基礎から分かる UPLC 分離の基礎から最新情報まで 日本ウォーターズ株式会社 JASIS 2014 新技術説明会 9 月 4 日 ( 木 ) 15:30 16: Nihon Waters K.K. 1 アジェンダ イントロダクション UPLC 分離を実現するテクノロジー 更なるカラム

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1 基礎から分かる UPLC 分離の基礎から最新情報まで 日本ウォーターズ株式会社 JASIS 2014 新技術説明会 9 月 4 日 ( 木 ) 15:30 16: Nihon Waters K.K. 1 アジェンダ イントロダクション UPLC 分離を実現するテクノロジー 更なるカラム効率向上に向けて向 UPLC10 周年 2014 Nihon Waters K.K. 2 1

2 UPLC テクノロジーとは? 分離 スピード : 必要性に応じたフレキシビリティ Ultra Speed 0.08 UPLC 2.1 x 30 mm, 1.7 µm Rs (2,3) = 2.90 Speed with Resolution 0.08 UPLC 2.1 x 50 mm, 1.7 µm Rs (2,3) = Absorbance at 270 nm HPLC 2.1 x 150 mm, 5.0 µm Rs (2,3) = Minutes Absorbance at 270 nm Absorbance at 270 nm 13X Speed 4.6X Sensitivity 0.6X Resolution Minutes Resolution with Speed 270 Absorbance at nm 8X Speed 3.6X Sensitivity Same Resolution Minutes Ultra Resolution UPLC x 100 mm, 1.7 µm x 150 mm, µm UPLC Rs (2,3) = 6.18 Rs (2,3) = X Speed 1.8X Sensitivity 1.3X Resolution Absorbance at 270 nm 2.7X Speed 1.2X Sensitivity 1.6X Resolution Minutes Minutes 2014 Nihon Waters K.K. 3 UPLC 分離のための重要なポイント Ultra Performance LCはバンド拡散の理論に基づくテクノロジー 2014 Nihon Waters K.K. 4 2

3 どこでバンドの拡散が起こるか? カラム外カラム内セル内 バンド拡散 : 1) インジェクターからカラム手前まで ( サンプルバンド ) 2) カラムに入りカラム出口まで ( 化合物のバンド ) 3) カラム出口から検出器まで 2014 Nihon Waters K.K. 5 バンド拡散 :α σ 2 tot = σ col2 + σ inj2 + σ tube2 + σ fittings2 + σ det 2 カラム由来拡散 : σ col 2 col 充塡剤粒 径と粒度分布 充塡 法 充塡ベッド密度 カラム容量 カラム壁面構造 エンドフィッテイングとディストリビューターデザイン カラム外拡散 インジェクションボリュームとインジェクターデザイン チューブ (i.d. x L) コネクター 検出器セル 2014 Nihon Waters K.K. 6 3

4 バンド拡散のピーク形状への影響 HPLC ブロードなバンド ブロードなピーク 低い感度 狭いバンド 狭いピーク向上した感度向上した分離能 UPLC Technology 緑色の化合物分 の集団は きく異なる時間で検出器セルに到達する 緑色の化合物分 の集団は全てより近い時間内に検出器セルに到達し より濃縮される バンド拡散を最 限に抑えるためには適切に設計されたカラムと装置の両方が必要 2014 Nihon Waters K.K. 7 アジェンダ イントロダクション UPLC 分離を実現するテクノロジー UPLC 分離を実現するカラムテクノロジー システムデザインの分離への影響 更なるカラム効率向上に向けて UPLC10 周年 2014 Nihon Waters K.K. 8 4

5 van Deemter の法則粒 径を さくすると何故 いカラム効率が得られるのでしょうか? 2014 Nihon Waters K.K. 9 クロマトグラフィー原理物質移動 / 拡散 移動相 分析対象分子 A B ポーラスパーティクル C 2014 Nihon Waters K.K. 10 5

6 拡散についての理解 : van Deemter プロット HETP(H) = A + B / u + C u =a d p +B/u+c d p2 u C Term (Mass Transfer) B Term (Axial Diffusion) A Term (Eddy Diffusion) カラムに生じる Band Spreading を予測する最終的な van Deemter Curve を得るための 3 つの項目 2014 Nihon Waters K.K. 11 van Deemter プロット カラム効率 ( 理論段数 :N) o 理論段 (HETP) 1 理論段あたりのカラム o カラム効率 (N) カラム (L)/ 粒子径 (dp) 2014 Nihon Waters K.K. 12 6

7 粒 径が さいだけで いカラム効率が得られるのでしょうか? 2014 Nihon Waters K.K. 13 UPLC パーティクル開発および製造の課題 UPLC パーティクル開発のための要求事項 : sub-2 µm 充塡剤のプロトタイプを合成 分級 評価できるケミスト 市販できる量のバルク充塡剤を確実に再現性よく製造できる最新の合成設備 UPLC パーティクルの要求事項 : 耐圧 適切な形状 いカラム効率 / 物質移動 度なボンディングおよびエンドキャッピングプロセス HPLC カラムへの要求事項に さらに追加される要求事項 2014 Nihon Waters K.K. 14 7

8 UPLC パーティクル開発および製造の課題 UPLC カラムの開発には : カラム製造技術と併せて固定相合成の革新が不可 2014 Nihon Waters K.K. 15 パーティクルからの LC カラム製造業者 (Primary Manufacturer) ) であることの利点 Primary Manufacturer ウォーターズ シリカ合成 ( ハイブリッド ) ボンディング Bonder ボンディング Column Packers Distributors どのようなパーティクルを使用してどのようにコントロールしているかがクロマトグラフィーに大きく影響する カラム充塡 カラム充塡 カラム充塡 販売 * & 流通販売 & 流通販売 & 流通販売 & 流通 Class I & II 医療機器製造 cgmp 施設として認定 ISO 9001:2008 ISO 13485:2003 * ウォーターズ : ワールドワイドでの販売 & 流通 2014 Nihon Waters K.K. 16 8

9 エチレン架橋型ハイブリッド [BEH] パーティクル U.S. Patent No. 6,686,035 B2 シリカマトリックス中の架橋エタン Anal. Chem. 2003, 75, Nihon Waters K.K. 17 UPLC パーテイクルテクノロジー 60 μm ヒト毛髪 ( 非常にきれいな毛髪 ) 5 μm 分析カラム用パーテイクル ( 毛髪の 1/12) 1.7 μm ACQUITY UPLC パーテイクル 2014 Nihon Waters K.K. 18 9

10 実現するための専門技術 UPLC カラムを差別化する革新 バルク合成堅牢な粒 径 2μm μ 以下のパーティクル最も いカラム効率 エンジニアリング UPLC カラムハードウェア超低バンド拡散 カラム充塡非常に安定なカラム充塡ベッド独自の充塡プロセス ソフトウェア ecord テクノロジーによりカラム履歴を電 的に管理 2014 Nihon Waters K.K. 19 パーティクルテクノロジープラットホーム BEH パーティクル Ethylene-Bridged Hybrid 125Å, 130Å, 200Å,300Å,450Å 1.7 µm for UPLC 2.5, 3.5, 5 and 10 µm for HPLC HSS パーティクル High Strength Silica 100Å 1.8 µm for UPLC 2.5, 3.5 and 5 µm for HPLC CSH パーティクル Charged Surface Hybrid 130Å 1.7 µm for UPLC 2.5, 3.5,5 and 10 µm for HPLC 業界最 レベルの化学的耐久性のためにデザイン 汎用カラムとして選択 比類ない範囲の移動相 ph 温度 圧 で使用可能 幅広いケミストリーラインアップ : 低分 用 6 種 バイオ医薬品用 8 種 XBridge HPLC カラムとシームレスな選択性 保持の向上および選択性のためにデザイン 極性化合物の保持向上 [HSS T3] 卓越したピーク形状 耐久性および保持 [HSS C18] 良好なピーク形状を維持した異なる選択性 [HSS C 18 SB, HSS Cyano, HSS PFP] XSelect HSS HPLC カラムとのシームレスな選択性 選択性およびサンプルローディング最大化のためにデザイン 塩基性化合物の卓越したピーク形状およびローデイングキャパシティ 独自のカラム選択性と業界最 レベルの ( バッチ間 ) 再現性を同時に達成 低 / ph における卓越した耐久性と速い平衡化 XSelect CSH HPLC カラムとのシームレスな選択性 2014 Nihon Waters K.K

11 増え続けるカラムラインアップ :UPLC カラム 7 種類のパーティクル基材 125Å, 130Å, 200Å, 300Å, 450Å BEH[ エチレン架橋型ハイブリッド ], HSS[High Strength Silica], CSH[Charged Surface Hybrid] 全てHPLCおよびUPLC 粒 径で販売 (SEC 用を除く ) 種類豊富でさらに増え続けるカラムケミストリー 16 種の固定相 o BEH 130Å C 18, C 8, Shield RP 18, Phenyl, HILIC, Amide o BEH 300Å C 18 and C 4 o HSS C 18, T3, C 18 SB, PFP, Cyano o CSH C 18, Fluoro-Phenyl, Phenyl-Hexyl 専用試験を ったアプリケーションベースのソリューション SEC, AAA, OST, PST, PrST and Glycan HPLC UPLC 間での分析法移管性 XBridge HPLC ACQUITY UPLC BEH カラム XSelect HSS HPLC ACQUITY UPLC HSS カラム XSelect CSH HPLC ACQUITY CSH カラム 専用ガードカラム :VanGuard ecordテクノロジー Launch Date 2014 Nihon Waters K.K. 21 全てシームレスに分析法移管が可能な 2 種類の LC カラムプラットホーム ph 耐久性のためにデザイン 最適化されたカラムファミリー 市場で最も MS- 適合性の高い HPLC カラム 選択性のためにデザイン 最適化されたカラムファミリー 多様なクロマトグラフィーの問題解決のための複数のパーティクル基材 1.7 [UPLC], 2.5, 3.5, 5, 10 µm 1.7 [UPLC], 2.5, 3.5, 5 µm CSH 1.8 [UPLC], 2.5, 3.5, 5 µm HSS 2014 Nihon Waters K.K

12 バンド拡散 ピーク さ 分離能 幅の狭いシャープなバンドを形成する LC システム ( カラムと装置 ) により幅が狭くシャープなピークが得られる この結果として分離度 ピーク さ 感度が向上する バンド拡散のより大きい LC システム バンド拡散のより小さい LC システム この領域では両分析種 ( と ) は分離していない ( 一部共溶出している部分は 紫 のバンドで示される ) より良好な分離より濃縮された バンド より い感度 2014 Nihon Waters K.K. 23 粒子径の さいカラムではバンド拡散がカラム効率に大きく影響 Effect of Particle Size and Band Spreading on Chromatographic Efficiency µm: -22% 1.7 µm, UPLC 1.7 µm, HPLC Efficiency (N) µm: -17% 2.5 µm, UPLC 2.5 µm, HPLC 5 µm, UPLC µm, HPLC µm: -9% 2.1 x 50 mm カラムバンド拡散は 5σ で測定 Retention Factor (k) 2014 Nihon Waters K.K

13 HPLC システムでの van Deemter プロット HETP vs. u (HPLC System) ACQUITY UPLC BEH C µm 2.5 µm HPLC Column HETP (µm) u (mm/s) 2 種類のカラムの性能は変わらないように える なにが起こっているのか? 2014 Nihon Waters K.K. 25 UPLC System での van Deemter プロットの測定 HETP (µm) HETP vs. u (ACQUITY UPLC System) HPLC システムの分析ではここまで ACQUITY UPLC BEH C µm 2.5 µm HPLC Column u (mm/s) ACQUITY UPLCシステムでは1.7 µm と2.5 µm の粒子径のカラムでははっきりと違いが られる 2014 Nihon Waters K.K

14 粒子径カラムへのシステム拡散の影響 HPLC 最適な線速度ではない 同じカラム 標準の UPLC 最適線速度 AU ACQUITY UPLC BEH C x 50 mm, 1.7 µm HPLC System F = 0.3 ml/min PSI MAX = 4,200 T (4) = 1.63 N (4) = 5,400 Rs (2,3) = 0.97 AU ACQUITY UPLC BEH C x 50 mm, 1.7 µm ACQUITY UPLC F = 0.6 ml/min PSI MAX = 8,400 T (4) = 1.02 N (4) = 10,100 Rs (2,3) = Minutes Minutes 2014 Nihon Waters K.K. 27 アジェンダ イントロダクション UPLC 分離を実現するテクノロジー 更なるカラム効率向上に向けて向 究極の理論段数を実現するカラムテクノロジー カラム効率向上による実用上の利点 UPLC HPLC 分析法移管性 UPLC10 周年 2014 Nihon Waters K.K

15 カラム粒子径と背圧との関係 Efficiency vs. Backpressure Comparisons 1.0 μm Efficiency (N/m) μm 1.8 μm 2.5 μm 3.5 μm 5.0 μm 10.0 μm 1.4 μm 15% 効率 40% 背圧 21% 効率 79% 背圧 70% 効率 390% 背圧 Backpressure (psi) Assume: 1) 100 mm length columns 2) P max at u opt 2014 Nihon Waters K.K. 3) ACN/H 2O Gradient, 40 o C 29 究極の理論段数の実現 CORTECS カラム 粒 径 1.6 μm ソリッドコアシリカパーティクルを採用した UPLC カラム 主な利点 : 最もカラム効率の い UPLC カラム (>35% vs 粒 径 2-µm 以下の全多孔性カラム ) 同等の背圧で性能の向上 スループットの向上 3 Chemistries: C 18 + C 18 HILIC 2014 Nihon Waters K.K

16 2014 R&D100 Award 受賞 2013 年に発表されたCORTECS 1.6μmカラムは 米国の技術情報誌である R&D Magazine が主催する2014 R&D 100 Awardを受賞しました R&D 100 Awardは R&D Magazine 社が過去 1 年間に実用化された優秀な製品 技術を 分離技術のみならず 広い分野から100 点選出するものです 1963 年から始まった歴史のある賞で Oscars of Innovation( 革新技術におけるオスカー ) と呼ばれるほど世界的に権威のある賞の一つです 2014 Nihon Waters K.K 年 5 月までは 2004 年以降 全多孔性 ACQUITY UPLC 1.7 µm BEH C 18 最もカラム効率の いパーティクルだった 粒 径 2 μm 以下のパーティクルおよびその効率を実現するのに必要なUPLCテクノロジーの開発への道を歩むこととなった Plates (4 sigma) 16,000 12,000 8,000 14,150 ACQUITY UPLC 1.7 µm BEH C 18 4, Flow Rate (ml/min) 2.1 x 50 mm column. A standard ACQUITY UPLC I-Class using 70% Acetonitrile in H 2 O at 30 with 0.5 µl injections from a 1 µl FL injector 2014 Nihon Waters K.K

17 しかしながら 2013 年 6 月以降は 20,000 19,700 39% いカラム効率 lates (4 sigma) P 16,000 12,000 8,000 14,150 または3 倍まで速い分析! CORTECS UPLC 1.6 µm C 18+ ACQUITY UPLC 1.7 µm BEH C 18 4, Flow Rate (ml/min) 2.1 x 50 mm column. A standard ACQUITY UPLC I-Class using 70% Acetonitrile in H 2 O at 30 with 0.5 µl injections from a 1 µl FL injector 2014 Nihon Waters K.K. 33 同様の背圧 14,000 12,000 CORTECS UPLC C µm ACQUITY UPLC BEH C µm Pressure (psi) 10,000 8,000 6,000 4,000 2, Flow Rate (ml/min) Conditions: Tested on an ACQUITY UPLC I-Class using 2.1 x 50 mm columns, 70% Acetonitrile at 30 C 2014 Nihon Waters K.K

18 CORTECS カラムによる効率の向上 2014 Nihon Waters K.K. 35 カラム効率向上による実 上の利点 効率分離の利点は : ピーク形状および分離能の向上 いサンプルスループットプット : o より速い流速で同等の分離または o より短いカラムで同等の分離 2014 Nihon Waters K.K

19 いカラム効率により得られるシャープなピーク い分離能局所 酔薬の例 Lidocaine 2. Butacaine 3. Tetracaine 4. Procaine 5. Procainamide ACQUITY BEH HILIC 2.1 x 50mm 1.7 µm AU 0.10 USP Resolution 2,3 : CORTECS UPLC HILIC 2.1 x 50 mm 1.6 µm AU 0.10 USP Resolution 2,3 : Minutes 2014 Nihon Waters K.K. 37 いスループット サルファ剤 : 流速を2 倍 AU Sulfathiazole 全多孔性カラムブランドB C 18 at 0.5 ml/min 2. Sulfamerazine 2.1 x 50 mm 1.8 µm Sulfamethazine Gradient time: 4.2 min 4. Sulfamethoxypyridazine Runtime: 6 min 5. Sulfachloropyridazine Sulfamethoxazole 5 P 7. Sulfasoxazole c = peaks per minute (gradient) 半分の時間で同等のピークキャパシティ (Pc) CORTECS UPLC C 18 + at 1.0 ml/min 2.1 x 50 mm 1.6 µm Gradient time: 2.1 min Runtime: 3 min P c = peaks per minute (gradient) 注 : 流速変更に従ってグラジエントも変更 2014 Nihon Waters K.K

20 いスループット サルファ剤 : 短いカラムを使 2.1 x 100 mm 1.7 µm カラムブランド A ソリッドコア C 18 Gradient time: 8.4 min Runtime: 12 min P c = peaks per minute (gradient) 2.1 x 50 mm 1.6 µm CORTECS UPLC C 18 + 半分の時間で同等のピークキャパシティ (Pc) Gradient time: 4.2min Runtime: 6 min P c = peaks per minute (gradient) 注 : カラム さ変更に従ってグラジエントも変更 2014 Nihon Waters K.K. 本比較試験結果は全てのアプリケーションを代表するものとは限りません 39 CORTECS 2.7 µm カラム 分析法移管 異なる粒 径間での正確な移管に向けた合成プロセス o Rho value が同じになるようにスケーリング UPLC HPLC o シームレスな分析法移管 o 将来の保証 1.6 µm UPLC 2.7 µm HPLC/UHPLC 2014 Nihon Waters K.K

21 CORTECS 2.7 µm カラム 2.7 µm ソリッドコアシリカパーティクルを採用した HPLC カラム 利点 HPLC に適した低いカラム背圧で いカラム効率カラム効率 o 分離 o スピード CORTECS 1.6μm との分析法移管性 (UPLC HPLC) 3 種類のケミストリー : C 18 + C 18 HILIC 9 月 5 日 ( ) JASIS2014 新技術説明会 10:30 10:55 A-5 既存 HPLC の分離 産性を最 化したい 必! 最新 2.7μm ソリッドコアカラム 2014 Nihon Waters K.K. 41 シームレスな分析法移管 AU CORTECS C 18, 2.7 µm 4.6 x 150 mm HPLC ml/min HPLC UPLC どちらにも対応 AU x 150 mm UPLC 1.51 ml/min AU x 75 mm UPLC 031mL/min 0.31 生産性を最大化するために UPLC に移管可能 AU CORTECS UPLC 1.6 µm C x 50 mm UPLC 0.53 ml/min 1. Epigallocatechin Catechin 3. Epicatechin Minutes 4. Gallocatechin 2014 Nihon Waters K.K

22 CORTECS C 18 + カラム 表面チャージテクノロジーを採用した差別化されたC 18 ケミストリー 他のソリッドコアパーティクルカラムに比べて いローディングキャパシティ LC/MSアプリケーションに最適 低イオン強度ギ酸移動相を いた塩基性化合物分析に最適 C Nihon Waters K.K. 43 不純物プロファイル ソリッドコアシリカC18 ブランドA 2.6 µm 3 x 50 mm Pressure: 3250 psi CORTECS C µm 3 x 50 mm Pressure: 2750 psi 2014 Nihon Waters K.K

23 アジェンダ イントロダクション UPLC 分離を実現するテクノロジー 更なるカラム効率向上に向けて向 UPLC10 周年 2014 Nihon Waters K.K. 45 UPLC10 周年 2014 Nihon Waters K.K

24 UPLC10 周年コスト削減事例 2014 Nihon Waters K.K. 47 UPLC 10 周年文献数の増加 2004 年から現在までの UPLC 使用文献 + 書籍数 *Science Direct により UPLC or ACQUITY で検索 年に 5 報だったものが,2013 年には年間 1934 報 2014 年は調査した 3 月 26 日の時点で 949 報あり,2004 年からの累計は 7131 報に達する 2014 Nihon Waters K.K

25 主な ACQUITY ファミリーラインアップ スタンダード UPLC ハイエンド UPLC 超 速 GPC 超 性能 SFC 体 分 分析用 UPLC ナノスケール UPLC ポータブル MS 検出器 UPLC 用フラクションコレクター 2014 Nihon Waters K.K. 49 ACQUITY ファミリー 2004 年最初の ACQUITY UPLC システム発売 超 耐圧のシステム システムに対応した検出器群 粒 径 1.7 µm のエチレン架橋型ハイブリッド [BEH] パーティクルのカラム 発売から 10 年を経て充実したラインアップ ACQUITY UPLC H-Class ( 汎用 分析法開発 ) ACQUITY UPLC H-Class bio ( 体 分 分析に適した流路 ) ACQUITY UPLC I-Class ( 究極の分離 超低拡散 ) ACQUITY UPC 2 ( 超 性能超臨界クロマトグラフィー ) ACQUITY APC ( 超 速 GPC) ACQUITY UPLC 2Dシリーズ (2 次元タイプ ) Open Architecture UPLC ( オープンアクセス環境 ) PATROL UPLC プロセスアナライザー ( プロセス制御 ) PATROL UPLC ラボアナライザー ( プロセス開発 ) ACQUITY UPLC M-Class ( ナノからマイクロスケール ) ACQUITY UPLC M-Class 2D ( ナノ2 次元 ) ACQUITY UPLC M-Class HDX (HDXタイプ) 28 種類のカラムケミストリー UPLC 検出器 TUV, PDA, PDA eλ, 蛍光, ELS, RI( 差屈折率 ) 各種質量分析計 2014 Nihon Waters K.K

26 まとめ イントロダクション UPLC 分離を実現するテクノロジー UPLC 分離を実現するカラムテクノロジー システムデザインの分離への影響 更なるカラム効率向上に向けて 究極の理論段数を実現するカラムテクノロジー カラム効率向上による実用上の利点 UPLC HPLC 分析法移管性 UPLC10 周年 2014 Nihon Waters K.K

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