2015.7.22 メディカルサイエンス推進研究所技術セミナー ゲノム編集技術が与える 医学へのインパクト 遺伝子改変マウス作製への応用を中心に メディカルサイエンス推進研究所遺伝子実験センター中島修 1
ゲノム編集は PCR 以来のゲームチェンジャー (game changer: 世論の動向を大きく変える出来事 ) 2 20 NATURE VOL 522 4 JUNE 2015
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本日のメニュー 1. ゲノム編集の原理 2. ゲノム編集の歴史と展望 3. マウス受精卵でのゲノム編集 4. ゲノム編集の遺伝子改変マウス作製への応用 5. 山形大学医学部遺伝子実験センターでのこれまでのゲノム編集による遺伝子改変マウスの作製の実際 6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受託作製の手順 5
ゲノム編集技術とは? ゲノム編集 (Genome Editing) とは 人工ヌクレアーゼの Zinc Finger Nucleases(ZFNs) や Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) CRISPR/Cas システムを用いてゲノム上の標的遺伝子の破壊やレポーター遺伝子のノックインなどを可能にする技術である (Joung and Sander, Nat Rev Mol Cell Biol, 2012; Barrangou, Nat Biotechnol, 2012) ゲノム編集コンソーシアムHPより http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/genome_editing/index.html 6
ゲノム編集で利用される人工ヌクレアーゼ 人工ヌクレアーゼ (ZFNやTALEN) は DNAに特異的に結合するドメインと 制限酵素 FokIのDNA 切断ドメインを連結させたキメラタンパク質である 2つの人工ヌクレアーゼが近接する標的配列に結合するとDNA 切断ドメインが2 量体となりDNAを切断する ZFN,TALEN ゲノム編集コンソーシアムHPより http://www.mls.sci.hiroshimau.ac.jp/smg/genome_editing/index.html 7 特異的に認識できる配列をデザインするには 何種類かの DNA 結合ドメインを適切に組み合わせた融合タンパク質をつくる必要があり 初心者は手を出しにくい系である
CRISPR/Cas システムとは? CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindro mic Repeat; クリスパー ) には多くのプロトスペーサー配列が含まれており この配列はウィルス ( ファージ ) ゲノムなどの種々の外来 DNA と相同性がある このプロトスペーサー配列をもった RNA が CAS(Crispr associated, an RNA-guided DNA endonuclease associated with the CRISPR) に結合して プラスミドやファージといった外来 DNA を識別するプローブとなって CRISPR/Cas が外来 DNA のみを切断させるため 細菌の獲得免疫として機能している 8
細菌ゲノム内 CRISPR が存在 CRISPR が転写され pre-crrna が出来る pre-crrna と tracrrna が Cas9 に結合し さらに RNaseIII が結合する RNaseIII が pre-crrna を切断して crrna:tracrrna:cas9 複合体を形成させる http://www.addgene.org/crispr/reference/history/ 9
http://www.addgene.org/crispr/reference/history/ PAM 配列が 3 側に存在する Protospacer 配列が標的 DNA となる Protospacer 配列が crrna と相補対を形成し Cas9 ヌクレアーゼが標的配列上位で 二本鎖切断 (DSB) を行う A programmable dual-rna-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21. DSB 10
非相同末端連結 nonhomologous endjoining による二本鎖切断の修復 偶発的な二本鎖切断 切断部位の末端をヌクレアーゼにより加工 DNA リガーゼにより末端を連結 二本鎖切断は修復されるが 修復部位でヌクレオチドの欠失が生じる Figure 6-27 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)
相同組換えによる二本鎖切断の修復 二本鎖切断 相同な DNA 二重らせん DNA が複製された直後に始まる 複製された 2 つの二本鎖が互いにまだ 近くにあるため 相同組換えは 様々な DNA 損傷に利用できる汎用的な修復機構 無傷の相同染色体があれば 可能 同一染色体は染色体複製のたびにつくられる 鎖の侵入 ヌクレアーゼによる 5 末端の消化 分岐点 DNA 合成と分岐点の移動 分岐点の移動と DNA 合成の進行 DNA 連結 Figure 6-29 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010) 二本鎖 DNA 切断は精確に修復される ( 欠失はない )
細胞の中で起こった DNA 二本鎖切断の 2 通りの修復 (NHEJ) (HR) 相同な DNA が存在する場合のみ起こる 二本鎖 DNA 切断 (DSB) 二本鎖 DNA 切断 (DSB) ヌクレアーゼにより 5 末端の一部が消化され削られる ヌクレアーゼにより 5 末端の一部が消化され削られる 相同染色体 (DNA) を鋳型にして修復される 相同染色体 小さい欠失等が生じる 相同染色体を使って欠失を起こさず修復 京都大 HP より 13
Non Homologous End Joining Repair http://www.addgene.org/crispr/guide/ 14
Homology Directed Recombinant Repair Single or double strand Donor DNA http://www.addgene.org/crispr/guide/ 15
1 本鎖ガイド RNA(sgRNA) による CRISPR/CAS9 システムの開発 細菌の CRISPR/CAS システムでは crrna と tracrrna の二種の RNA が Cas9 の遺伝子座へのターゲティングには必要であるが 1 本につなげたキメラ RNA(sgRNA) をデザインして sgrna と Cas9 の 2 者複合体でヌクレアーゼ活性を発揮させることが可能になった sgrna Science Vol. 337 pp. 820 (2012) 16
CRISPR/CAS9 システム用オールインワンベクター px330 U6: 全身性 U6 プロモーター U6 遺伝子はスプライソソームを構成する 5 つの核内低分子リボ核タンパク質 (snrnp) の一つ CBh: 全身性トリ β アクチンハイブリッドプロモーター 標的遺伝子座に対するガイドシークエンス 20bp をクローニングすると 目的の sgrna と Cas9 mrna を同時に発現させることが可能な 哺乳類細胞での発現ベクターとなる これを細胞の中に入れれば 二本鎖切断が起こせる http://www.addgene.org/ 17
CRISPR/CAS によるゲノム編集とはゲノムの任意の遺伝子座で 遺伝子破壊と任意の変異の導入 ( 編集 ) を行う技術 CRISPR/CAS により生じた二本鎖切断に対して 1. 非相同末端連結 Non Homologous End Joining (NHEJ) による修復が起こる場合 当該遺伝子で欠失が生じ exon 上で起こった場合はフレームシフト変異となる可能性が高いため 遺伝子破壊ができる 2. 人工的に任意の変異を導入した相同遺伝子断片 ( ドナー DNA) を修復時に同時に存在させた時に 相同組換え修復 Homologous Recombinant Repair (HRR) による修復が起こる場合 当該遺伝子には ドナー DNAに由来する変異が導入される ( 編集される ) 18
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Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M. & Nakata, A. J. Bacteriol. 169,5429 5433 (1987). 20 NATURE VOL 522 4 JUNE 2015 20
Jinek, M. et al. Science 337, 816 821 (2012). 20 NATURE VOL 522 4 JUNE 2015 21
欠失が多いが小さな置換なども起こりうる 点変異や短い配列の挿入を起こす場合は 1 本鎖 DNA でも可能 点変異導入や元々ない配列の挿入が可能 22 タカラバイオHPより
CRISPR/Cas9 の応用 ヌクレアーゼ活性を持たない Dead Cas 転写制御エピゲノム修飾イメージング 染色体レベルでの遺伝子改変 23
https://en.wiki pedia.org/wiki/ Epigenome_edi ting 24
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CRISPR Gene drive Oye, K. A. et al. Science 345, 626 628 (2014). 26
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ヒト胚 ( ただし 前核が 3 つある異常受精卵 ) に対する CRISPR/Cas9 を介したゲノム編集 28
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Cell Cycle Ahead of Print DOI: 10.1080/15384101.2015.1046791 ヒト幹細胞でのゲノム編集による HIV に対する遺伝子治療 CCR5 found on the surface of white blood cells acts as a coreceptor for HIV entry to the host cells.
筋ジストロフィ患者由来 ips に対する ゲノム編集による遺伝子治療 Stem Cell Reports Vol. 4,143 154, January 13, 2015
Stem Cell Reports Vol. 4, 143 154, 2015
ゲノム編集によるヒト胚に対する遺伝子治療の論点 精確さ inaccurate editing and off-target( 二本鎖切断が起こる目的外遺伝子座 ) mutations Monogenic disease such as Huntington s disease 胚に対するゲノム編集は現実的に困難 IVF embryos using preimplantation genetic diagnosis (PGD) PGD による胚の選別による代替可能なケースが多い ホモ接合体の胚 ( 例 : 同一遺伝子変異の聾者同士の胚 ) の場合はPGD 代替不可 Reducing the risk of common diseases like APOE ε4 variant (Alzheimer s disease and cardiovascular disease), PCSK9 (myocardial infraction) From Eric S. Lander. "Brave New Genome." N. Engl. J. Med. Published online 2015 June 3 33
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マウス受精卵でのゲノム編集の報告 Cell. 2013 May 9; 153(4): 910 918. 35
A ES 細胞での 5 重遺伝子破壊クローンの作成 B マウス受精卵での二重遺伝子破壊マウスの作製 マウス受精卵での二重相同組み換え体の作製 Cell. 2013 May 9; 153(4): 910 918. 36
Ten-eleven translocation family members Tet1, Tet2, Tet3 での標的配列 エキソン内にある制限酵素サイトを切断するデザイン Cell. 2013 May 9; 153(4): 910 918. 37
一組の CRISPR/CAS9 mrna のマウス受精卵細胞質へのマイクロインジェクションにより変異遺伝子座 ( 切断 非相同末端連結による欠失 ) のホモ接合体が高確率で作出 70~90% の産子はホモ接合体 Cell. 2013 May 9; 153(4): 910 918. 38
制限酵素サイトが無くなるので 検出される断片が長くなる バンドが 1 本なのでホモが多い 実際に出来る変異遺伝子座は数 bp~ 数十 bp の欠失が多いが 挿入の場合もある 39
二種の CRISPR/CAS9 mrna のマウス受精卵前核へのマイクロインジェクションによる二重遺伝子破壊マウスの作出 Cell. 2013 May 9; 153(4): 910 918. 40
二種の CRISPR/CAS9 mrna 1 本鎖ドナー DNA のマウス受精卵前核へのマイクロインジェクションによる二重 2 塩基変異導入マウスの作出 Cell. 2013 May 9; 153(4): 910 918. 相同組換えと欠失のヘテロ 相同組換えのホモ 相同組換えと欠失のヘテロ 相同組換えと欠失のヘテロ 41
大阪大学微生物病研究所伊川正人先生のプロトコール http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/crispr デザイン法 20131219.pdf 42
http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/crispr デザイン法 20131219.pdf 43
Single Strand Annealing http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/crispr デザイン法 20131219.pdf 44
http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/crispr デザイン法 20131219.pdf 45
CRISPR/Cas9 プラスミドベクターの C57BL/6J マウス受精卵への導入 CRISPR/Cas9 vector U6 target grna CBh Flag-NLS-hSpCas9-NLS pa px330 Donor oligo 環状の CRISPR/Cas9 vector と donor oligo DNA を導入問題点 : ベクターのゲノム挿入が起こりうる RNA インジェクションではこの点は回避できる 筑波大学基礎医学系高橋智教授 H26 山形大学大学院講義資料より一部改変
NHEJ: 非相同末端連結 HR: 相同組換え修復 熊本大 HP より
CRISPR/CAS による個体でのゲノム編集の利点 汎用性が高く 簡便で低コスト ( ZFN TALEN, ES 細胞 ) 受精卵が得られればどんな生物種でも可能 ( 実施例 : ラット ウサギ 豚 ゼブラフィッシュ アクソロートル サル ) もちろん マウス系統も C57BL/6 に限らない 遺伝子改変マウスが比較的短期間で作出可能 多重遺伝子破壊が簡便にできる 1 回の実験でホモ変異体の作出が期待できる ( 交配不要 ) 単純遺伝子破壊のみならず ドナー DNA 次第で様々な遺伝子改変が可能 48
Off-target 問題 Few studies using whole genome analysis already showed that the mutation rates induced with Cas9 endonucleases are not systematically higher than spontaneous (non-induced) natural mutations Off-target remains ultimately much less critical for mice as for human genome engineering, as it is easily diluted out amongst generations Delerue and Ittner, Clon Transgen 2015, 4:1 http://dx.doi.org/10.4172/2168-9849.1000135 49
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筋ジストロフィーマウス受精卵に対する CRISPR/Cas9 を介したゲノム編集による 産子における筋ジストロフィ 発症予防 Science 5 SEPTEMBER 2014 VOL 345, 1184-118851
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ゲノム編集マウスでのジストロフィンタンパク質発現の回復 54
ゲノム編集マウスでの血清クレアチンキナーゼの低下と前足握力の回復 Science 5 SEPTEMBER 2014 VOL 345, 1184-1188 55
成体遺伝性チロシン血症マウスに対する sgrna/cas9mrna/donor DNA 尾静注による治療 ( 肝機能の回復 ) fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) Fah: フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ遺伝子 Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):551-3. 56
成体遺伝性チロシン血症マウスに対する sgrna/cas9mrna/donor DNA 尾静注による治療 ( 肝機能の回復 ) Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):551-3. 57
Rosa locus( すべての組織で発現 ) への Cas9 Knock-in マウスの確立とがん抑制遺伝子を標的とする sgrna のウィルスベクターによる導入 Cell 159, 440 455, October 9, 2014 58
Rosa26 領域 Rosa26 領域に β ガラクトシダーゼ遺伝子が挿入されたマウスの系統は全身すべての細胞が X-gal 染色陽性となるため, 移植実験のコントロールとしてきわめて有用であった. さらに β ガラクトシダーゼ遺伝子を他のマーカー遺伝子と置換しても全身にマーカーを発現されることが可能で, レポーターコンストラクトの挿入に頻用されているすなわち どの組織でも発現するということは 組織特異的なエピジェネティックな抑制制御を受けない遺伝子座といえる https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/keyword/474.html Schematic of the Cre-dependent Cas9 Rosa26 targeting vector Cre により この領域が欠失すると Cas9 が発現する Cell 159, 440 455, October 9, 2014 59
In Vivo Genome Editing in the Brain of Cre- Dependent Cas9 Mice Cell 159, 440 455, October 9, 2014 60
本日のメニュー 1. ゲノム編集の原理 2. ゲノム編集の歴史と展望 3. マウス受精卵でのゲノム編集 4. ゲノム編集の遺伝子改変マウス作製への応用 5. 山形大学医学部遺伝子実験センターでのこれまでのゲノム編集による遺伝子改変マウスの作製の実際 6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受託作製の手順 61
遺伝子実験センターでは組換え実験を省略するため crrna/tracrrna/cas9 のシステムを利用 ( crrna/tracrrna/cas9 mrna を co-injection) 42nt 個別の実験でデザインする 75nt 共通で使える sgrna 101nt 1 本につなげたキメラ RNA(sgRNA) をオリゴハウスで RNA 合成するには 長すぎるため 組換え実験が必要となる Science Vol. 337 pp. 820 (2012) 62
遺伝子実験センターでのゲノム編集マウス受託作製の手順 1. 依頼者 : ガイド RNA(crRNA) の配列のデザイン 2. 依頼者 : オリゴ RNA/ ドナー DNA の注文 3. センター : ガイド RNA(crRNA) を介した DNA 切断活性の in vitro での確認 4. センター : マウス受精卵前核への CRISPR/CAS9 mrna, ss donordna の導入 5. 依頼者 : ゲノム解析による変異個体の確認 63
1.1 ガイド RNA(crRNA) の配列のデザイン 標的配列は PAM 配列 (NGG) の上流 (5 側 ) に 20nt を設定する DSB は PAM 上流 3bp で起こる ( 図 ) ガイド RNA の配列決定には Off-Target( 目的外の遺伝子座 ) での切断の可能性の排除と PAM 配列の検索のため http://crispr.dbcls.jp/ などで配列候補を検索する 20nt 標的配列 PAM 切断個所 (PAMより3nt 上流 ) 5 -TGTATGAGACCACNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNAGG-3 3 -ACATACTCTCCTGNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNTCC-5 64
http://crispr.dbcls.jp/ 65
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1.2 ガイド RNA(crRNA) の配列のデザイン crrna 配列は検索した 20nt(PAM 配列は除く ) の 3 側に GuuuuaGAgcuaugcuguuuUG を付加した 42nt RNA( 図 ) となる ただし 点変異を導入する場合 切断個所は点変異導入箇所により近い方が好ましいため 候補が限られる tracrrna はセンター側で用意したものを実験に用いる crrna 配列 42nt RNA 5 -XXXXXXXXXXXXXXXXXGuuuuaGAgcuaugcuguuuUG PAM 配列を除いた 20nt を 22nt につなげる tracrrna 75nt RNA 5 -aaacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggu gcuuuuuuu 68
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2. オリゴ RNA/DNA の注文 1. でデザインした crrna(42mer) を依頼者が注文する ドナー DNA を利用する場合 変異導入塩基の両側 45nt ずつの相同領域を含む 1 本鎖オリゴ DNA(~90mer) を設計し ( 図 ) センターでの切断活性試験の結果をみてから注文する ( 切断活性が無い場合は crrna デザインを変更した方が良い場合があるため ) 現時点で crrna(hplc 精製グレード ) は株式会社ジーンデザイン URL: http://www.genedesign.co.jp/ で ドナー DNA(PAGE 精製グレード ) は IDT URL https://sg.idtdna.com/site ( 日本代理店 MBL) で合成されたもので実験可能なことを確認している 実績があれば オリゴハウスはどこでも可 1 本鎖ドナー DNA 45nt+Mutation+45nt 5 -XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX M XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX loxp など短い配列 (40~50nt) を挿入する場合 相同領域として 前後に >60nt ずつ繋 げる 73
3. ガイド RNA(crRNA) を介した DNA 切断活性の in vitro での確認 依頼者は 2. の crrna と増幅した標的遺伝子座の PCR 産物を遺伝子実験センターに送付する 遺伝子実験センターにおいて これらに CAS9 タンパク質, tracrrna を加え 37 でインキュベート後 電気泳動により二本鎖切断反応が in vitro で起こることを確認する ( 図 ) 切断が確認されない場合は crrna の塩基配列の再検討を行う (-) Int3/int5 Int3 Int5 19.3kb 7.7kb 6.2kb 4.3kb 3.5kb 2.7kb 1.9kb 0.9kb 0.4kb
4. マウス受精卵前核への CRISPR/CAS ベクターの導入 依頼者から送られた crrna, ドナー DNA に tracrrna, Cas9 mrna を加えた混合液を 遺伝子実験センターにおいて C57BL/6 受精卵前核へ導入する C57BL/6 以外の受精卵で行う場合は要相談 伊川正人領域融合レビュー, 3, e008 (2014) より 5. ゲノム解析による変異個体の確認 産子の尾を依頼者に送付する ゲノムDNAを抽出し PCRによる標的遺伝子領域の増幅後 制限酵素処理や塩基配列解析 電気泳動などにより 標的遺伝子座での変異を 依頼者が確認す 75 る 変異のある個体を 遺伝子実験センターから依頼者へ譲渡する
マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法エレクトロポーレーションによる受精卵への遺伝子導入 Scientific Reports 5:11315 DOI: 10.1038/srep11315 76
マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法エレクトロポーレーションによる受精卵への遺伝子導入 Scientific Reports 5:11315 DOI: 10.1038/srep11315 77
マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法卵管でのエレクトロポーレーションによる遺伝子導入 Scientific Reports 5:11406 DOI: 10.1038/srep11406 78
マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法卵管でのエレクトロポーレーションによる遺伝子導入 Scientific Reports 5:11406 DOI: 10.1038/srep11406 79
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ゲノム編集受託作製負担金は 1 系統 40 万円 ( ただし 学内は 35 万円 ) を予定して 学内規則を策定しました 81