色脂肪前駆細胞に薬剤を添加することによって短期間でほとんどの細胞が褐色脂肪細胞へと分化させることができます ( 分化培地の調製 ) 分化培地 100 ml に 10. インシュリン 11. デキサメタゾンを入れた後イソブチル -1- メチルキサンチンを 100 μl 添加します 8

9 褐色脂肪前駆細胞分化褐色脂肪細胞インシュリンデキサメタゾン添加インシュリンデキサメタゾン 3- イソブチル -1- メチルキサンチン添加分化により褐色脂肪前駆細胞が小さな油滴で満たされ多房性構造をもつ褐色脂肪細胞になることが顕微鏡で確認できる 9

10 VI. 参考文献 1) 関谷敬三奥田拓道 (1992) 代謝 29, ) Jan Nedergaard and Olov Lindberg (1982) Int Rev Cytol. 74, ) Myriam Nechad, Pertti Kuusela, Claes Carneheim, Per Bj rntorp, Jan Nedergaard and Barbara Cannon (1983) Exp. Cell Res. 149, ) Claude Forest, Alain Doglio, Louis Casteilla, Daniel Ricquier and Gerard Ailhaud (1987) Exp. Cell Res. 168, ) Stefan Rehnmark, Jan Kopecky, Anders Jacobsson, Myriam Nechad, David Herron, B. Dean Nelson, Maria-Jesus Obregon, Jan Nedergaard and Barbara Cannon (1989) Exp. Cell Res. 182, ) 吉田俊秀 (1991) 医学のあゆみ , ) Yasutake Shimizu, Danuta Kielar, Hiroshi Masuno, Yasuhiko Minokoshi and Takashi Shimazu (1994) J. Biochem. 115, ) Hideki Nikami, Yasutake Shimizu, Michihiro Sumida, Yasuhiko Minokoshi, Toshihide Yoshida, Masayuki Saito and Takashi Shimazu (1996) J. Biochem. 119, VII. 関連製品ラット白色脂肪前駆細胞 ( 製品コード MK428) ラット白色脂肪細胞培養キット ( 製品コード MK427) 脂肪細胞分化 / 維持試薬 [AdipoInducer Reagent (for animal cell)]( 製品コード MK429) VIII. 注意本製品は研究用試薬ですヒト動物への医療臨床診断には使用しないようご注意くださいまた食品化粧品家庭用品等として使用しないでくださいタカラバイオの承認を得ずに製品の再販譲渡再販譲渡のための改変商用製品の製造に使用することは禁止されていますライセンスに関する情報は弊社ウェブカタログをご覧ください本説明書に記載されている会社名および商品名などは各社の商号または登録済みもしくは未登録の商標でありこれらは各所有者に帰属します 10

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12 v201406

正常ラット軟骨細胞 Normal Rat Cartilage Cell

製品コード MK442 研究用正常ラット軟骨細胞 Normal Rat Cartilage Cell 説明書 v201108 軟骨組織や骨組織は基本的には支持組織であり軟骨組織の多くは胎生期の骨のモデルとして存在し石灰化して骨組織に置換されますまた体幹形態の決定筋肉の支えや配置に関与しています一方骨組織は支持組織であるとともにカルシウムやリンなど各種ミネラル貯蔵庫としてもまた体液のイオン調節機構の担い手としても重要な組織です

ラット褐色脂肪細胞培養キット（製品コード MK422）、ラット褐色／白色脂肪細胞専用培地セット（製品コード MK423）、ラット褐色脂肪前駆細胞 （製品コード MK424）

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