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1 HILIC ILIC BEH BEH ihon Waters K.K. HILIC HILIC HILIC MS Sub-µm 009 ihon Waters K.K.

2 HILIC? HILIC - Hydrophilic Interaction Chromatography 990 * HILIC (> 80%) *Alpert A. J. J.Chromatogr. 99 (990) ihon Waters K.K. HILIC : (> 80%) ESI-MS PPT / PPT LLE SPE 009 ihon Waters K.K.

3 Waters HILIC HILIC (ph-5) Atlantis HILIC Silica HILIC (ph-8) XBridge HILIC ACQUITY UPLC BEH HILIC 009 ihon Waters K.K. 5 XBridge TM HILIC: : XBridge TM HILIC 009 ihon Waters K.K. 6

4 ew ACQUITY UPLC BEH Amide : :.7 µm (.5 µm 09 ) : 7.5 µmol/m : % : one ph : ihon Waters K.K. 7 HILIC 009 ihon Waters K.K. 8

5 : HILIC 5.5 Retention Map H Retention Factor H + Cytosine HILIC RP % Acetonitrile HILIC 009 ihon Waters K.K. 9 : actor Retention Fa Retention Factor Silica Particle A icotinic acid ortriptyline Cytosine Methacrylic acid % Acetonitrile 6 icotinic acid ortriptyline 0 Cytosine 8 Methacrylic acid 6 0 BEH Particle B % Acetonitrile BEH 90% BEH : 0 mm with % H C H CH Methacrylic Acid pka.58 H H Cytosine pka =. ortriptyline pka = 0 CH H H 009 ihon Waters K.K. 0 icotinic Acid pka =.,.8 5

6 Atlantis HILIC Silica Retention Factor = 0 Atlantis dc 8 H H H H Allantoin HILIC Retention Factor =. Atlantis HILIC Silica HILIC ihon Waters K.K. XBridge TM HILIC XBridge TM C 8 HILIC V 0 = acetyl morphine HILIC XBridge TM HILIC. morphine V 0 = Morphine -ß-D-Glucuronide 009 ihon Waters K.K. 6

7 HILIC : BEH Amide vs. BEH HILIC 0.60 U ACQUITY UPLC BEH HILIC. x 00 mm.7 µm. Methacrylic Acid. Cytosine. ortriptyline. icotinic Acid ACQUITY UPLC BEH Amide. x 00 mm.7 µm ew BEH Amide HILIC /5/5 AC/EtH/0 mm CH CH in H with % CH CH 0.5 ml/min. 5 C.5 µ 60 µg/ml 75/5 AC/MeH UV 0 nm 009 ihon Waters K.K. BEH Amide vs. BEH HILIC BEH Amide BEH HILIC 009 ihon Waters K.K. 7

8 UPLC BEH Amide ELSD on ACQUITY UPLC using 0.5mL/min at 85 C Isocratic: 77% Acetone with 5% TEA. x 50mm Columns 0.7µL injection Strawberry Smoothie Hot Cross Buns White Bread Tomato Ketchup Lamb Curry Meal Raisin Bran Cereal 5 Sports Drink Food Sugars ) Fructose ) Glucose ) Sucrose ) Maltose 5) Lactose (mg/ml each) 009 ihon Waters K.K. 5 : ( methanol isopropanol) HILIC / ph *; ph 5*; 0.% ph.5* 0.% ph.8* 0mM 0.% HILIC MS ph ph Canals I.; umada F. Z.; Roses M.; Bosch E. J. Chromatogr. A. 9 (00) ihon Waters K.K. 6 8

9 HILIC : Water Strongest Methanol Ethanol Isopropanol Primary Solvent Acetonitrile Weakest 009 ihon Waters K.K. 7 : 90:0 AC:H :5:5 AC:H :MeH :5:5 AC:H :EtH 90:5:5 AC:H :IPA mm ammonium acetate with % acetic acid Analytes: : methacrylic acid : cytosine : nortriptyline : nicotinic acid 009 ihon Waters K.K. 8 9

10 : ph tion to e (k') Relative Retent Acenaphthene H H salicylic acid BEH Amide BEH HILIC mobile phase ph H H H ion to e (k') Relative Retent Acenaphthene H ascorbic acid (Vit C) BEH Amide BEH HILIC mobile phase ph Relative Retention to Acenaphthene (k') nicotinic acid BEH Amide H C BEH HILIC.0 H CH mobile phase ph Relative Retention to Acenaphthene (k') H methacrylic acid BEH Amide BEH HILIC mobile phase ph 009 ihon Waters K.K. 9 : ph tion to e (k') Relative Retent Acenaphthene Relative Retention to Acenaphthene (k') H H cytosine BEH Amide BEH HILIC mobile phase ph H CH nortriptyline BEH Amide BEH HILIC mobile phase ph ion to e (k') Relative Retenti Acenaphthene Relative Retention to Acenaphthene (k') H H H H H allantoin norepinephrine BEH Amide BEH HILIC mobile phase ph H H H BEH Amide BEH HILIC mobile phase ph 009 ihon Waters K.K. 0 0

11 : ph ph ph * *.Gara J.E. Wyndham K.D. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol ihon Waters K.K. : vs. HILIC XBridge TM HILIC Atlantis HILIC Silica Injection 0 Injection 0 0 Injection 000 Injection Injection 000 Injection Column:. x 50 mm.5 µm Mobile Phase A: 95:5 acetonitrile: water with 0 mm H + CH C- ph 5.5 ph Mobile Phase B: 50:50 acetonitrile: water with 0 mm H + CH C- ph 5.5 Flow Rate: 0.5 ml/min Gradient: 99%B over minutes %B at. min hold for 0.min Injection Volume:.0 µl (Full loop) Temperature: 0 o C Detection: 5 nm : uracil : 5-fluorouracil : cytosine 009 ihon Waters K.K.

12 : 0mM 0.% / 50:50 BEH Amide / 60: ihon Waters K.K. : 95-50% 5% ( ) ) 95% : 0% in : 9: / / / ( ) ) (75%) 009 ihon Waters K.K.

13 ( ) 75% HILIC 75:5 : 009 ihon Waters K.K. 5 : % H S AC: H S AC: 5 H S ACQUITY UPLC BEH HILIC. x 00 mm.7 µm Analytes. Methacrylic acid. Cytosine. ortriptyline. icotinic acid ihon Waters K.K. 6

14 : S 00% MeH AC: 50 MeH S ACQUITY UPLC BEH HILIC. x 00 mm.7 µm Analytes. Methacrylic acid. Cytosine. ortriptyline. icotinic acid S 75 AC: 5 MeH ihon Waters K.K. 7 MS : vs. HILIC Intens ity.0x0 7.5x0 7 0x0.0x0 7.5x0 7 XBridge TM C 8 00% H H C + CH H C CH. Acetylcholine (Ach).0x x0 6 H C + H C CH H intensity.0x X response.5x0 7.0x0 7.5x0 7.0x x X response HILIC XBridge TM HILIC 8 AC:.5 MeH:.5 H. Choline (Ch) HILIC MS ihon Waters K.K. 8

15 MS ph ph vs HILIC inte ensity x0 6 x0 6 ph intensity 0 x0 6 x0 6 ph Morphine 0 x0 6 HILIC HILIC : intensity x0 6 ph. ph ihon Waters K.K. 9 SPE SPE / SPE * HILIC *Jernal M. Teitz D. uyang Z. J.Chromatogr. B 7 (999) ihon Waters K.K. 0 5

16 : SPE SPE XBridge TM HILIC asis MCX µelution Plate / / 00 µl MeH/ 00 µl H 0 ng/ml 6-acetylmorphine spiked into human plasma 00 µl spiked human plasma with % H P 00 µl % HCH in H 00 µl MeH 00 µl AC 0 ng/ml morphine spiked into human plasma 50 µl 5% H H in AC / ihon Waters K.K. Sub-µm : HILIC Sub- µm 0 µm Atlantis HILIC Silica H.7 µm ACQUITY UPLC BEH HILIC H (µm) 0 H Cytosine (B) Conditions 0 ACQUITY UPLC with TUV. x 50 mm column 90% AC with 0 mm ammonium formate (pre-mixed) Inj. =.0 µl Full loop injection Test Probe: Cytosine (k =.5) 5 nm 0 WW 90% AC with 0 mm ammonium formate 0 Hz, Tc = 0 5 linear velocity (mm/sec) 009 ihon Waters K.K. 6

17 UPLC : intensity 5.0x0 7.5x0 7.0x0 7.5x x0 7.5x0 7.0x0 7 V 0 = 0.5 min.5x0 7.0x x0 6 HPLC XBridge TM HILIC.5 µm F = 0.5 ml/min H C + CH H C CH. Acetylcholine (Ach) H C + H H C CH intensity 5.0x0 7.5x0 7 0x0.0x0 7.5x0 7.0x0 7.5x0 7.0x0 7 V 0 = 0.8 min.5x0 7.0x x0 6 UPLC ACQUITY UPLC BEH HILIC.7 µm F =.0 ml/min.6x Higher Response Ach.6X Higher Response Ch X Faster at Scaled Flow Rate Choline (Ch) UPLC Technology HPLC 009 ihon Waters K.K. ACQUITY UPLC BEH Amide UPLC /MS ph 00 ACQUITY UPLC BEH Amide. Maleic acid ( ppm). Pyruvic acid (50 ppm) HILIC Conditions ph 9.0 SIR Mode Electrospray -. Lactic acid (50 ppm). Succinic acid (50 ppm) 5. Fumaric acid (50 ppm) % ihon Waters K.K. 7

18 ACQUITY UPLC HSS T Atlantis T ACQUITY UPLC BEH C 8 XBridge TM C 8 ph ph MS ACQUITY UPLC BEH HILIC ACQUITY UPLC BEH Amide XBridge TM HILIC Atlantis HILIC Silica LC/MS SPE HILIC Amide 009 ihon Waters K.K. 5 8

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